李泓享，李琳琳，劉月華，務(wù)森，崔云惠，劉圓圓，朱紹成

食管癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其侵襲能力較強(qiáng)，近年來發(fā)病率為全球癌癥第七位，死亡率為全球第六位［1］，預(yù)后常常不良。我國食管癌發(fā)病率也在不斷提升，但是大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為中晚期，因此完善的術(shù)前診斷對(duì)于食管癌的檢出及臨床治療方案的制定、療效評(píng)估有重要的作用。研究表明血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和微血管密度（MVD）影響食管癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移，已經(jīng)成為評(píng)估食管癌患者生存率及療效的關(guān)鍵指標(biāo)［2－4］，同時(shí)也決定患者是否直接手術(shù)或先行輔助治療。

Le Bihan等［5］首次提出體素內(nèi)不相干運(yùn)動(dòng)（intravoxel incoherent motion，IVIM）解決了常規(guī)DWI序列不能較好體現(xiàn)出組織內(nèi)部水分子的運(yùn)動(dòng)這一問題，通過分離血管中水分子和組織中水分子，得到除表觀擴(kuò)散系數(shù)（ADC）以外的組織擴(kuò)散系數(shù)（D）、血管灌注相關(guān)擴(kuò)散系數(shù)（D＊）及灌注分?jǐn)?shù)（f），從而反映組織內(nèi)部灌注情況。IVIM－DWI現(xiàn)已應(yīng)用于多種疾病和器官研究［6－8］，IVIM主要用于食管癌分期、分級(jí)及療效評(píng)估［9－11］，而評(píng)價(jià)食管癌血管生成及預(yù)測(cè)免疫組化指標(biāo)方面的研究較少。本研究旨在分析IVIM定量參數(shù)與食管癌組織中VEGF和MVD表達(dá)的相關(guān)性，通過一種無創(chuàng)的影像學(xué)手段在術(shù)前預(yù)測(cè)出腫瘤內(nèi)部血管生成情況，為臨床制定和改進(jìn)診療方案提供有價(jià)值的參考。

材料與方法

1．病例資料

回顧性收集2017年3月－2019年5月行食管癌根治術(shù)的36例患者的病例資料，其中男28例，女8例，年齡55～77歲，平均（65．1±6．1）歲。36例中，低分化（G3）7例，中分化（G2）19例，高分化（G1）10例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)胃鏡證實(shí)為食管癌患者；②術(shù)前未行抗腫瘤輔助治療；③入院1周內(nèi)行常規(guī)MR序列及IVIM序列檢查；④均行手術(shù)治療并獲得病理結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：①M(fèi)R檢查禁忌癥患者；②MR圖像無法滿足后處理以及診斷要求。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018倫審69號(hào)），所有患者檢查前均簽署知情同意書。

2．檢查方法

采用美國GE Discovery 750 3．0TMR和8通道腹部線圈行胸部常規(guī)MR序列和IVIM序列掃描?；颊呷⊙雠P位，足先進(jìn)，掃描范圍自頸部至上腹部。常規(guī)MR序列參數(shù)：矢狀面抑脂T2WI：TR 8571．0ms，TE 85．1ms，矩陣288×288，視野30cm×30cm，層厚4．0mm，層間隔0．4mm，激勵(lì)次數(shù)2．5；橫軸面T2WI：TR 9231．0ms，TE 103．5ms，矩 陣288×288，視 野24cm×24cm，層厚4．0mm，層間隔0．4mm，激勵(lì)次數(shù)2；橫 軸 面 抑 脂T2WI：TR 10588．0ms，TE 103．1ms，矩陣288×288，視野24cm×24cm，層厚4．0mm，層間隔0．4mm，激勵(lì)次數(shù)2。軸面IVIM序列：b值選擇0、20、50、100、150、200、400、600、800、1000、1200s／mm2，TR 3158．0ms，TE 77．2ms，矩陣96×128，視野40cm×40cm，層厚5．0mm，層間隔0mm，激勵(lì)次數(shù)2。

3．圖像分析及數(shù)據(jù)采集

所有圖像傳送至GE后處理工作站（GE 4．6 Workstation），由兩位有5年以上MRI診斷經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師獨(dú)立對(duì)病變區(qū)域進(jìn)行測(cè)量，結(jié)合常規(guī)MRI序列圖像確定病灶范圍，將興趣區(qū)（region of interest，ROI）取定于病灶實(shí)性區(qū)，避開出血、食管管腔和壞死區(qū)域，連續(xù)測(cè)量3個(gè)層面，每層取3個(gè)ROI，面積為22～29mm2，測(cè)量并記錄ADC值、D值、D＊值和f值，取其平均值作為測(cè)量結(jié)果，再計(jì)算兩位醫(yī)生的平均數(shù)值用于后續(xù)分析。

4．病理免疫組化指標(biāo)檢測(cè)與判定

手術(shù)切除得到病理標(biāo)本固定后，采用石蠟包埋，以4μm厚度連續(xù)切片，通過免疫組化技術(shù)進(jìn)行CD34單克隆抗體染色檢測(cè)，視野下陽性信號(hào)為棕黃色，由一名有5年以上病理診斷經(jīng)驗(yàn)醫(yī)師進(jìn)行測(cè)量；VEGF表達(dá)通過細(xì)胞染色表達(dá)和陽性信號(hào)細(xì)胞所占總體百分?jǐn)?shù)得分之和計(jì)算［12］，染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，無染色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。細(xì)胞占比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，＜25%；1分，25%～50%；2分，50%～75%；3分，＞75%。MVD測(cè)定參考Weider等［13］的方法，先于低倍鏡（×100）下尋找三個(gè)“熱點(diǎn)”，即微血管數(shù)量較多區(qū)域，再由高倍鏡（×400）下分別計(jì)數(shù)，取其平均值為MVD。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19．0軟件以及Medcalc 11．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示。采用Bland－Altman評(píng)價(jià)IVIM參數(shù)值一致性，并計(jì)算組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC，intraclass correlation coefficient）。采 用Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)比較不同病理分級(jí)間IVIM各參數(shù)差異。采用Spearman秩相關(guān)分析評(píng)價(jià)食管癌IVIM各參數(shù)值與VEGF、MVD表達(dá)以及病理分級(jí)的相關(guān)性。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．食管癌IVIM各參數(shù)值與VEGF和MVD的相關(guān)性

食管癌組織VEGF總得分為（5．556±0．695）分，MVD測(cè)量值為（37．389±22．360），ADC值為（1．562±0．379）×10－3mm2／s，D值 為（0．942±0．285）×10－3mm2／s，D＊值為（20．394±9．686）×10－3mm2／s，f值為（0．505±0．109）（圖1、2）。D＊值與VEGF呈正相關(guān)（r＝0．335，P＝0．046），ADC值、D值及f值與VEGF均無相關(guān)性（P＞0．05）；D＊值及f值與MVD呈正相關(guān)（r＝0．374、0．387，P＝0．024、0．020，圖3），ADC值及D值與MVD均無相關(guān)性（P＞0．05），見表1。兩位醫(yī)師測(cè)量的的ADC值、D值、D＊值及f值測(cè)量一致性均較好（ICC＝0．879、0．844、0．811、0．769）。

2．食管癌IVIM各參數(shù)值與病理分級(jí)的相關(guān)性

ADC值和D值與食管癌病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．630，P＜0．01；r＝－0．707，P＜0．01），隨著腫瘤病理分化程度升高，腫瘤ADC值與D值也會(huì)升高。食管癌D＊值與f值與病理分級(jí)無相關(guān)性（r＝－0．113、－0．156，P＝0．511、0．362），見表2。

表1 IVIM參數(shù)與VEGF和MVD的相關(guān)性

圖1 女，66歲，胸中段食管癌。a）IVIM序列，病灶呈明顯高信號(hào)，選取合適層面勾畫ROI；b）D值偽彩圖，病灶呈藍(lán)色信號(hào)，病灶D值 為0．97×10－3 mm2／s；c）D＊值 偽 彩 圖，病灶呈藍(lán)色信號(hào)，病灶D＊值為16．1×10－3 mm2／s；d）f值偽彩圖，病灶呈紅色信號(hào)，病灶f值為0．502；e）免疫組化VEGF表達(dá)評(píng)分為5分（×400）；f）免疫組化MVD值為9（×400）。

圖2 男，60歲，胸中段食管癌。a）IVIM序列，食管管壁增厚，病灶呈高信號(hào)，選取合適層面勾畫ROI；b）D值偽彩圖，病灶呈藍(lán)色信號(hào)，病灶D值為0．89×10－3 mm2／s；c）D＊值偽彩圖，病灶呈藍(lán)色信號(hào)，病灶D＊值為18．5×10－3 mm2／s；d）f值偽彩 圖，病灶呈紅色信號(hào)，病灶f值為0．478；e）病 理 免 疫 組 化VEGF表達(dá)評(píng)分為5分（×400）；f）病理免疫組化MVD值為26（×400）。

表2 IVIM參數(shù)與食管癌病理分級(jí)的相關(guān)性

討 論

1．食管癌VEGF及MVD的臨床意義

食管癌在我國是發(fā)病率和死亡率都較高的消化道惡性腫瘤，其早期發(fā)病不易被發(fā)現(xiàn)，手術(shù)切除是最常見的治療方案，但van Hagen等［14］研究證實(shí)術(shù)前行新輔助放化療患者的腫瘤切除率、病理完全緩解率及遠(yuǎn)期生存率均高于直接手術(shù)者；此外Li等［15］發(fā)現(xiàn)靶向治療藥物可以抑制VEGF刺激的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)降低腫瘤的MVD。

目前VEGF和MVD常用于腫瘤血管生成定量指標(biāo)，VEGF是刺激細(xì)胞分裂的生物因子，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及增加血管通透性來加快血管生成［16］，在血管生成整個(gè)過程中都尤為重要；MVD反映了組織內(nèi)微血管數(shù)量，可用來評(píng)估腫瘤血管生成活性及狀態(tài)，是腫瘤血管生成評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)，Nakagawa等［17］研究發(fā)現(xiàn)MVD所呈現(xiàn)出的的腫瘤內(nèi)部血管生成情況與腫瘤發(fā)展過程中的病理參數(shù)有較好的相關(guān)性。因此MVD越高，腫瘤更容易發(fā)展和轉(zhuǎn)移。目前免疫組化指標(biāo)的獲取多依賴于術(shù)后病理或活檢進(jìn)行測(cè)定，不能在術(shù)前或放化療過程中及時(shí)反映，因此通過一種無創(chuàng)的影像學(xué)手段預(yù)測(cè)得到食管癌組織中的血管生成情況有著重要的意義，對(duì)于預(yù)測(cè)的VEGF和MVD指標(biāo)較高的患者，其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較高，可以在術(shù)前或放化療過程中給予抗血管生成的藥物，從而有效的提高療效和改善預(yù)后。

圖3 a）食管癌組織D＊與MVD的相關(guān)性；b）食管癌組織f與MVD的相關(guān)性。

2．食管癌IVIM定量參數(shù)與病理免疫組化指標(biāo)的相關(guān)性

IVIM是功能磁共振成像，其灌注相關(guān)參數(shù)反映了組織內(nèi)單純水分子擴(kuò)散效應(yīng)和毛細(xì)血管灌注效應(yīng)［6］，李筱倩等［18］研究發(fā)現(xiàn)IVIM部分參數(shù)在食管癌診斷中有價(jià)值，可以反映腫瘤內(nèi)部血流灌注信息。本研究中食管癌組織VEGF與D＊值呈正相關(guān)，由于VEGF增多促使腫瘤內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，生成更多的毛細(xì)血管，因此組織內(nèi)灌注增加；而VEGF與ADC值、D值及f值無相關(guān)性，筆者認(rèn)為是由于病灶內(nèi)腫瘤組織不斷增多，緊密排列致使水分子擴(kuò)散受限，D值反映了組織內(nèi)水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，但是由于腫瘤血管分布的異質(zhì)性，會(huì)造成受限程度有所差別，f值為組織內(nèi)部灌注分?jǐn)?shù)，食管癌組織內(nèi)有豐富的毛細(xì)淋巴管網(wǎng)［19］，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此其內(nèi)部包含毛細(xì)血管灌注及淋巴管灌注［20］，同時(shí)一部分新生血管無成熟管腔，導(dǎo)致血管灌注比例有所下降，另外有研究表明松弛效應(yīng)及組織學(xué)分級(jí)對(duì)f值也存在一定影響［21］，這可能也是造成VEGF與f值無相關(guān)性的原因。

本研究中MVD與D＊值和f值呈正相關(guān)，這與Lee等［22］對(duì)裸鼠直腸癌的研究結(jié)果相近，這是由于D＊值與f值反映的是組織內(nèi)血流灌注情況，同時(shí)D＊值與平均血流速度相關(guān)，反映腫瘤血管的血流量，因此組織內(nèi)微血管數(shù)量越多，組織內(nèi)灌注越豐富；而MVD與ADC值及D值無相關(guān)性，原因可能是ADC值和D值體現(xiàn)的是組織內(nèi)部水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，對(duì)于ADC值及D值較高的腫瘤，其腫瘤細(xì)胞增殖以及新生血管的增加都有可能造成水分子運(yùn)動(dòng)受限，因此不能較好的反映出內(nèi)部微循環(huán)信息。目前關(guān)于食管癌IVIM參數(shù)與VEGF和MVD相關(guān)性的研究較少，因此還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。同時(shí)本研究結(jié)果顯示食管癌IVIM參數(shù)中，ADC值與D值與食管癌病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，由于ADC值及D值反映的是腫瘤內(nèi)部水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)受限程度，當(dāng)食管癌病理分級(jí)增加，腫瘤分化程度較差，生長速度較快，內(nèi)部腫瘤細(xì)胞基質(zhì)增多，水分子受限更加明顯，ADC值及D值相應(yīng)減少，這與魏毅等［23］采用IVIM參數(shù)研究肝細(xì)胞癌分級(jí)結(jié)果相似。而D＊值和f值與病理分級(jí)無相關(guān)性，原因可能是D＊值和f值雖然可以反映腫瘤內(nèi)部灌注情況，但食管癌因其不同解剖位置腫瘤供血來源不同［9］，腫瘤內(nèi)部灌注情況會(huì)有所差別，因此不能較好反映不同病理分級(jí)間食管癌差異。

3．本研究的局限性

本研究方法中存在一些局限：①研究中所采納的樣本數(shù)偏少；②病例的選擇沒有對(duì)不同分期、分級(jí)和病理類型的腫瘤進(jìn)行分組研究；③ROI的勾畫與免疫組化取材的部位無法保證完全一致，會(huì)造成一定的選擇偏倚。

綜上所述，通過食管癌IVIM定量參數(shù)與VEGF和MVD相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，VEGF與D＊值正相關(guān)，MVD與D＊值及f值呈正相關(guān)，ADC值與D值與食管癌病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。因此D＊值可以用于術(shù)前預(yù)測(cè)腫瘤組織的VEGF指標(biāo)，D＊值及f值可以在術(shù)前預(yù)測(cè)腫瘤組織內(nèi)MVD指標(biāo)。IVIM部分參數(shù)可以無創(chuàng)反映腫瘤內(nèi)部血管生成情況以及病理分化程度，從而在術(shù)前及治療過程中預(yù)測(cè)VEGF和MVD表達(dá)情況，對(duì)臨床制定治療策略以及評(píng)估預(yù)后具有重要的參考價(jià)值。