程戰(zhàn)文，殷諾雅，鄭衛(wèi)，F(xiàn)rancesco Faiola,*

1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049 3. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院泌尿外科，重慶 401120

近年來(lái)，隨著工業(yè)技術(shù)的逐漸發(fā)展，大氣污染日益嚴(yán)重，越來(lái)越多的國(guó)家和地區(qū)開始關(guān)注大氣污染問(wèn)題。已有流行病學(xué)研究表明，大氣污染物的暴露會(huì)導(dǎo)致人群中呼吸系統(tǒng)[1]和心血管系統(tǒng)[2-3]疾病發(fā)病率的增加，以及人群中死亡率的上升[4-5]，存在一定的健康風(fēng)險(xiǎn)。除此之外，皮膚作為人體最大的器官，流行病學(xué)研究同樣證實(shí)大氣污染會(huì)引起內(nèi)源性的皮膚老化[6-7]、過(guò)敏性皮炎[8-9]及濕疹[10]等皮膚疾病發(fā)病率的增加，同時(shí)還伴隨著黑色素在皮膚中的累積和老年雀斑比例的上升[7,11]，對(duì)人體皮膚具有潛在的毒性效應(yīng)?？紤]到皮膚是保護(hù)人體免受外界污染物危害的第一道防線，且目前關(guān)于污染物是如何影響人體皮膚的病因，也并未闡明。因此，從皮膚細(xì)胞角度出發(fā)衡量大氣污染物潛在的危害效應(yīng)，將有助于大氣污染毒性的評(píng)估以及污染物排放標(biāo)準(zhǔn)的制定。

大氣中的各種顆粒物成分，組成了大氣氣溶膠的懸浮體系。而粒徑<100 nm的超細(xì)顆粒物，雖然在質(zhì)量上只占大氣總顆粒物的很少一部分，但卻是大氣中數(shù)量最多的顆粒物[12]。與PM2.5以及PM10相比，超細(xì)顆粒物具有更小的粒徑，不僅能透過(guò)呼吸系統(tǒng)的各種屏障，還能直接透過(guò)肺泡細(xì)胞，進(jìn)入人體血液循環(huán)，在人體內(nèi)造成嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)并伴隨氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[13-14]。事實(shí)上，超細(xì)顆粒物已被證實(shí)是霧霾期間兒童若干疾病如收縮壓升高[15]、哮喘發(fā)病率上升[16]的元兇。雖然，超細(xì)顆粒物對(duì)人體存在著潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，但目前對(duì)超細(xì)顆粒物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估還處于較早的階段，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(US EPA)以及歐盟(EU)對(duì)超細(xì)碳顆粒物的排放還未制定規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。因此，從超細(xì)顆粒物角度解釋大氣污染潛在毒性效應(yīng)特別是皮膚毒性效應(yīng)，將有助于大氣污染風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。

目前，已有許多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從納米毒理學(xué)角度出發(fā)，探討了納米尺度顆粒物的潛在皮膚暴露風(fēng)險(xiǎn)。作為常見的碳納米材料的代表，單壁碳納米管能導(dǎo)致皮膚中的角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的活性氧(reactive oxygen species, ROS)蓄積[17]，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脅迫相關(guān)基因的過(guò)量表達(dá)。除此之外，納米顆粒物的暴露，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的高表達(dá)。例如24 h內(nèi)20、50和80 nm納米銀暴露會(huì)導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α的濃度顯著升高，并伴隨著納米銀作用位點(diǎn)出現(xiàn)明顯的局灶性炎癥現(xiàn)象[18]。Li和Monteiro-Riviere[19]使用硫辛酸、聚乙二醇以及聚乙烯亞胺修飾過(guò)的納米金顆粒，研究了人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)不同粒徑納米金顆粒的攝取和內(nèi)吞效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)不同材料修飾的納米金顆粒均會(huì)促進(jìn)促炎癥因子IL-1α、IL-1β和趨化因子IL-8的表達(dá)和分泌。相同的炎癥效應(yīng)，同時(shí)也出現(xiàn)于納米碳管[20]、納米鋅[21]以及納米二氧化鈦[22]暴露后的角質(zhì)形成細(xì)胞中。

值得注意的是，以上研究大多基于人體角質(zhì)形成細(xì)胞。雖然，角質(zhì)形成細(xì)胞占表皮細(xì)胞的90%，但對(duì)于表皮中具有黑色素分泌功能，同時(shí)能調(diào)節(jié)皮膚顏色并保護(hù)皮膚免受紫外線干擾的黑色素細(xì)胞而言，研究還較少。只有少量研究表明，大氣污染中的某些持久性有機(jī)污染物如二噁英會(huì)通過(guò)AhR受體介導(dǎo)的形式，上調(diào)黑色素細(xì)胞內(nèi)與黑色素產(chǎn)生相關(guān)的TYR、TYRP1以及TYRP2基因的表達(dá)，促進(jìn)黑色素產(chǎn)生[23-24]。此外，目前的研究多是從氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)2個(gè)方面揭示納米顆粒物的毒性，從細(xì)胞功能角度闡明納米尺度顆粒物毒性效應(yīng)的研究還較少。鑒于以上原因，使用原代細(xì)胞分離的方法，從人體皮膚中同時(shí)分離了角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞，用商業(yè)化的超細(xì)碳顆粒物模擬了大氣中的超細(xì)顆粒物，探究了大氣顆粒物的潛在皮膚毒性?？紤]到目前已有若干基于原代角質(zhì)形成細(xì)胞的研究，此處重點(diǎn)探討了超細(xì)碳顆粒物對(duì)黑色素功能基因表達(dá)的影響。以上研究將有助于大氣顆粒物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，解釋超細(xì)顆粒物的皮膚致毒機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)室中分離的黑色素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞來(lái)源于醫(yī)院健康男性包皮環(huán)切術(shù)(已告知樣品用途并獲得口頭許可)。手術(shù)結(jié)束后的皮膚樣品迅速保存至含有5 mg·L-1慶大霉素(Gibco，R01510)的D-KSFM培養(yǎng)基(Gibco，10744019)中，并置于冰中轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離。

實(shí)驗(yàn)使用的超細(xì)碳顆粒物為商業(yè)化的碳顆粒物(Sigma，633100)，使用二甲基亞砜(DMSO)(Amresco，0231)為分散劑并置于37 ℃恒溫水浴鍋(Elma，P60H)中超聲30 min，獲得濃度為10 g·L-1的超細(xì)碳顆粒物母液，再次梯度稀釋為1 mg·L-1～10 g·L-1儲(chǔ)備液。

1.2 原代細(xì)胞的分離

使用含有20 mg·L-1慶大霉素的杜氏磷酸緩沖液(DPBS)(Gibco，14190250)清洗包皮樣品5次，每次5 min，并將包皮樣品剪成2 cm3左右的片狀，充分清洗去除其中的血漬。將清洗過(guò)后的包皮樣品轉(zhuǎn)移至含有25 000 units·L-1蛋白酶(Gibco，17105041)和5 mg·L-1慶大霉素的DPBS溶液中，4 ℃條件下消化24 h。消化完成后，使用鑷子將表皮從樣品中剝離出來(lái)，并使用0.05% Trypsin-EDTA(Gibco，12605010)在37 ℃條件下消化15 min，消化過(guò)程中使用巴氏吸管吹打樣品使表皮更加充分的消化。消化完成后，使用10倍體積的DPBS溶液稀釋消化液終止消化，并使用40 μm細(xì)胞過(guò)濾器(Corning，431750)去除未消化的殘?jiān)?，最后?00 g離心5 min。離心完成之后，使用D-KSFM培養(yǎng)基重新懸浮，并按照1×108cells·L-1濃度將細(xì)胞接種于膠原蛋白(Gibco，R011K)修飾過(guò)的培養(yǎng)皿中，用于角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)。使用含有HMGS-2(Gibco，S0165)的m254培養(yǎng)基(Gibco，M254500)(黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基)重懸細(xì)胞并將其接種于纖連蛋白(Corning，354008)修飾過(guò)的培養(yǎng)皿中，用于黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)。分離的原代細(xì)胞在一周后能逐漸長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，在2～3次傳代后能逐漸被分離純化(圖1)。

圖1 表皮分離過(guò)程Fig. 1 The procedure of epidermis isolation

1.3 超細(xì)碳顆粒物表征

將納米碳顆粒粉末均勻分布在樣品臺(tái)的導(dǎo)電膠上，使用洗耳球從不同角度吹拂樣品臺(tái)上的納米碳顆粒樣品，使粉末牢固、均勻地粘在導(dǎo)電膠上。使用場(chǎng)發(fā)射高分辨率掃描電鏡(field-emission scanning electron microscopy, FE-SEM)(Hitachi，SU-8020)拍攝超細(xì)碳顆粒物照片，并使用其元素分析模塊(energy dispersive X-ray spectroscopy, EDS)分析其元素組成和含量。

將1 g·L-1碳顆粒物儲(chǔ)備液用DMEM/F12(Gibco，11320082)稀釋至1 mg·L-1，用以模擬其在培養(yǎng)基中的條件，并將其滴加至碳膜覆蓋的銅網(wǎng)(Electron Microscopy China，BZ11032a)上，使用紅外燈烘干1 h，使銅網(wǎng)完全干燥后，即可置于透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)(Hitachi，H7500)中在80 kV下拍攝TEM照片。

1.4 細(xì)胞活性檢測(cè)

將傳代3代之后原代黑色素細(xì)胞使用TrypLE消化液(Gibco，12604013)消化并重懸浮，并按1×108cell·L-1接種于纖連蛋白修飾后的96孔板中。將1 mg·L-1～10 g·L-1超細(xì)碳顆粒儲(chǔ)備液用黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋1 000倍(DMSO濃度為0.1%)，使超細(xì)碳顆粒物暴露濃度分別為1、10、100、1 000和10 000 μg·L-1，陰性對(duì)照為0.1% DMSO處理組，每孔100 μL，共持續(xù)暴露72 h。暴露過(guò)程中每天更換培養(yǎng)基。暴露結(jié)束使用AlamarBlue(Thermo，DAL1025)試劑，在酶標(biāo)儀(Thermo，Varioskan LUX)上檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)530 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm)細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率計(jì)算方法如下：

1.5 超細(xì)碳顆粒物對(duì)黑色素基因表達(dá)分析

將黑色素細(xì)胞按照相同濃度接種于纖連蛋白修飾后的培養(yǎng)皿中并暴露于含有1～10 000 μg·L-1超細(xì)碳顆粒的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基中。待細(xì)胞長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，加入1 mL Trizol試劑(Invitrogen，15596018)按照其說(shuō)明提取樣品中的RNA，并使用NanoDrop紫外可見分光光度計(jì)(Thermo，NanoDrop 2000)測(cè)量RNA溶液濃度和260、280及230 nm的吸光值，進(jìn)行RNA定量。使用FastKing RT Kit試劑(TIANGEN，KR116)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入SYBR Green試劑(Takara，RR420L)后按照以下步驟測(cè)量基因表達(dá)水平：預(yù)變性(95 ℃，30 s)，PCR(95 ℃，3 s；60 ℃，30 s；40個(gè)循環(huán))?；虮磉_(dá)以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物以及其序列如表1所示。

1.6 免疫熒光染色

將樣品使用DPBS清洗3次，加入4%福爾馬林試劑在室溫條件下固定20 min后再次使用DPBS清洗。加入含有0.1% Triton X-100(Amresco，0694)和5%山羊血清(Solarbio，SL038)的DPBS試劑作為封閉液室溫條件下孵育1 h。加入一抗4 ℃過(guò)夜孵育，使用DPBS清洗后加入二抗4 ℃孵育2 h即可。本部分抗體使用信息如表2所示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 原代黑色素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞分離

原代細(xì)胞分離過(guò)程如圖1所示，由于表皮中大多數(shù)細(xì)胞為角質(zhì)形成細(xì)胞，黑色素細(xì)胞只占很少一部分，因此，在細(xì)胞分離過(guò)程中使用黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基(在m254培養(yǎng)基中添加HMGS-2)以及以纖連蛋白為基質(zhì)，對(duì)黑色素細(xì)胞進(jìn)行分離和篩選。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)2～3次傳代后，黑色素細(xì)胞能逐漸被純化并表現(xiàn)出較高的純度。在體外分離出來(lái)的黑色素細(xì)胞胞質(zhì)透明可見，細(xì)胞核較小，每個(gè)細(xì)胞具有多個(gè)樹突狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)，分離出的黑色素細(xì)胞能在離體條件下進(jìn)行傳代和擴(kuò)增，并維持均一的細(xì)胞形態(tài)(圖2)。通過(guò)將黑色素細(xì)胞消化收集并離心，能在試管底部發(fā)現(xiàn)明顯的黑色素沉淀，這說(shuō)明分離的原代黑色素細(xì)胞在體外具有合成黑色素的能力(圖2)，驗(yàn)證細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)的成功。

表1 qRT-PCR引物及其序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

除了黑色素細(xì)胞，還獲得了皮膚中的角質(zhì)形成細(xì)胞，并在幾次傳代后實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞分離純化(圖2)。顯微鏡下角質(zhì)形成細(xì)胞呈不規(guī)則鱗片形，細(xì)胞邊緣較為明亮，且相互之間緊密相連。通過(guò)熒光免疫染色，發(fā)現(xiàn)所有的細(xì)胞都能表達(dá)角質(zhì)形成細(xì)胞特異的骨架蛋白KRT14。以上結(jié)果說(shuō)明，我們的原代細(xì)胞分離方法不僅能分離黑色素細(xì)胞，也能用于提取皮膚中的角質(zhì)形成細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)分離皮膚中兩大類細(xì)胞。

2.2 超細(xì)碳顆粒物表征

如圖3(a)所示，超細(xì)碳顆粒粉末呈聚集的團(tuán)狀，聚集體之間存在較大范圍的間隙，同時(shí)顆粒與顆粒之間存在明顯的團(tuán)聚。因此，下述準(zhǔn)備超細(xì)碳顆粒懸浮液時(shí)，均使用超聲水浴使碳顆粒盡量分散。SEM結(jié)果顯示，粉末狀碳顆粒粒徑約50 nm。EDS元素分析結(jié)果顯示，除去光譜中存在的元素氧信號(hào)外，粉末主要成分都為元素碳，這說(shuō)明粉末狀樣品主要組成元素為碳，樣品具有較高的純度。

超細(xì)碳顆粒的TEM表征結(jié)果如圖3(c)所示，將1 g·L-1分散于DMSO的超細(xì)碳顆粒物懸液用DMEM/F12稀釋至1 mg·L-1，超聲分散后，超細(xì)碳顆粒物能在培養(yǎng)基中被分散成單個(gè)球形的顆粒物，且能在DMEM/F12中均勻分散，此濃度下未見明顯的碳顆粒聚集體。TEM表征結(jié)果顯示，單個(gè)碳顆粒在DMEM/F12中粒徑<100 nm，為納米尺度顆粒物，這與SEM結(jié)果相符。

圖3 超細(xì)碳顆粒物的掃描電鏡(SEM)、X射線能譜分析(EDS)和透射電鏡(TEM)表征注：(a) SEM表征超細(xì)碳顆粒粉末形態(tài)；(b) 超細(xì)碳顆粒粉末的EDS元素分析；(c) TEM表征超細(xì)碳顆粒形態(tài)(1 μm)。Fig. 3 Characterization of ultrafine carbon particles by scanning electron microscopy (SEM), energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS) and transmission electron microscopy (TEM)Note: (a) morphology of ultrafine carbon powder under SEM; (b) EDS results for ultrafine carbon particles; (c) ultrafine carbon particles under TEM (scale bar, 1 μm).

2.3 超細(xì)碳顆粒物暴露對(duì)黑色素細(xì)胞的急性毒性

考慮到目前已有許多基于角質(zhì)形成細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，此處重點(diǎn)關(guān)注了黑色素細(xì)胞的毒性效應(yīng)。為了探究超細(xì)碳顆粒物暴露對(duì)黑色素細(xì)胞急性毒性的影響，使用AlamarBlue測(cè)量72 h碳顆粒暴露之后黑色素細(xì)胞的細(xì)胞活性。由于氧化型AlamarBlue能被活細(xì)胞攝取進(jìn)入細(xì)胞并被活細(xì)胞中的線粒體酶還原成具有熒光效應(yīng)的還原態(tài)，故可通過(guò)其特定波段的熒光值來(lái)測(cè)定細(xì)胞活性。如圖4所示，相比于DMSO對(duì)照組，72 h超細(xì)碳顆粒暴露并不會(huì)對(duì)黑色素細(xì)胞造成明顯的急性細(xì)胞毒性。這說(shuō)明，超細(xì)碳顆粒物在1～10 000 μg·L-1濃度范圍內(nèi)，不具有顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng)。

圖4 超細(xì)碳顆粒物72 h暴露對(duì)黑色素細(xì)胞急性毒性的影響注：DMSO表示0.1%二甲基亞砜溶劑對(duì)照組。Fig. 4 72 h acute toxicity of ultrafine carbon particles on melanocytesNote: DMSO represents 0.1% dimethyl sulfoxide solvent control.

2.4 超細(xì)碳顆粒物暴露對(duì)黑色素細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探究超細(xì)碳顆粒物對(duì)黑色素細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響，使用qRT-PCR測(cè)量了若干黑色素細(xì)胞功能基因的表達(dá)。如圖5所示，對(duì)于黑色素細(xì)胞的標(biāo)志基因MITF、MITF-M以及c-KIT，當(dāng)超細(xì)碳顆粒物濃度>1 000 g·L-1時(shí)，基因表達(dá)水平會(huì)顯著上升。同時(shí)，其上游調(diào)控基因PAX3和SLUG的表達(dá)，也能被超細(xì)碳顆粒物所促進(jìn)。對(duì)于黑色素形成過(guò)程中的關(guān)鍵酶TYRP1和TYR以及黑色素小體特異型跨膜糖蛋白SILV而言，超細(xì)碳顆粒物暴露也會(huì)使其基因表達(dá)出現(xiàn)相同的趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明，超細(xì)碳顆粒物暴露會(huì)顯著促進(jìn)黑色素細(xì)胞的活動(dòng)，特別是當(dāng)超細(xì)碳顆粒物濃度>1 000 g·L-1時(shí)。

圖5 超細(xì)碳顆粒物暴露對(duì)黑色素細(xì)胞基因表達(dá)的影響注：(a)黑色素細(xì)胞標(biāo)志基因MITF、MITF-M和c-KIT表達(dá)水平；(b)黑色素細(xì)胞標(biāo)志基因上游調(diào)控基因PAX3和SLUG表達(dá)水平；(c)與黑色素產(chǎn)生有關(guān)基因TYR、TYRP1和SILV表達(dá)水平。Fig. 5 The effect of carbon exposure on melanocyte gene expressionNote: (a) the expression of melanocyte marker genes MITF, MITF-M and c-KIT; (b) the upstream gene expression of melanocyte markers PAX3 and SLUG; (c) the gene expression related to melanin production TYR, TYRP1 and SILV.

3 討論(Discussion)

本文使用一種商業(yè)化的超細(xì)碳顆粒物模擬了大氣中的超細(xì)顆粒物，研究了其潛在的皮膚毒性。在日常生活中，該超細(xì)碳顆粒物也常被用作輪胎和其他橡膠制品中的增強(qiáng)劑，以及各種油漆、油墨等染色材料[25]。根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的研究報(bào)告，超細(xì)碳顆粒物被列為2B類致癌物，對(duì)人體可能具有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)[26]。雖然，目前關(guān)于超細(xì)碳顆粒物的研究還不是很多，但已有流行病學(xué)研究表明，超細(xì)碳顆粒物暴露會(huì)影響人體健康。例如，通過(guò)調(diào)查報(bào)紙印刷行業(yè)工作人員的健康狀況，發(fā)現(xiàn)此類人群中肺癌風(fēng)險(xiǎn)與在打印板房工作時(shí)間正相關(guān)[27]，同時(shí)總就業(yè)時(shí)間越長(zhǎng)腎癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也越高[28]，并且橡膠行業(yè)從業(yè)人員有更高的心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病以及高血壓發(fā)病率[29]。與其他納米材料相同，超細(xì)碳顆粒物暴露同樣也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)ROS，同時(shí)高表達(dá)某些炎癥相關(guān)因子，最終導(dǎo)致機(jī)體呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)受損[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，超細(xì)碳顆粒物的暴露會(huì)對(duì)促進(jìn)人體黑色素細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)，這說(shuō)明超細(xì)碳顆粒物以及大氣細(xì)顆粒物可能具有潛在的皮膚毒性。

表皮作為皮膚的最外層，構(gòu)成了人體的外部屏障，能保護(hù)人體不受外界的危害[30]。角質(zhì)形成細(xì)胞是構(gòu)成表皮的主要細(xì)胞，占表皮細(xì)胞的90%以上；黑色素細(xì)胞雖然只占表皮細(xì)胞的6%，但是能分泌黑色素，保護(hù)人體免受紫外線的影響。因此，以角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞為基礎(chǔ)的皮膚模型，能在一定程度上反映外界污染物對(duì)皮膚的毒性效應(yīng)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，超細(xì)碳顆粒物的暴露會(huì)導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)育異常，并伴隨著發(fā)育分化過(guò)程中炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)。同時(shí)，考慮目前已有若干基于原代角質(zhì)形成細(xì)胞的毒性數(shù)據(jù)，所以此實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)關(guān)注了超細(xì)顆粒物對(duì)黑色素細(xì)胞的影響。但是，基于人體皮膚同時(shí)分離原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法，在未來(lái)能為污染物皮膚毒性評(píng)價(jià)，提供新的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)超細(xì)碳顆粒物的暴露會(huì)促進(jìn)黑色素功能基因MITF、MITF-M、TYR、TYRP1、SILV、SLUG、PAX3以及c-KIT的高表達(dá)。MITF和MITF-M作為黑色素細(xì)胞最重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)著黑色素細(xì)胞的發(fā)育和黑色素生成酶基因的表達(dá)[31-32]。作為TYR、TYRP1和SILV的上游調(diào)控基因，MITF能通過(guò)與DNA上的特異性啟動(dòng)子結(jié)合，控制黑色素形成過(guò)程中酪氨酸酶(TYR)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TYRP1)的轉(zhuǎn)錄，從而影響著黑色素的生成[33-34]，而SILV與黑色素細(xì)胞中黑色素小體上的跨膜蛋白形成有關(guān)[35]。此外，MITF的表達(dá)會(huì)受到其上游調(diào)控基因PAX3[36]和SLUG[37]的影響，如PAX3和SOX10通過(guò)協(xié)同作用以反式作用元件的方式激活MITF啟動(dòng)子，進(jìn)一步促進(jìn)MITF的表達(dá)[36]。在此實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)超細(xì)碳顆粒物暴露會(huì)通過(guò)高表達(dá)以MITF為核心的功能性基因網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)黑色素細(xì)胞的功能。目前已有研究表明，PM2.5濃度的上升以及碳黑顆粒物的暴露會(huì)導(dǎo)致皮膚中黑色素的過(guò)量產(chǎn)生以及累積，并伴隨著人群中皮膚色素沉積增多和患老年雀斑比例的增加[6-7,11]甚至是黑色素瘤的出現(xiàn)[38]，這與我們通過(guò)原代黑色素細(xì)胞暴露所獲得的結(jié)果是相吻合的。因此，我們的研究結(jié)果及模型對(duì)于評(píng)價(jià)大氣污染的潛在皮膚毒性，特別是顆粒物對(duì)皮膚色素產(chǎn)生的影響，具有十分重要的借鑒意義。