劉玲，許婷婷，趙薪程，劉海燕，戴慧芳，楊俊文，汪承潤,*

1. 淮南師范學(xué)院生物工程學(xué)院，淮南 232038 2. 資源與環(huán)境生物技術(shù)安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淮南 232038

碳納米管(CNTs)是一種具有特殊結(jié)構(gòu)的量子材料[1]，具有吸附性能好、催化能力強(qiáng)和熱穩(wěn)定性高等優(yōu)良特性[2]。依據(jù)其所含石墨烯片的層數(shù)可分為單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)。相對于SWCNTs，MWCNTs易于生產(chǎn)且成本較低，已逐漸成為化學(xué)、食品和生物等領(lǐng)域中的研究重點(diǎn)。但由于MWCNTs表面缺少活性基團(tuán)，在范德華力的作用下極易團(tuán)聚或纏繞，很難在溶劑中實(shí)現(xiàn)均勻分散[3]，限制了其功能的發(fā)揮。因此，在MWCNTs表面引入—COOH等親水基團(tuán)來提高其溶解性和分散性已經(jīng)成為了CNTs走向?qū)嵱没年P(guān)鍵[4]。在生產(chǎn)和使用過程中MWCNTs不可避免地會釋放到環(huán)境中，改性的MWCNTs進(jìn)入環(huán)境后引發(fā)的毒性效應(yīng)和對人類潛在的健康風(fēng)險已引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注[5-6]。目前，關(guān)于碳納米材料的研究主要集中在動物和微生物，例如，CNTs能夠造成大型蚤的死亡[7]、抑制蝌蚪的生長[8]和使小鼠出現(xiàn)DNA氧化損傷[9]等；同時，CNTs具有抗菌活性，能夠阻礙細(xì)菌微生物膜的形成，與細(xì)菌直接接觸會造成細(xì)菌的死亡[10]。對植物而言，MWCNTs不僅可以抑制植物生長、降低植物組織生物量[11-12]，還能夠促進(jìn)種子的萌發(fā)以及植物的生長發(fā)育[13-14]。

重金屬鎘(Cd)是生物非必需金屬元素，也是生物毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一[15-17]，廣泛存在于自然界中。由于工業(yè)冶煉及電池、含Cd涂料等的生產(chǎn)和使用，加之其排放到水體中難降解、易富集[18]，使得Cd污染不僅影響了植物生長，而且通過食物鏈嚴(yán)重影響人類健康[19-20]。CNTs因具有巨大的比表面積和豐富的孔隙結(jié)構(gòu)，使其表現(xiàn)出對金屬離子有優(yōu)異的吸附性能[21]，當(dāng)CNTs達(dá)到一定濃度時，會復(fù)合重金屬使毒性作用增強(qiáng)，對植物的生理產(chǎn)生脅迫作用。然而，國內(nèi)外有關(guān)改性MWCNTs復(fù)合重金屬離子對植物生理影響的研究報道甚少[22]。因此，本研究以蠶豆幼苗為實(shí)驗(yàn)對象，選用Cd作為典型的重金屬，研究蠶豆幼苗暴露于不同濃度的羧基化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)及其復(fù)合Cd污染溶液后，其幼苗生理各項(xiàng)指標(biāo)的變化，以期為MWCNTs-COOH的安全使用及其對環(huán)境的污染評價提供理論參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 羧基化多壁碳納米管表征

MWCNTs-COOH (外徑8～15 nm，長度0.5～2 μm，純度>95%)購自中科時代納米成都有機(jī)化學(xué)有限公司。采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(GeminiSEM 300，德國ZEISS公司)表征MWCNTs-COOH表面形貌(圖1)。

圖1 羧基化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)掃描電鏡圖(SEM)Fig. 1 The scanning electron microscope (SEM) image of carboxylated multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs-COOH)

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

蠶豆(ViciafabaL.)種子為淮南當(dāng)?shù)爻Ｒ娖贩N(青皮豆)，購于淮南圓和種子公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

挑選顆粒飽滿的蠶豆種子，用0.1%次氯酸鈉溶液浸沒10 min后在Milli-Q水中充分漂洗，室溫用Milli-Q水浸泡24 h進(jìn)行催芽處理，待蠶豆出芽后播種于濕潤的石英砂中，篩選根尖長2 cm左右的幼苗并移入裝有1/4Hoagland營養(yǎng)液的培養(yǎng)盒中，待幼苗長出第2片真葉后，接受如下處理：CK、1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH (T1)、3.0 mg·L-1MWCNTs-COOH (T2)、6.0 mg·L-1MWCNTs-COOH (T3)、12.0 mg·L-1MWCNTs-COOH (T4)、Cd (T5)、Cd+1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH (T6)、Cd+3.0 mg·L-1MWCNTs-COOH (T7)、Cd+6.0 mg·L-1MWCNTs-COOH (T8)、Cd+12.0 mg·L-1MWCNTs-COOH (T9)，Cd為分析純CdCl2，所有含Cd培養(yǎng)液中Cd含量均為10 μmol·L-1，Hoagland營養(yǎng)液為所有處理基本培養(yǎng)液，pH為6.5～6.8，每個處理重復(fù)3次(3個培養(yǎng)盒各培養(yǎng)48株幼苗)，每3天更換一次處理液，用加氧泵進(jìn)行連續(xù)通氣。待幼苗長出第5片葉后(圖2)，剪取倒三葉開展實(shí)驗(yàn)。

圖2 單一MWCNTs-COOH處理組及與Cd復(fù)合處理組的蠶豆生長狀況注：CK、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8和T9為對照組、1.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH組、3.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH組、6.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH組、12.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH組、Cd處理組、Cd+1.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH組、Cd+3.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH組、Cd+6.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH組、Cd+12.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH組，所有含Cd處理組中Cd含量均為10 μmol·L-1。Fig. 2 Growth status of Vicia faba under single MWCNTs-COOH and MWCNTs-COOH combined with Cd treatmentsNote: CK, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7, T8 and T9 represent control group, 1.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH group, 3.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH group, 6.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH group, 12.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH group, Cd treatment group, Cd+1.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH group, Cd+3.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH group, Cd+6.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH group, Cd+12.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH group; in all the treatment groups containing Cd, Cd content are all 10 μmol·L-1.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 葉綠素含量和根系活力測定

葉綠素含量的測定：參照胡秉芬等[23]的方法，準(zhǔn)確稱取0.5 g倒四葉于研缽中，加入80%丙酮25 mL進(jìn)行研磨，然后將研磨好的勻漿濾入50 mL容量瓶中，用80%丙酮洗凈研缽和濾紙，洗液并入容量瓶中定容至50 mL，利用分光光度計(T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)測OD649和OD665，計算葉綠素含量。

根系活力的測定：采用氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法[24]。準(zhǔn)確稱取根系樣品0.5 g于燒杯中，加入5 mL 0.4% TTC溶液和5 mL磷酸緩沖液的混合溶液，充分浸沒，在37 ℃黑暗條件下處理1.5 h，加入2 mL的1 mol·L-1的硫酸終止反應(yīng)；取出根并將其剪碎，加入3 mL乙酸乙酯，研磨后將紅色提取液轉(zhuǎn)移到容量瓶中并定容至10 mL，測OD485，計算還原量。

1.4.2 氧化損傷的測定

根和葉丙二醛(MDA)含量的測定：參照硫代巴比妥酸(TBA)顯色法[26]。準(zhǔn)確稱取根、葉0.5 g，加入5 mL三氯乙酸(TCA)進(jìn)行充分研磨，勻漿液以4 000 r·min-1離心10 min，吸取2mL MDA提取液，加入2 mL 6 g·L-1TBA溶液，置于沸水中煮沸15 min，迅速冷卻并離心，利用分光光度計測OD532和OD450。

葉片H2O2定位：取不同處理的蠶豆葉片，放入適量二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液中進(jìn)行暗處理6 h，期間要經(jīng)常振蕩，確保葉片浸在溶液中。之后光處理1 h至紅棕色斑點(diǎn)出現(xiàn)為止，用蒸餾水沖洗葉片并加入適量脫色液(75%無水乙醇+5%甘油+20%水)，在80 ℃水浴中進(jìn)行脫色，直到脫色完全，觀察并拍照[27]。

根細(xì)胞死亡檢測：取不同處理的蠶豆根尖，置于0.25% (m/V)伊文思藍(lán)溶液染色5 min[28]，用蒸餾水沖洗3次后迅速放入50%的FAA固定液(38%甲醛5 mL，乙酸5 mL，70%乙醇90 mL)中，經(jīng)乙醇逐級脫水，二甲苯逐級脫乙醇，石蠟逐級脫二甲苯后，進(jìn)行石蠟包埋[29]。采用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(HM 315，MICROM，德國)切片，片厚4 μm，制成臨時裝片，利用光學(xué)顯微鏡(CX23LEDRFS1C，奧林巴斯廣州工業(yè)有限公司，中國)觀察。

1.4.3 SOD和POD活性的測定

超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)測定分別參照氮藍(lán)四唑光還原法和愈創(chuàng)木酚比色法[30-31]。

SOD活性測定：6 mL反應(yīng)混合液含3.5 mL磷酸緩沖液、0.5 mL甲硫氨酸、0.5 mL氮藍(lán)四唑、0.5 mL乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、0.4 mL蒸餾水、0.5 mL核黃素和100 μL酶液。以不照光的對照管做空白，分別測定其他各管的吸光度。

POD活性測定：以一只加入3 mL反應(yīng)混合液(50 mL pH 6.0磷酸緩沖液+28 μL愈創(chuàng)木酚+19 μL 30%過氧化氫)、1 mL 20mmol·L-1KH2PO4的比色皿作為對照，其余比色皿中各加入3 mL反應(yīng)混合液、1 mL酶液，立即開啟秒表計時并在分光光度計470 nm波長下測量OD值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016、SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，利用Origin 7.5軟件對數(shù)據(jù)分析結(jié)果作圖，利用AutoCAD 2019對受損葉片面積進(jìn)行統(tǒng)計。

2 結(jié)果(Results)

2.1 MWCNTs-COOH復(fù)合Cd對蠶豆幼苗葉綠素含量和根系活力的影響

由圖3可知，MWCNTs-COOH單一處理蠶豆幼苗，呈現(xiàn)出隨著MWCNTs-COOH濃度的增加，葉綠素含量先升高后降低的趨勢，當(dāng)MWCNTs-COOH濃度為3.0 mg·L-1時，葉綠素含量達(dá)到最大值1.29 mg·g-1；而根系活力隨MWCNTs-COOH濃度的增加呈下降趨勢，其中，12.0 mg·L-1MWCNTs-COOH單一處理導(dǎo)致根系活力顯著下降(P<0.05)。蠶豆幼苗在MWCNTs-COOH與10 μmol·L-1Cd共同影響下，隨MWCNTs-COOH處理濃度的增加葉綠素含量呈降低趨勢，但是復(fù)合處理間差異不顯著(P>0.05)；所有復(fù)合處理組根系活力皆低于對應(yīng)的MWCNTs-COOH單一處理，與單一Cd處理相比，6.0 mg·L-1MWCNTs-COOH復(fù)合Cd處理使根系活力顯著下降(P<0.05)；MWCNTs-COOH復(fù)合Cd處理組的葉綠素含量整體低于MWCNTs-COOH單一處理組。

圖3 單一MWCNTs-COOH處理組及與Cd復(fù)合處理組中蠶豆葉綠素含量和根系活力變化注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)；下同。Fig. 3 Changes of chlorophyll content and root activity of Vicia faba under single MWCNTs-COOH and MWCNTs-COOH combined with Cd treatmentsNotes: The different lowercase letters in the figure indicate significant differences among different treatments at (P<0.05) levels; the same below.

2.2 MWCNTs-COOH復(fù)合Cd對蠶豆幼苗的氧化損傷產(chǎn)生速率的變化

圖4 蠶豆葉片和根系中超氧自由基產(chǎn)生速率的變化Fig. 4 Changes of superoxide radical production rates in leaves and roots of Vicia faba

2.2.2 葉片H2O2定位及根尖細(xì)胞染色

由圖5和表1可知，MWCNTs-COOH單一處理誘導(dǎo)蠶豆幼苗葉中紅褐色斑點(diǎn)增多，6.0 mg·L-1MWCNTs-COOH單一處理顯著誘導(dǎo)葉片氧化損傷(P<0.05)，而根尖細(xì)胞染色在MWCNTs-COOH濃度為12 mg·L-1時急劇加深；MWCNTs-COOH與10 μmol·L-1Cd共同脅迫下，葉中紅褐色斑點(diǎn)和根尖細(xì)胞顏色變化呈現(xiàn)相同趨勢(先淺后深)；當(dāng)MWCNTs-COOH濃度為12 mg·L-1時，葉中紅褐色斑點(diǎn)最深且所占葉面積最大，達(dá)到64.2%，而根尖結(jié)構(gòu)不完整，染色較淺。

圖5 蠶豆葉片過氧化氫(H2O2)定位及根尖細(xì)胞染色Fig. 5 Leaf hydrogen peroxide (H2O2) localization and root tip cell staining of Vicia faba

2.2.3 MDA含量的變化

由表2可知，MWCNTs-COOH單一處理蠶豆幼苗，根和葉MDA含量皆高于對照，但各處理組之間差異不顯著(P>0.05)；與10 μmol·L-1Cd復(fù)合后，3.0 mg·L-1MWCNTs-COOH誘導(dǎo)根和葉MDA含量下降且均低于Cd處理，6.0 mg·L-1MWCNTs-COOH復(fù)合Cd處理下，根MDA含量顯著上升(P<0.05)；所有復(fù)合處理組根和葉MDA含量皆高于對應(yīng)的MWCNTs-COOH單一處理。

表1 蠶豆葉片氧化損傷面積Table 1 The oxidative damaged area of Vicia faba leaves

表2 蠶豆葉片和根系中丙二醛(MDA)含量變化Table 2 Changes of malondialdehyde (MDA) content in leaves and roots of Vicia faba (nmol·g-1 FW)

2.3 MWCNTs-COOH復(fù)合Cd對蠶豆幼苗2種抗氧化酶活性的影響

由圖6可知，MWCNTs-COOH單一處理蠶豆幼苗后，根和葉SOD及POD活性較對照均上升，其中，6.0 mg·L-1MWCNTs-COOH誘導(dǎo)根和葉SOD活性顯著升高(P<0.05)，根SOD活性達(dá)到最大值150.21 U·mg-1，而葉SOD活性在MWCNTs-COOH濃度為12.0 mg·L-1時達(dá)到最大；當(dāng)MWCNTs-COOH濃度在1.5 mg·L-1和12.0 mg·L-1時，葉和根POD活性達(dá)到最大，分別為152.78 U·mg-1和379.02 U·mg-1。不同濃度梯度的MWCNTs-COOH與10 μmol·L-1Cd復(fù)合脅迫下，葉SOD與根POD活性均呈先下降后上升趨勢，各處理組葉SOD活性之間差異不顯著(P>0.05)，而6.0 mg·L-1MWCNTs-COOH復(fù)合Cd誘導(dǎo)根POD活性顯著升高(P<0.05)，與此同時，復(fù)合Cd處理組均使根POD活性低于Cd單一處理；SOD活性皆低于對應(yīng)MWCNTs-COOH單一處理；葉SOD活性總體上比根SOD活性高，而葉POD活性則低于根的。

3 討論(Discussion)

3.1 MWCNTs-COOH復(fù)合Cd對蠶豆幼苗葉綠素含量和根系活力的影響

葉綠素是植物吸收太陽光能進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，其含量的高低直接影響植物光合作用的水平，而根系活力的高低直接影響著植物地上部分的生長發(fā)育[32-33]。因此，兩者都是植物響應(yīng)逆境脅迫的重要生理體現(xiàn)。楊祥宇[34]研究了黃瓜和蘆葦?shù)葷竦刂参锶~綠素含量在納米二氧化鈦脅迫下的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1～50 mg·L-1納米二氧化鈦能不同程度地提高葉綠素含量。Begum等[35]利用未改性MWCNTs處理水稻等幼苗，結(jié)果表明，0～200 mg·L-1MWCNTs處理下，根系活力呈上升趨勢。本研究中，蠶豆幼苗在1.5～6.0 mg·L-1MWCNTs-COOH單一處理下葉綠素含量升高，但根系活力皆低于對照。與前人研究對比，蠶豆幼苗對MWCNTs-COOH的耐受范圍低于納米二氧化鈦處理下的蘆葦及MWCNTs處理下的水稻等植物。原因是MWCNTs-COOH是改性的納米材料，能夠穿透植物根部細(xì)胞壁，對植物的毒害大于未改性的MWCNTs[22]。此外，植物種類的不同也會使其對納米材料的耐受濃度范圍產(chǎn)生差異。當(dāng)MWCNTs-COOH與Cd共同脅迫蠶豆幼苗時，1.5～3.0 mg·L-1MWCNTs-COOH反而促進(jìn)根系活力的增加，原因是MWCNTs-COOH可有效吸附環(huán)境中的重金屬離子[36]，使部分Cd被附著在MWCNTs-COOH上，減弱了Cd對植物根系的損傷。

圖6 蠶豆葉片和根系中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性變化Fig. 6 Changes of superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) activities in leaf and root system of Vicia faba

3.2 MWCNTs-COOH復(fù)合Cd對蠶豆幼苗的氧化損傷

3.2.2 對根尖的影響

植物在受到脅迫時，根尖細(xì)胞會出現(xiàn)不同程度的損傷，損傷程度越大，表明其受到的脅迫越嚴(yán)重。伊文思藍(lán)能夠與蛋白結(jié)合形成伊文思藍(lán)蛋白復(fù)合物，但不能透過正常細(xì)胞膜；當(dāng)細(xì)胞受損后，其進(jìn)入細(xì)胞并結(jié)合蛋白，使細(xì)胞染成藍(lán)色[28]。因此，可以根據(jù)細(xì)胞染色程度來判斷根尖的受損情況。在MWCNTs-COOH單一處理下，根尖細(xì)胞染色程度隨MWCNTs-COOH濃度的增加而逐漸加深，尤其當(dāng)濃度達(dá)到12.0 mg·L-1時，根尖細(xì)胞染色最深，受損最嚴(yán)重。12.0 mg·L-1MWCNTs-COOH復(fù)合Cd后，蠶豆幼苗隨時間的增長出現(xiàn)根部腐爛現(xiàn)象，導(dǎo)致部分細(xì)胞脫落，根尖細(xì)胞染色變淺，該現(xiàn)象與邱清華等[43]利用白菜等十字花科植物在Pb脅迫下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，表明蠶豆根尖在高濃度MWCNTs-COOH與Cd共同脅迫下細(xì)胞受到嚴(yán)重毒害。

3.2.3 對MDA含量的影響

3.3 MWCNTs-COOH復(fù)合Cd對蠶豆幼苗SOD和POD活性的影響

本研究結(jié)果表明，低濃度MWCNTs-COOH對植物生理代謝有一定的促進(jìn)作用，并能吸附一定量的Cd，減弱Cd對植物的毒害作用。高濃度MWCNTs-COOH單一與復(fù)合Cd處理會對植物產(chǎn)生脅迫，加重植物氧化損傷程度。因此，值得警示的是：持續(xù)向環(huán)境中釋放MWCNTs-COOH，可能會引起植物毒性，加劇因復(fù)合重金屬Cd而帶來的生態(tài)風(fēng)險。