亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        納米銀在諾氟沙星脅迫下對黃孢原毛平革菌的毒物興奮效應

        2020-04-07 12:40:36丁文東崔康平郭志高斯研
        生態(tài)毒理學報 2020年6期
        關(guān)鍵詞:諾氟沙星胞外離子

        丁文東,崔康平,郭志,*,高斯研

        1. 合肥工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院,合肥 230009 2. 合肥工業(yè)大學納米礦物與污染控制安徽普通高校重點實驗室,合肥 230009

        長期以來,納米銀(AgNPs)被廣泛應用和研究。由于納米材料具有小尺寸、宏觀量子隧道和量子尺寸等效應,使得它們在生物學、醫(yī)學和生物化學工程中的應用正在迅速擴展,并展現(xiàn)出其獨特的環(huán)境效應和生物毒性[1-2]。然而,最近的研究結(jié)果表明,AgNPs并不總是起殺菌作用,低濃度的AgNPs會產(chǎn)生毒物興奮效應,刺激微生物的生長。AgNPs濃度在最低致死濃度的12%~31%時能夠?qū)Υ竽c桿菌產(chǎn)生毒物興奮效應[3]。人纖維肉瘤細胞系HT-1080的活性在AgNPs濃度為0.78~6.25 mg·L-1時被刺激,在濃度≤0.39 mg·L-1和≥12.5 mg·L-1時被抑制[4]。同樣,外周血淋巴細胞(PBMCs)和精原干細胞系C18-4的活性也會隨AgNPs濃度的變化產(chǎn)生低濃度刺激、高濃度抑制的現(xiàn)象[5-6]。毒物興奮效應(Hormesis)最初起源于毒理學,超過一定范圍的高劑量有毒因子可能對生物體有害,而一定范圍內(nèi)的低劑量有毒因子可能對生物體有益,刺激微生物生長。目前,AgNPs的“毒物興奮效應”機理尚不清楚,有待進一步研究。

        諾氟沙星(NOR)是廢水中常見的氟喹諾酮類藥物[7]??股貙ξ⑸锝到庥泻軓姷牡挚沽?,由于其強吸附特性,可能會在水中持續(xù)存在[8]。環(huán)境中存在的抗菌化合物令人擔憂,主要是因為長期暴露在亞治療劑量下可能會為微生物提供選擇性壓力[9]。在環(huán)境中檢測到的氟喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氧氟沙星)最大濃度可達到7 560 ng·L-1[10]。這些化合物會破壞水中重要的生物過程,并對水生和陸生生物構(gòu)成潛在威脅,是環(huán)境中的重要毒性脅迫來源[11]。

        黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)是一種典型的白腐真菌菌株,具有降解有機污染物的功能,是水處理過程中常用的微生物,所以本研究選擇其作為受試微生物。通過不同濃度AgNPs對諾氟沙星脅迫下的黃孢原毛平革菌存活率影響的比較,監(jiān)測刺激過程中溶液中總銀濃度的變化以及細胞外蛋白質(zhì)含量的變化,并借助掃描電鏡、X射線衍射和傅里葉紅外光譜分析菌絲球表面的變化,從而探究AgNPs產(chǎn)生毒物興奮效應的原因。

        1 材料與方法(Materials and methods)

        1.1 實驗材料

        黃孢原毛平革菌AF-96007菌株購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢),并保持在4 ℃下儲存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中,通過將孢子刮到滅菌的超純水中,將懸浮液的濃度調(diào)節(jié)至2.0×106CFU·mL-1。然后將孢子懸浮液接種到液體培養(yǎng)基中,在37 ℃和150 r·min-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。其中,馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基:馬鈴薯提取物200 g·L-1,葡萄糖20 g·L-1,瓊脂20 g·L-1,KH2PO43 g·L-1,MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1,維生素B18 g·L-1。液體培養(yǎng)基:酒石酸銨0.211 g·L-1,葡萄糖11.098 g·L-1,KH2PO40.2 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.05 g·L-1,CaCl20.01 g·L-1,NaAc 1.641 g·L-1,維生素溶液0.5 mL,無機鹽溶液1 mL。所有培養(yǎng)基使用前均在121 ℃濕熱滅菌30 min。諾氟沙星和AgNO3純度均>98%,購自Sigma-Aldrich(上海)有限公司,所用其他化學品均為分析純,由國藥化學試劑有限公司提供。

        1.2 AgNPs的制備與表征

        參照本課題組之前使用的制備方法[12]。在冰浴下,將4 mL質(zhì)量分數(shù)為0.3%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液、12 mL 15 mmol·L-1的硼氫化鈉溶液與233 mL水混合,然后加入5 mL的40 mmol·L-1的AgNO3溶液,室溫攪拌反應2 h;用1 kDa透析袋,將所得顆粒懸浮液用超純水透析,去除多余的PVP和Ag離子,即獲得PVP-AgNPs的分散液,于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

        本研究采用火焰石墨爐原子吸收分光光度計(AAnalyst 800,PE公司,美國)測定了所制備的AgNPs的濃度,并利用紫外可見分光光度計(UV-2550,島津公司,日本)、Zeta電位儀(Nano-ZS90,Malvern公司,英國)來表征所合成的銀納米材料的紫外可見吸收峰、流體動力學直徑和表面電荷。

        1.3 AgNPs對諾氟沙星脅迫下的真菌存活率實驗

        培養(yǎng)3 d后的黃孢原毛平革菌菌絲球在10 000 r·min-1離心5 min,并用2 mmol·L-1NaHCO3緩沖液清洗2遍,等量的菌絲球(0.5 g)分裝到各個試管中。將菌絲球進行以下3組處理。(1)諾氟沙星脅迫組:分別加入諾氟沙星,使實驗溶液中的諾氟沙星濃度為0、1、5、10和20 mg·L-1;(2)AgNPs處理組:在5 mg·L-1諾氟沙星的脅迫下,分別加入AgNPs,使試驗溶液中的AgNPs濃度為0、0.001、0.01、0.13和1.3 mg·L-1;(3)AgNO3處理組:在5 mg·L-1諾氟沙星的脅迫下,分別加入AgNO3,使試驗溶液中的AgNO3濃度為0、0.001、0.01、0.13和1.3 mg·L-1。染毒24 h后,采用MTT比色法[13],測定反應后的上清液在534 nm處的吸光度,并以與對照組的相對百分比表示黃孢原毛平革菌的存活率。

        1.4 胞外蛋白質(zhì)濃度測定

        實驗中,取2 mL樣品于離心管中,在5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心15 min,然后取出1 mL上清液用于胞外蛋白的測定。在該1 mL樣品中加入5 mL考馬斯亮蘭染色液試劑,混勻,室溫靜置3 min后,于波長595 nm處比色,讀取吸光度,由樣品的吸光度值查標準曲線即可求出蛋白質(zhì)的含量。

        1.5 溶液中總銀濃度測定

        為了解AgNPs以及Ag離子在體系中的遷移轉(zhuǎn)化,需要在AgNPs與Ag離子對黃孢原毛平革菌的活性影響實驗中取出樣品來測定總銀濃度,在測定之前,將從各個時間點取出的試樣利用硝酸和過氧化氫進行消解[14],再采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)(Agilent 7500,安捷倫科技(中國)有限公司,美國)對溶液中的總銀進行定量分析。

        1.6 菌絲球表面分析

        對正常培養(yǎng)組(空白組)、5 mg·L-1諾氟沙星脅迫組(對照組)、5 mg·L-1諾氟沙星以及1.1 mg·L-1AgNO3脅迫組(Ag離子處理組)、5 mg·L-1諾氟沙星以及0.01 mg·L-1AgNPs脅迫組(AgNPs處理組)中的黃孢原毛平革菌菌球,分別進行掃描電鏡及能譜分析(FEI Quanta-400,F(xiàn)ei公司,荷蘭)、X射線衍射分析(D8 Discover-2500,Bruker公司,德國)以及傅里葉紅外光譜分析(WQF-410,北京瑞利分析儀器公司,中國)。

        2 結(jié)果(Results)

        2.1 AgNPs的表征

        由圖1(a)可知,所制備的PVP-AgNPs在波長為397 nm處有較強的特征吸收峰,這一結(jié)果與此前合成的AgNPs的結(jié)果一致[12]。且PVP-AgNPs在2 mmol·L-1NaHCO3緩沖液中測定的Zeta電位是(-17.8±0.6) mV,動態(tài)光散射儀測出的氫動力學粒徑是(76.4±5.6) nm。由圖1(b)可知,合成的AgNPs粒徑分布范圍較廣,可能是由于AgNPs之間發(fā)生了團聚。此外,經(jīng)火焰原子吸收光譜法檢測,所得分散液中,PVP-AgNPs的濃度為18.38 mg·L-1(0.17 mmol·L-1)。

        圖1 納米銀(AgNPs)的表征:(a) AgNPs的紫外可見吸收光譜;(b) AgNPs流體動力學平均直徑分布直方圖Fig. 1 Characterization of synthesized Ag nanoparticles (AgNPs): (a) UV-Vis absorption spectrum of AgNPs; (b) histogram of hydrodynamic diameter distribution of AgNPs

        2.2 黃孢原毛平革菌活性分析

        由圖2(a)所示,在諾氟沙星處理組中,隨著諾氟沙星脅迫濃度的增加,細胞活性逐漸降低。由圖2(b)所示,在AgNO3處理組中,細胞活性也同樣隨著Ag離子濃度的升高呈現(xiàn)降低趨勢,這與諾氟沙星單獨脅迫的情況相似,Ag離子濃度在0.13 mg·L-1和1.3 mg·L-1時,細胞活性穩(wěn)定于29%,與對照組的55%相比,活性降低47%,可能由于在較高濃度毒物刺激下真菌可以利用諾氟沙星作為碳源和能源抵御環(huán)境中的不利因素[15],導致其活性不再降低。

        如圖2(c)所示,較高濃度的AgNPs(0.13 mg·L-1和1.3 mg·L-1)處理組中,由于AgNPs以及諾氟沙星的毒性脅迫作用,導致黃孢原毛平革菌的細胞活性明顯降低,最低僅為20%,與對照組相比,活性降低64%。而在0.001 mg·L-1和0.01 mg·L-1時,AgNPs明顯刺激了黃孢原毛平革菌的細胞活性,分別提高到71%和83%,即活性分別提高1.29倍與1.51倍,這表明,AgNPs的這種毒物興奮效應刺激黃孢原毛平革菌對環(huán)境中的不利因素做出抗性反應。

        圖2 不同暴露組對黃孢原毛平革菌活性的影響注:空白組為正常培養(yǎng)組,對照組為5 mg·L-1諾氟沙星脅迫組。Fig. 2 Effects of different groups of exposure on the cell viability of Phanerochaete chrysosporiumNote: Blank is normal cultured group; control is 5 mg·L-1 norfloxacin stress group.

        2.3 胞外蛋白濃度的變化

        AgNO3處理后的胞外蛋白質(zhì)濃度的變化情況如表1所示,與空白組對比分析,Ag離子的刺激致使胞外蛋白濃度出現(xiàn)不同程度的降低,且當AgNO3濃度從0.01 mg·L-1增加到6.5 mg·L-1,胞外蛋白質(zhì)濃度逐漸降低,說明Ag離子的增加導致胞外蛋白的消耗,同時表明Ag離子濃度的增加對黃孢原毛平革菌的毒性增加。而對于AgNPs處理組,如表2所示,胞外蛋白質(zhì)的濃度在較低濃度AgNPs的刺激下(0.001~0.01 mg·L-1)大部分高于對照組,這表明,低濃度AgNPs在外界脅迫下可以刺激細胞產(chǎn)生較多的胞外蛋白質(zhì)。在較高AgNPs濃度的刺激下,相比于同濃度的Ag離子處理組,胞外蛋白質(zhì)隨時間的增加消耗更多。

        2.4 溶液中總銀濃度的變化

        如圖3(a)所示,對于所有的實驗組,溶液中總銀濃度在前12 h大體呈現(xiàn)出降低的趨勢,這表明,AgNPs和其他形式的銀從溶液相遷移至生物相,且它們遷移得非常迅速,這可能是AgNPs會與黃孢原毛平革菌表面產(chǎn)生的生物大分子發(fā)生絡合作用或者與官能團結(jié)合,從而使溶液中總銀濃度下降[16]。而在12 h后,溶液中總銀濃度的變化差異性較大,在1.3 mg·L-1AgNPs的刺激下,其所有形式的銀繼續(xù)從溶液相遷移至生物相,導致溶液中總銀濃度緩慢下降,在108 h后的總銀濃度降至初始濃度的3%。在0.001、0.01和0.13 mg·L-1AgNPs的刺激下,其所有形式的銀反而從生物相遷移至溶液相,引起溶液中總銀濃度較快上升,并且初始濃度越低這種變化的趨勢越明顯,在108 h后總銀濃度為初始濃度的84%、68%和43%。

        如圖3(b)所示,AgNO3初始濃度從0.001 mg·L-1增加至1.3 mg·L-1,黃孢原毛平革菌對溶液中總銀的去除均達到95%以上??梢园l(fā)現(xiàn),在開始的12 h內(nèi),溶液中的總銀濃度基本上達到最低,而隨著AgNO3濃度的增大,吸附的速度越快,這種增加的趨勢可能是由于AgNO3濃度的增加使之有更大的驅(qū)動力克服黃孢原毛平革菌與液相之間的傳質(zhì)阻力,使得黃孢原毛平革菌與Ag離子之間的碰撞幾率更高,Ag離子更容易滲透到吸附位點,從而促進了總銀的吸附[15]。

        圖3 不同暴露組溶液中總銀濃度的變化Fig. 3 The total Ag concentration in solution in different exposure groups

        2.5 掃描電鏡的表征

        由圖4(a)可知,空白組中黃孢原毛平革菌的菌絲相互交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),且菌球表面的菌絲光滑、干凈,沒有任何顆粒狀的物質(zhì)附著在菌絲上,菌絲間有間隙,這樣的結(jié)構(gòu)有利于其對AgNPs的束縛。如圖4(b)所示,對照組明顯可見黃孢原毛平革菌的菌絲斷裂和菌球破裂,表面粘附有少量分泌物質(zhì),表明黃孢原毛平革菌的細胞受到諾氟沙星的嚴重損傷。如圖4(c)所示,用低劑量AgNPs處理后的菌絲體的菌絲體表面散落著少量的顆粒狀物質(zhì),部分AgNPs可通過細胞膜進入細胞。根據(jù)能譜分析(圖4(e)),確定菌絲表面的這些納米級別的顆粒物是與含硫蛋白質(zhì)結(jié)合的AgNPs。如圖4(d)所示,在AgNO3處理組中,黃孢原毛平革菌菌絲體表面附著著大量的晶體顆粒,根據(jù)能譜分析(圖4(f)),這些顆粒為納米級的氯化銀和硫化銀。

        圖4 黃孢原毛平革菌表面的掃描電鏡(SEM)圖和能量色散X射線光譜(EDX)分析注:(a)空白組;(b)對照組;(c)AgNPs處理組;(d)AgNO3處理組;(e)為(c)圖中標記區(qū)域的EDX;(f)為(d)圖中標記區(qū)域的EDX。Fig. 4 The scanning electron microscope (SEM) micrographs and energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) analysis of Phanerochaete chrysosporium surfacesNote: (a) blank group; (b) control group; (c) AgNPs treatment group; (d) AgNO3 treatment group; (e) EDX of denoted area in (c); (f) EDX of denoted area in (d).

        表1 不同濃度硝酸銀(AgNO3)對細胞外蛋白濃度的影響Table 1 Changes in extracellular protein concentrations at different concentrations of silver nitrate (AgNO3)

        表2 不同濃度AgNPs對細胞外蛋白濃度的影響Table 2 Changes in extracellular protein concentrations at different concentrations of AgNPs

        2.6 X射線衍射分析

        由圖5(b)可知,AgNO3處理組展示出強烈的X射線衍射(XRD)峰,這些2倍衍射角值分別隸屬于合成納米氯化銀晶體(111), (200), (220), (311), (222)和(400)晶面的特征衍射信號。反觀AgNPs處理組(圖5(a)),并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的硫化銀晶體晶面的特征衍射信號,但是掃描電鏡的能量色散X射線光譜(EDX)分析中可明顯看出有S元素存在,由此推測,菌絲表面的含硫基團并不能有效的束縛住AgNPs,AgNPs可從生物相轉(zhuǎn)移至液相。此外,經(jīng)AgNPs處理后黃孢原毛平革菌表面的XRD圖像顯示,在20°左右有明顯的衍射峰,這可能是由于合成的AgNPs微晶結(jié)構(gòu)的無序排列[17],這表明,低濃度的AgNPs在黃孢原毛平革菌和諾氟沙星共存體系中形成為一種典型的非晶態(tài)材料,這種無定形狀態(tài)可能也是AgNPs進出細胞的原因。

        圖5 AgNO3和AgNPs處理后黃孢原毛平革菌樣品的X射線衍射(XRD)圖譜Fig. 5 X-ray diffraction (XRD) pattern of Phanerochaete chrysosporium sample impregnated with AgNPs and AgNO3

        2.7 傅里葉紅外變換光譜分析

        圖6 (a)對照組、(b)AgNO3處理組和(c)AgNPs處理組中黃孢原毛平革菌的傅里葉紅外變換光譜(FTIR)圖Fig. 6 The Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) spectra of (a) control, (b) AgNO3-treated and (c) AgNPs-treated Phanerochaete chrysosporium

        3 討論(Discussion)

        在一定范圍內(nèi)(0.001~0.01 mg·L-1)的低劑量AgNPs不會對細胞產(chǎn)生不利影響,反而會增強細胞活性,抵抗環(huán)境中不利因素諾氟沙星的脅迫。AgNPs的這種毒物興奮效應可能是由于低濃度激活了毒性損傷的修復機制,這種修復過程可能對毒物的暴露進行過度補償,從而導致細胞活性顯著增加[23]。AgNO3處理組中,Ag離子濃度的增加使得黃孢原毛平革菌在諾氟沙星的脅迫下活性降低,高濃度的AgNPs可能也是通過氧化溶解釋放出大量Ag離子從而對細胞產(chǎn)生抑制作用。

        由于Ag離子以及諾氟沙星的毒性隨著暴露時間的增加而增強,使細胞產(chǎn)生較多的胞外蛋白質(zhì)保護細胞免受損傷,但在隨后的時間里,胞外蛋白質(zhì)可被黃孢原毛平革菌用作氮源而被消耗[15],使得其濃度隨著暴露時間的增加而降低。AgNPs可以觸發(fā)細胞生物學特性的變化,從而影響細胞的吸收和生物活性。此外,它們會引起結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和親和力的變化[24],從而促使黃孢原毛平革菌更好地應對環(huán)境中毒性物質(zhì)的脅迫。研究表明,AgNPs可以通過與蛋白質(zhì)相互作用來減輕抑制作用,胞外蛋白質(zhì)中含有羥基、氨基和羧基等多個官能團,這些官能團可以通過靜電斥力、空間位點以及溶劑化力與AgNPs相互作用[25]。AgNPs通過釋放Ag離子產(chǎn)生毒性[26],從而刺激真菌細胞產(chǎn)生更多的含硫蛋白質(zhì)和相關(guān)基團對環(huán)境中的Ag離子進行吸附結(jié)合,進而消耗胞外蛋白。

        在水生系統(tǒng)中,真菌表面的有機物質(zhì)能通過影響AgNPs的理化性質(zhì),改變其聚集沉降狀態(tài),從而影響AgNPs在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化、生物利用度及生物毒性等[27]。AgNPs可以通過胞吞作用積極地進入細胞[28],使其從溶液相進入生物相,又由于低劑量AgNPs濃度遠低于致死量反而刺激黃孢原毛平革菌將毒性物質(zhì)排出胞外,使得AgNPs又從生物相進入溶液相,最終維持一個較為穩(wěn)定的水平,較好地抵御外部不利因素。

        黃孢原毛平革菌表面所分泌的羥基、醛、酮和巰基等官能團能為Ag離子提供還原位點[29],使Ag離子轉(zhuǎn)化為納米硫化銀和納米氯化銀,由于膜屏障的作用,這些AgNPs顆粒在菌絲體上積累,并包覆住整個菌絲體,同時也驗證了溶液中所有形式的銀確實從溶液相遷移到黃孢原毛平革菌的菌絲表面。

        綜上所述,本研究表明:

        (1)AgNPs對諾氟沙星脅迫下的黃孢原毛平革菌活性具有低濃度刺激、高濃度抑制作用。AgNPs在0.001 mg·L-1和0.01 mg·L-1濃度下可以將黃孢原毛平革菌的細胞活性分別提高1.29倍與1.51倍,而在1.3 mg·L-1AgNPs的刺激下,細胞活性降低64%。相同濃度的Ag離子僅對細胞產(chǎn)生毒性抑制作用。

        (2)黃孢原毛平革菌利用并消耗其表面的蛋白質(zhì)來應對Ag離子產(chǎn)生的毒性。低濃度AgNPs可以觸發(fā)細胞生物學特性的變化,刺激細胞在面臨諾氟沙星脅迫時產(chǎn)生較多的胞外蛋白質(zhì),從而促使黃孢原毛平革菌更好地應對環(huán)境中毒性物質(zhì)的脅迫。

        (3)通過掃描電鏡以及能譜分析,并結(jié)合XRD和傅里葉紅外變換光譜分析,低劑量AgNPs可在溶液相與生物相之間進行遷移,其晶體在細胞表面呈無定形狀態(tài)。黃孢原毛平革菌的菌絲表面存在的羥基、醛、酮和巰基等官能團能為環(huán)境中Ag離子提供還原位點,還原成納米硫化銀和納米氯化銀顆粒,其被阻擋在細胞外,包覆住菌絲體。

        AgNPs的遷移轉(zhuǎn)化以及刺激胞外蛋白質(zhì)的產(chǎn)生讓我們對毒物興奮效應有了更深刻的認識,并且讓我們在應用AgNPs時,需要對低濃度AgNPs抗菌性重新審視,當AgNPs作為污染物進入環(huán)境時,AgNPs對抗生素諾氟沙星的抗菌性的影響也需要重新考量。此外,在此基礎(chǔ)上有必要進一步探究低濃度AgNPs對水環(huán)境中殘余抗生素的處理效果,為開發(fā)一種抗生素污染物的生物處理方法提供新思路。

        猜你喜歡
        諾氟沙星胞外離子
        硝化顆粒污泥胞外聚合物及信號分子功能分析
        牙膏中甲硝唑和諾氟沙星的測定 高效液相色譜法(GB/T 40189-2021)
        RP-HPLC法測定諾氟沙星葡萄糖注射液中乙二胺四乙酸二鈉的含量
        生物膜胞外聚合物研究進展
        服用諾氟沙星要多喝水
        保健與生活(2019年1期)2019-01-13 13:54:39
        水華期間藻類分層胞外聚合物與重金屬的相互作用機制研究
        在細節(jié)處生出智慧之花
        小議離子的檢驗與共存
        鋼渣對亞鐵離子和硫離子的吸附-解吸特性
        鋁離子電池未來展望
        国产真实夫妇交换视频| 人妻精品一区二区三区蜜桃| 先锋影音人妻啪啪va资源网站| 久久久国产精品黄毛片| 美女在线国产| 国产三级伦理视频在线| 97超碰精品成人国产| 在线观看精品视频网站| 日韩国产欧美视频| 亚洲一区二区观看网站| 久久久精品毛片免费观看| 国产狂喷潮在线观看| 欧美日韩电影一区| 人妻精品人妻一区二区三区四五| 国产精品国产三级国产专播下| 国产l精品国产亚洲区久久| 四虎欧美国产精品| 国产精品久久婷婷六月| 亚无码乱人伦一区二区| 国产av电影区二区三区曰曰骚网| 亚洲韩国在线| 亚洲av调教捆绑一区二区三区| 在线播放真实国产乱子伦| 色偷偷一区二区无码视频| 91色婷婷成人精品亚洲| 久久96日本精品久久久| 无遮挡h肉动漫在线观看| 久久久亚洲经典视频| 国产精品黄色在线观看| 性无码一区二区三区在线观看| 免费精品无码av片在线观看| 亚洲av综合日韩精品久久久| 精品国产亚洲av高清大片| 人妻中文无码久热丝袜| 国产精品原创av片国产日韩| 久久精见国产亚洲av高清热| 中文字幕人妻第一区| 国产亚洲欧美日韩综合一区在线观看 | 国产精品无码无片在线观看3D| 白色月光免费观看完整版| 久久婷婷五月综合色欧美|