王虹懿 唐敏敏 吳海虹 諸永志 劉芳 孫芝蘭 徐為民 彭景

摘 要：熒光假單胞菌是引起冷鮮雞肉腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，可降解肉品中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，產(chǎn)生多種腐敗代謝產(chǎn)物，進(jìn)而使肉類食品風(fēng)味和品質(zhì)發(fā)生劣變。采用體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究綠原酸（chlorogenic acid，CA）、Ⅲ型細(xì)菌素Helveticin-M及二者復(fù)配對(duì)熒光假單胞菌的抑菌效果;通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察不同處理對(duì)熒光假單胞菌外部形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察、測(cè)定胞外ATP含量、胞外蛋白和核酸外滲，研究CA或Helveticin-M對(duì)指示菌細(xì)胞膜滲透性的影響。結(jié)果表明：與CA或Helveticin-M單獨(dú)作用相比，二者復(fù)配后抑菌作用顯著增強(qiáng)（P<0.05）;綠原酸與Helveticin-M復(fù)配處理可顯著破壞熒光假單胞菌形態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞膜滲透性，加劇胞內(nèi)物質(zhì)外泄，最終加速熒光假單胞菌死亡。

關(guān)鍵詞：綠原酸;Ⅲ型細(xì)菌素Helveticin-M;熒光假單胞菌;抑菌機(jī)制

Abstract： Pseudomonas fluorescein is the dominant spoilage bacterium in chilled fresh chicken， which can degrade protein， fat and other substances in meat， producing a variety of spoilage metabolites， which deteriorate the flavor and quality of meat. The objective of this study was to explore the antimicrobial effect of Helveticin-M， a class Ⅲ bacteriocin and/or chlorogenic acid （CA） against Pseudomonas fluorescens by in vitro experiments. The morphological structure of Pseudomonas fluorescens was observed by a scanning electron microscope （SEM）. To evaluate the effect of Helveticin-M and CA on the cell membrane permeability of the indicator strain， confocal laser scanning micrographs （CLSM） were recorded and extracellular ATP and protein contents as well as leakage of ultraviolet absorbing substances were measured. The results showed that the combined antibacterial effect of Helveticin-M and CA was markedly increased compared with either agent alone?（P < 0.05）. Furthermore， the combined treatment significantly damaged the morphology of Pseudomonas fluorescens， increased the membrane permeability， promoted the leakage of intracellular substances， and finally accelerated cell death.

Keywords： chlorogenic acid; Helveticin-M （a class Ⅲ bacteriocin）; Pseudomonas fluorescens; antimicrobial mechanism

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191009-235

中圖分類號(hào)：TS201.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）02-0001-06

引文格式：

王虹懿， 唐敏敏， 吳海虹， 等. 綠原酸與Ⅲ型細(xì)菌素復(fù)配對(duì)雞肉中假單胞菌的抑菌機(jī)制[J]. 肉類研究， 2020， 34（2）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191009-235.? ? http：//www.rlyj.net.cn

WANG Hongyi， TANG Minmin， WU Haihong， et al. Antibacterial effect and mechanism of chlorogenic acid combined with class Ⅲ bacteriocin on Pseudomonas fluorescens in chicken[J]. Meat Research， 2020， 34（2）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191009-235.? ? http：//www.rlyj.net.cn

雞肉是人類日常膳食中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一，營(yíng)養(yǎng)十分豐富，但其高營(yíng)養(yǎng)成分和高水分活度使其在加工、運(yùn)輸、貯藏、銷售等過(guò)程中極易腐敗變質(zhì)，品質(zhì)迅速下降，影響其營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味[1]。而致腐微生物的生長(zhǎng)是引起肉品腐敗變質(zhì)最重要的原因，其中假單胞菌通常被鑒定為肉類優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一，假單胞菌在冷鮮肉中的生長(zhǎng)速率比其他細(xì)菌快1/3左右[2-3]。熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）為假單胞菌屬嗜冷革蘭氏陰性菌，能夠在低溫環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖，是引起低溫貯藏條件下高蛋白和高脂肪食品腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌群[4-5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌可形成對(duì)抑菌劑耐受性更強(qiáng)的生物膜結(jié)構(gòu)[6]，大大增加了肉品保存難度。然而，近年來(lái)化學(xué)抗菌劑的濫用導(dǎo)致眾多食品安全事件，引起更多重視，因此開發(fā)研究新型天然防腐劑顯得尤為重要。

目前已從中草藥、果蔬、野生植物中分離出具有抗氧化活性、抑菌或殺菌活性的天然植物源防腐劑，如廣泛存在于草本植物中的多酚類物質(zhì)，其酚氧化程度越高，對(duì)微生物的抑制作用越強(qiáng)[7-8]，將其應(yīng)用在肉制品貯藏與保鮮中有延長(zhǎng)肉品保質(zhì)期的作用。綠原酸（chlorogenic acid，CA）是主要從杜仲科植物中提取出來(lái)的多酚類化合物[9]，是具有生物抑菌活性的天然植物源抑菌劑[10]。研究發(fā)現(xiàn)，CA對(duì)銅綠假單胞菌[11]、大腸桿菌[12]、金黃色葡萄球菌[13-14]等均具有良好的抑制作用。

本課題組前期通過(guò)異源表達(dá)及提取純化方法獲得高純度的Ⅲ型細(xì)菌素Helveticin-M，并分析了該細(xì)菌素的抗菌活性和作用機(jī)理，但是Helveticin-M仍存在抑菌活性較低的問(wèn)題。研究表明，將2 種抗菌性能互補(bǔ)的抗菌物質(zhì)聯(lián)合使用時(shí)二者的抗菌活性可顯著增強(qiáng)[15]。例如，將聚賴氨酸與乳酸鏈球菌素在酸性條件下協(xié)同使用不僅降低了單獨(dú)使用量，而且能夠更加高效地抑制腐敗菌生長(zhǎng)[16]。

本研究將CA和Helveticin-M復(fù)配使用，對(duì)二者抑制

P. fluorescens的效果及協(xié)同抑菌機(jī)理進(jìn)行深入研究，為CA聯(lián)合Helveticin-M應(yīng)用于P. fluorescens的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)菌素Helveticin-M 本課題組前期從大腸桿菌中表達(dá)分離純化;供試菌株（P. fluorescens） 本課題組自主從冷鮮雞肉中分離篩選得到;CA（杜仲提取物，純度98%） 陜西慧科植物開發(fā)有限公司;LIVE/DEADTM BacLightTM熒光染色試劑盒 美國(guó)Invitrogen公司;增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY5002電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;UniCenMR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Herolab公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Gen5全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司;Ultra View VOX激光掃描共聚焦顯微鏡 美國(guó)珀金埃爾默公司;EVO-LS10掃描電子顯微鏡 德國(guó)Carl Zeiss公司;SW-CJ-1FD無(wú)菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌素Helveticin-M的克隆表達(dá)與純化參照文獻(xiàn)[17]。

1.3.2 細(xì)菌生長(zhǎng)情況測(cè)定

將過(guò)夜活化2 次的P. fluorescens以體積比2%的接種量接入LB培養(yǎng)基中，分別添加終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的CA、200 μg/mL Helveticin-M以及二者的混合物

（2.5 mg/mL CA+200 μg/mL Helveticin-M），添加相同體積的0.01 mmol/L PBS作為空白對(duì)照組，置于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。每隔1 h測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處光密度（optical density，OD600 nm），繪制生長(zhǎng)曲線，分析P. fluorescens經(jīng)不同處理后的生長(zhǎng)情況。

1.3.3 CA與Helveticin-M對(duì)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的影響

采用掃描電鏡法觀察P. fluorescens經(jīng)不同處理后細(xì)胞外部形態(tài)的變化。將過(guò)夜活化2 次的P. fluorescens以接種量2%接入LB培養(yǎng)基中，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，8 000 r/min離心10 min，用PBS洗滌重懸，制成107 CFU/mL的菌懸液;將菌懸液分裝，分別加入終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的CA、200 μg/mL的Helveticin-M及二者復(fù)配溶液，加入相同體積PBS為空白對(duì)照，于30 ℃、200 r/min處理3 h后，6 000 r/min離心10 min，用PBS沖洗后在體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中固定，2 500 r/min、4 ℃離心10 min，加入1 mL超純水，放置10 min后再次離心，重復(fù)3 次，將樣品分別用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%的乙醇溶液按順序依次洗脫，每次放置15 min，離心，加入100%乙醇后放置30 min，最后將菌泥固定于鏡片上，在通風(fēng)櫥中風(fēng)干、噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察菌體形態(tài)變化[18-20]。

1.3.4 CA與Helveticin-M對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性的影響

1.3.4.1 激光共聚焦顯微鏡觀察

利用LIVE/DEAD試劑盒中的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料和SYTO-9染料進(jìn)行活/死菌標(biāo)記。按照1.3.3節(jié)中的方法制備菌懸液，并分組處理3 h。分別取菌懸液100 μL于10 000 r/min離心2 min，重懸在100 μL PBS中，加入LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒中的熒光染料各3 μL進(jìn)行染色，37 ℃黑暗條件下孵育30 min后離心，用PBS沖洗3 次，最終用200 μL PBS重懸菌體;吸取2 μL菌懸液于載玻片，觀察并拍照[21]。

1.3.4.2 胞外ATP含量測(cè)定

取1.3.4.1節(jié)所述處理后的菌懸液于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)0、30、60、90、120、180 min后12 000 r/min離心，取上清液置于冰上待用。采用熒光標(biāo)記法，具體操作步驟參照增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，用酶標(biāo)儀通過(guò)檢測(cè)熒光值確定ATP含量。

1.3.4.3 胞外蛋白質(zhì)量濃度及核酸水平測(cè)定

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P. fluorescens菌體沉淀，用5 mL PBS洗滌3 次，最后用5 mL PBS重懸制成菌懸液，將菌懸液分裝為4 份，分別加入終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的CA、200 μg/mL的Helveticin-M和二者復(fù)配溶液，添加相同體積的PBS作為空白對(duì)照，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、12 h取樣，菌懸液8 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，用考馬斯亮藍(lán)法通過(guò)檢測(cè)595 nm波長(zhǎng)處的吸光度對(duì)樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定（添加Helveticin-M的樣品需設(shè)置空白對(duì)照扣除蛋白質(zhì)本底）[22]。核酸在260 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)的吸收值，因此通過(guò)測(cè)定260 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A260 nm）來(lái)推測(cè)胞外核酸水平的變化[23]。

3 結(jié) 論

為探究CA與Helveticin-M復(fù)配作用后對(duì)P. fluorescens的抑菌效果及損傷機(jī)理，研究不同處理對(duì)P. fluorescens生長(zhǎng)情況、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜滲透性的影響。結(jié)果表明：與CA或Helveticin-M各自單獨(dú)作用相比，CA和Helveticin-M復(fù)配處理對(duì)P. fluorescens的抑菌效果最為顯著，通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，P. fluorescens菌體形態(tài)受損最為嚴(yán)重，胞體扭曲凹陷甚至瓦解;由于CA與Helveticin-M互補(bǔ)作用于菌體細(xì)胞膜，細(xì)胞膜完整性遭到破壞，進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞膜的滲透性，加劇誘導(dǎo)胞內(nèi)ATP、蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)的外泄，隨著胞內(nèi)物質(zhì)釋放，菌體細(xì)胞逐漸裂解，最終抑制P. fluorescens的正常生長(zhǎng)代謝。

本研究采用抑菌劑復(fù)配作用于P. fluorescens，既降低了抑菌劑的最低有效劑量，又顯著增強(qiáng)了抑菌效果，為天然防腐劑在肉品保鮮貯藏中的應(yīng)用提供了理論支撐。目前，已有許多研究表明，不同抑菌物質(zhì)聯(lián)合作用時(shí)抗菌活性顯著增強(qiáng)，但其抑菌機(jī)制尚未明了。本研究初步闡明CA與Helveticin-M對(duì)P. fluorescens的作用機(jī)制，但研究局限于純菌條件下的影響，未來(lái)的研究期望能夠進(jìn)一步詳細(xì)研究其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌的作用機(jī)制，擴(kuò)大其在食品中的應(yīng)用范圍。

參考文獻(xiàn)：

[1] ANANG D M， RUSUL G， BAKAR J， et al. Effects of lactic acid and lauricidin on the survival of Listeria monocytogenes， Salmonella enteritidis and Escherichia coli O157：H7 in chicken breast stored at 4 ℃[J]. Food Control， 2007， 18（8）： 961-969. DOI：10.1016/j.foodcont.2006.05.015.

[2] KIM J S. The inhibitory effect of natural bioactives on the growth of pathogenic bacteria[J]. Nutrition Research and Practice， 2007， 1（4）： 273-278. DOI：10.4162/nrp.2007.1.4.273.

[3] 章彬. 冷鮮雞加工及貯藏過(guò)程中的微生物調(diào)查及氣調(diào)保鮮技術(shù)應(yīng)用研究[D]. 揚(yáng)州： 揚(yáng)州大學(xué)， 2017： 1-3.

[4] OLANYA O M， UKUKU D O， NIEMIRA B A. Effects of temperatures and storage time on resting populations of Escherichia coli O157：H7 and Pseudomonas fluorescens in vitro[J]. Food Control， 2014， 39（1）： 128-134. DOI：10.1016/j.foodcont.2013.11.006.

[5] 張秋勤. 生鮮雞肉中腐敗菌群體感應(yīng)信號(hào)分子研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014： 1-2.

[6] 孫曉佳， 李婷婷， 赫彬彬， 等. 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌群體感應(yīng)現(xiàn)象及其腐敗活性的抑制作用[J]. 食品科學(xué)， 2019， 40（11）： 7-13. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20180510-163.

[7] 張海玲. 植物源天然防腐劑來(lái)源及其抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 45（33）： 76-78; 80. DOI：10.13989/j.cnki.0517-6611.2017.33.025.

[8] SCALBERT A. Antimicrobial properties of tannins[J]. Phytochemistry， 1991， 30（12）： 3875-3883. DOI：10.1016/0031-9422（91）83426-l.

[9] LOU Zaixiang， WANG Hongxin， ZHU Song， et al. Antibacterial activity and mechanism of action of chlorogenic acid[J]. Journal of Food Science， 2011， 76（6）： M398-M403. DOI：10.1111/j.1750-3841.2011.02213.x.

[10] SUN Zhilan， WANG Xiaomeng， ZHANG Xinxiao， et al. Class III bacteriocin Helveticin-M causes sublethal damage on target cells through impairment of cell wall and membrane[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，? 2018， 45（3）： 213-227. DOI：10.1007/s10295-018-2008-6.

[11] 蘇萌萌， 孫芝蘭， 劉芳， 等. 綠原酸對(duì)雞肉腐敗菌的抑菌機(jī)理[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2018， 34（6）： 1386-1391. DOI：10.3969/j.issn.1000-4440.2018.06.026.

[12] 屈景年， 莫運(yùn)春， 劉夢(mèng)琴， 等. 金銀花中綠原酸一步提取法及綠原酸抗菌活性[J]. 化學(xué)世界， 2005， 46（3）： 167-169. DOI：10.19500/j.cnki.0367-6358.2005.03.012.

[13] GOULAS V， EXARCHOU V， KANETIS L， et al. Evaluation of the phytochemical content， antioxidant activity and antimicrobial properties of mountain tea （Sideritis syriaca） decoction[J]. Journal of Functional Foods， 2014， 6： 248-258. DOI：10.1016/j.jff.2013.10.014.

[14] 伊文君. 杜仲葉提取物中綠原酸的純化及其體外抑菌效果的研究[D]. 大慶： 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)， 2014： 29-33.

[15] 劉喚明， 張文滔， 吳燕燕， 等. 脂肽和茶多酚對(duì)副溶血弧菌的協(xié)同抑菌效應(yīng)和機(jī)理[J]. 食品科學(xué)， 2017， 38（13）： 14-19. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201713003.

[16] BADAOUI N M， KASHTANOV D， CHIKINDAS M L. Epsilon-poly-L-lysine and nisin A act synergistically against Gram-positive food-borne pathogens Bacillus cereus and Listeria monocytogenes[J]. Letters Applied Microbiology， 2007， 45（1）： 13-18. DOI：10.1111/j.1472-765X.2007.02157.x.

[17] 王筱夢(mèng). 細(xì)菌素Helveticin-M對(duì)熟制羊肉腐敗菌的抑菌作用及其機(jī)理研究[D]. 南京： 南京師范大學(xué)， 2017： 27-33.

[18] LOU Miaomiao， ZHU Bo， MUHAMMAD I， et al. Antibacterial activity and mechanism of action of chitosan solutions against apricot fruit rot pathogen Burkholderia seminalis[J]. Carbohydrate Research， 2011， 346（11）： 1294-1301. DOI：10.1016/j.carres.2011.04.042.

[19] LI Yingqiu， HAN Qing， FENG Jianling， et al. Antibacterial characteristics and mechanisms of ?-poly-lysine against Escherichia coli and Staphylococcus aureus[J]. Food Control， 2014， 43： 22-27. DOI：10.1016/j.foodcont.2014.02.023.

[20] 李光輝， 郭衛(wèi)蕓， 高雪麗， 等. 安石榴苷和綠原酸對(duì)金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑制作用及機(jī)理研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2018， 39（10）： 17-21. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2018.10.004.

[21] 劉梅. Nisin與聚賴氨酸協(xié)同對(duì)腐敗菌的抑制效果及在雞胸肉中的應(yīng)用[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016： 12-13.

[22] 張志濤， 劉金生， 許強(qiáng)， 等. Bradford法測(cè)定牛奶中蛋白質(zhì)含量[J]. 食品與機(jī)械， 2011， 27（5）： 128-130. DOI：10.3969/j.issn.1003-5788.2011.05.033.

[23] 李世超， 方華， 朱校適. 嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的生物學(xué)特性及抑菌機(jī)制研究[J]. 飼料研究， 2017（11）： 20-26. DOI：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2017.11.007.

[24] TAO Rui， TONG Zhongchun， LIN Yuan， et al. Antimicrobial and antibiofilm activity of pleurocidin against cariogenic microorganisms[J]. Peptides， 2011， 32（8）： 1748-1754. DOI：10.1016/j.peptides.2011.06.008.

[25] QIAN Liying， XIAO Huining， ZHAO Guanlei， et al. Synthesis of modified guanidine-based polymers and their antimicrobial activities revealed by AFM and CLSM[J]. ACS Applied Materials and Interfaces， 2011， 3（6）： 1895-1901. DOI：10.1021/am200094u.

[26] 杜賀超， 李秀秀， 陸兆新， 等. Plantaricin 163對(duì)熱殺索絲菌的抗菌活性及其作用機(jī)制[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2018， 45（11）： 136-145. DOI：10.13344/j.microbiol.china.171049.

[27] 劉國(guó)榮， 李雪， 王成濤. 雙歧桿菌細(xì)菌素bifidocin A對(duì)大腸桿菌細(xì)胞總蛋白表達(dá)的影響[J]. 食品科學(xué)， 2018， 39（14）： 85-90. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201814013.

[28] WANG Yao， QIN Yuxuan， ZHANG Ying， et al. Antibacterial mechanism of plantaricin LPL-1， a novel class IIa bacteriocin against Listeria monocytogenes[J]. Food Control， 2019， 97： 87-93. DOI：10.1016/j.foodcont.2018.10.025.

[29] BENDALI F， GAILLARD-MARTINIE B， HEBRAUD M， et al. Kinetic of production and mode of action of the Lactobacillus paracasei subsp. paracasei anti-listerial bacteriocin， an Algerian isolate[J]. LWT-Food Science and Technology， 2008， 41（10）： 1784-1792. DOI：10.1016/j.lwt.2008.02.010.

[30] TEETHAISONG Y， AUTARKOOL N， SIRICHAIWETCHAKOON K，

et al. Synergistic activity and mechanism of action of Stephania suberosa Forman extract and ampicillin combination against ampicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. Journal of Biomedical Science， 2014， 21（1）： 90. DOI：10.1186/s12929-014-0090-2.