路雙，張宏凱，賈爭(zhēng)艷，趙妍，秦建軍，曲金榮

食管癌就診時(shí)大多處于中晚期，預(yù)后不良，目前食管癌主要治療方法為手術(shù)根治，但術(shù)后五年生存率僅為15%～25%［1］，主要為不明原因的轉(zhuǎn)移。近年來發(fā)現(xiàn)食管癌生物學(xué)行為不同，相應(yīng)的分化程度也不同，食管癌病理分級(jí)是影響腫瘤預(yù)后的獨(dú)立因素［2－3］，術(shù)前對(duì)其準(zhǔn)確的評(píng)估，對(duì)于食管癌個(gè)性化治療方案有很重要的意義。擴(kuò)散加權(quán)成像（diffusion weighted imaging，DWI）是在水分子的遷移狀態(tài)基礎(chǔ)上來確定水分子在組織中自由擴(kuò)散的程度，可用表觀擴(kuò)散系數(shù)（apparent diffusion coefficient，ADC）值來量化。ADC主要受細(xì)胞大小、密度、包膜完整性的影響。正常細(xì)胞由于腫瘤細(xì)胞的侵襲，失去完整的包膜，因此ADC值升高。ADC值近年來已經(jīng)成為腫瘤治療反應(yīng)的潛在標(biāo)志物［4－6］。外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）為腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)腫瘤進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)［7］，CTCs與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、療效評(píng)估、預(yù)后判斷有關(guān)，已被認(rèn)為是食管癌預(yù)后不良獨(dú)立危險(xiǎn)因素［8－10］。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是一個(gè)復(fù)雜的過程，為CTCs攜帶的上皮相關(guān)成分減少，而間質(zhì)相關(guān)成分增多，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)換，EMT與腫瘤的侵襲和播散關(guān)系密切［11－13］。以往的研究已經(jīng)證明ADC值的大小以及CTCs值可以在一定程度上反應(yīng)食管癌病理分級(jí)［14－15］，但是二者之間的關(guān)系尚未研究，本文旨在探討二者對(duì)低分化食管鱗癌診斷效能以及兩者聯(lián)合與食管癌病理分級(jí)的關(guān)系。

材料與方法

1．臨床資料

收集2016年11月－2018年5月河南省腫瘤醫(yī)院符合以下條件的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)活檢病理證實(shí)為食管癌患者；②檢查前未接受抗腫瘤治療；③所有患者最終均行食管癌根治術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①活檢病理證實(shí)為非鱗癌患者；②未行MRI檢查；③MRI圖像質(zhì)量不能滿足要求；④病變最大層面面積＜10mm2。

共收集81例患者，排除6例食管非鱗癌患者、5例圖像質(zhì)量不能滿足診斷要求及2例病變最大層面較小難以勾畫者，最終68例食管鱗癌患者納入本研究，男50例，女18例，年齡42～74歲，平均（61±8）歲。42例患者直接行食管癌根治術(shù)，26例局部進(jìn)展期食管癌患者（cT1－4aN＋M0或cT3－4aN0M0），先行兩周期新輔助化療，評(píng)估可手術(shù)后行食管癌根治術(shù)。

2．MRI檢查方法

采用Siemens Skyra3．0TMRI和體部18單元相控陣線圈進(jìn)行掃描。禁食6h，掃描前15～20min肌注鹽酸消旋山莨菪堿注射液緩解食管蠕動(dòng)。掃描前患者常規(guī)訓(xùn)練呼吸，取仰臥位，足先進(jìn)。常規(guī)掃描屏氣T2WI冠狀面、矢狀面及T2抑脂序列，T2抑脂序列層厚5mm，TR6097．44ms，TE96．00ms，矩陣226×384，視野273mm×380mm；屏氣T1WI正反相位，層厚3mm，TR2．7ms，TE0．9ms，矩陣224×384，視野248mm×360mm；自由呼吸放射狀K空間填充方式的容積內(nèi)插體部檢查（Radial volumetric interpolated breath－h(huán)old examination，Radial－VIBE）序列，層厚2．5mm，TR3．87ms，TE1．78ms，矩陣288×288，視野380mm×380mm；膈肌導(dǎo)航的應(yīng)用刀鋒采集技術(shù)的快速自旋回波T2WI（BLADE－TSE－T2WI）序列，層厚3mm，TR4029．08ms，TE97．00ms，矩陣256×256，視野240mm×240mm；擴(kuò)散加權(quán)成像（DWI）序列，層厚5mm，TR5700．00ms，TE54．00ms，矩陣88×128，視野261mm×380mm，b值分別為50，700s／mm2。

3．磁共振圖像處理及分析

由兩名具有5年以上食管磁共振診斷經(jīng)驗(yàn)的放射醫(yī)師對(duì)MRI圖像質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分［16］，采用雙盲法對(duì)術(shù)前MRI共同診斷，聯(lián)合DWI、BLADE－TSE－T2WI及Radial－VIBE序列，在Neusoft PACS上ADC序列中選取腫瘤實(shí)性成分最多且面積最大的層面及其上下兩個(gè)層面，避開腫瘤內(nèi)壞死、囊變區(qū)域，所勾畫ROI面積不低于腫瘤實(shí)性成分最大層面的90%，兩名醫(yī)師勾畫時(shí)間間隔一周，最終以兩名醫(yī)師求得平均值作為最終結(jié)果（圖1）。新輔助治療患者，勾畫和大體病理時(shí)間一致的治療后MRI圖像，以確保測(cè)量ADC值的準(zhǔn)確性。ROI的面積為15～200mm2。

4．外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞采集及處理

入組患者術(shù)前空腹采集5mL靜脈血于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，保存于4℃冰箱中，運(yùn)用Can－Patrol CTCs分離富集技術(shù)，采用多重RNA標(biāo)記間質(zhì)細(xì)胞（vimentin和TWIST1）和上皮細(xì)胞（EpCAM和CK8／18／19）的特異性標(biāo)志物以此將CTCs分為上皮型（E＋）、混合型（E＋／M＋）、間質(zhì)型（M＋）［17－18］，分別表示為紅色熒光、紅色和綠色混合熒光、綠色熒光（圖2）。

5．新輔助化療方案

對(duì)于進(jìn)展期可切除性食管鱗癌，采用紫杉醇＋奈達(dá)鉑進(jìn)行兩周期新輔助化療后重新評(píng)估后手術(shù)，化療一周期時(shí)間為7天，化療方案為：紫杉醇聯(lián)合奈達(dá)鉑，前三天靜脈滴注奈達(dá)鉑（30mg／m2），第1天及第7天靜脈滴注紫杉醇（70mg／m2）；第一周期化療結(jié)束后間隔兩周后繼續(xù)用相同化療方案進(jìn)行第二周期化療，第二周期化療結(jié)束兩周后即進(jìn)行術(shù)前食管MRI掃描。

6．病理結(jié)果

由兩名高年資病理科醫(yī)師采用雙盲法按照世界衛(wèi)生組織對(duì)食管癌手術(shù)病理結(jié)果進(jìn)行分級(jí)，分為高分化（G1）、中分化（G2）、低分化（G3），低分化預(yù)后較中分化及高分化差［19］，并對(duì)腫瘤局部浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分析。

7．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采 用SPSS 21．0、MedCalc 18．11和GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用Shapiro－Wilk檢驗(yàn)其正態(tài)性，服從正態(tài)分布的資料采用表示，不服從正態(tài)分布的資料采用中位數(shù)及四分位數(shù)間距表示。采用Bland－Altman分析兩名磁共振診斷醫(yī)師所得ADC值的一致性，并計(jì)算其組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（intraclass correlation coefficient，ICC）。采用Mann－Whitney U檢驗(yàn)、Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較不同病理分級(jí)、不同病理T分期、病理N分期間ADC值、CTCs總數(shù)及各亞型數(shù)目的差異。采用Spearman秩相關(guān)分析比較病理分級(jí)與ADC值及CTCs值的相關(guān)性。采用受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線及曲線下面積（area under curve，AUC）評(píng)價(jià)ADC值、CTCs總數(shù)及其各亞型數(shù)目對(duì)低分化食管鱗癌的診斷及預(yù)測(cè)能力，采用Z檢驗(yàn)比較有效參數(shù)AUC。以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

68例食管鱗癌患者中未經(jīng)過任何治療直接手術(shù)的42例，經(jīng)過2周期新輔助化療后手術(shù)者26例。病理結(jié)果顯示高分化5例，中分化43例，低分化20例。兩名磁共振診斷醫(yī)師所得到ADC值組內(nèi)相關(guān)性均較好，所得ICC值為0．877，P值＜0．001。兩名醫(yī)師分別對(duì)圖像質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分，一致性較好（表1）。

不同病理分級(jí)間ADC值、CTCs總數(shù)及M＋CTCs差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。其中，ADC值與病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．677，P＜0．001）；CTCs總數(shù)、M＋CTCs與病理分級(jí)均呈正相關(guān)（P均＜0．05），ADC值與CTCs各亞型之間無相關(guān)性（P＞0．05）。G1組M＋CTCs、CTCs總數(shù)低于G3組，G1組ADC值高于G3組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0．05）；G3組與G2組中M＋CTCs、ADC值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；G1與G2組CTCs總數(shù)及ADC值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖3）。

68例食管鱗癌患者ADC值、CTCs總數(shù)及各亞型數(shù)目在不同病理T分期、病理N分期、臨床分期、腫瘤位置間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。從ADC和CTCs亞型診斷低分化食管鱗癌的ROC曲線AUC可知，ADC（AUC＝0．870，P＜0．001）、M＋CTCs（AUC＝0．690，P＜0．05）對(duì)于診斷低分化食管鱗癌有一定的價(jià)值，CTCs總數(shù)診斷低分化食管鱗癌的效能差（P＞0．05）。采用Z檢驗(yàn)比較AUC可知，ADC值診斷效能優(yōu)于M＋CTCs（Z＝2．25，P＜0．05）。采用二元logistic回歸分析聯(lián)合ADC及M＋CTCs診斷低分化食管鱗癌的效能（AUC＝0．873，P＜0．001）優(yōu)于單一因素診斷效能（表3，圖4）。

表1 兩名放射科醫(yī)師圖像質(zhì)量評(píng)分表

表2 ADC及CTCs各類型組間差異性分析

表3 ADC和M＋CTCs聯(lián)合因素和單一因素診斷效能Z檢驗(yàn)

討 論

1．ADC及CTCs對(duì)不同病理分級(jí)的診斷

本研究結(jié)果顯示，腫瘤組織ADC值與病理分級(jí)呈正相關(guān)，CTCs值及亞型有效數(shù)目與病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)前ADC值聯(lián)合間質(zhì)型CTCs可以有效預(yù)測(cè)食管鱗癌的病理分級(jí)，為患者提供有效的個(gè)體化治療方案。

本研究選取手術(shù)大病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)選取相同時(shí)間點(diǎn)的MRI及CTCs結(jié)果，確保了數(shù)據(jù)時(shí)間點(diǎn)的一致性。對(duì)于入組的新輔助治療患者，新輔助治療可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的核固縮、破裂，癌細(xì)胞不同程度的變性、壞死，從而使腫瘤的病理分期降級(jí)，腫瘤的病理分級(jí)也發(fā)生不同程度的變化。因此，對(duì)于新輔助治療患者，本研究選取的為治療后及術(shù)前的MRI進(jìn)行ROI的勾畫，確保了測(cè)量ADC的準(zhǔn)確性，同時(shí)也確保了和手術(shù)大病理時(shí)間的一致性。

圖1 男，44歲，胸中段食管鱗癌，中分化，侵及肌層，外膜 仍 然 連 續(xù)（T2）。a）BLADE－TSE－T2WI圖 像，病變呈稍高信號(hào)（箭）；b）Radial－VIBE序 列 圖 像，病變可見強(qiáng)化（箭）；c）DWI圖像，病變呈高信號(hào)（箭）；d）ADC圖像，病變呈低信號(hào)（箭）。 圖2 食管鱗癌患者血樣中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物表達(dá)。a）上皮型CTCs（E＋CTCs）；b）混合型CTCs（E＋／M＋CTCs）；c）間質(zhì)型CTCs（M＋CTCs）。

圖3 不同病理分級(jí)間各參數(shù)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、Mann－Whitney U檢驗(yàn)結(jié)果。a）E＋CTCs組間結(jié)果；b）E＋／M＋CTCs組間結(jié)果；c）M＋CTCs組間結(jié)果；d）CTCs總數(shù)組間結(jié)果；e）ADC值組間結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，腫瘤高、中分化組ADC值顯著高于低分化組ADC值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腫瘤分化程度越低，ADC值越低，說明水分子擴(kuò)散受限程度明顯。分析原因可能為：腫瘤分化程度低，惡性程度高，腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性越明顯，腫瘤細(xì)胞核質(zhì)比增大，致使腫瘤細(xì)胞體積增大，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞外間隙減小，水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)受限，相關(guān)ADC值減小。這與［14，20］以往研究結(jié)果一致，認(rèn)為ADC值可以反應(yīng)食管鱗癌及胃癌病理分化程度，其隨著分化程度的增加相應(yīng)ADC值增大。食管本身屬于空腔臟器，且容易受鄰近大血管及心臟搏動(dòng)的影響，因此選擇b值方面尤為重要。

圖4 a）ADC值診斷低分化食管鱗癌交互式散點(diǎn)圖；b）M＋CTCs診斷低分化食管鱗癌交互式散點(diǎn)圖。

b值越高，DWI對(duì)腫瘤組織內(nèi)水分子擴(kuò)散越敏感，排除T2穿透效應(yīng)的影響，更好的反應(yīng)腫瘤的內(nèi)部特征［21］。但是，b值越高，圖像的信噪比會(huì)下降，對(duì)病變的檢出敏感度下降。b值比較低時(shí)，圖像分辨率較高，但是對(duì)水分子擴(kuò)散的敏感性會(huì)下降［22］。因此本文選擇b值為700s／mm2。以往的研究證明ADC值可以有效的預(yù)測(cè)食管癌的T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況［23，24］，但是本文結(jié)果與之不同，分析原因可能為，ADC值主要受細(xì)胞及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的致密程度影響，但腫瘤的浸潤深度，轉(zhuǎn)移情況還受腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、代謝生化等多種混合因素影響，因此結(jié)果存在一定的偏差［25］；另外，文獻(xiàn)報(bào)道ADC值之間差異較大，可能受MRI的型號(hào)、磁場(chǎng)強(qiáng)度的影響，還會(huì)受腫瘤周圍組織的影響［26］。本研究結(jié)果中進(jìn)展期食管癌病變較大，內(nèi)部腫瘤實(shí)性成分結(jié)構(gòu)相對(duì)混雜，可能混合有肉眼無法辨別的小壞死及纖維結(jié)構(gòu)，因此ADC值相對(duì)較高。

本研究結(jié)果顯示CTCs總數(shù)及間質(zhì)型CTCs與腫瘤病理分級(jí)相關(guān)，高分化組CTCs值顯著低于中／低分化值CTCs，腫瘤分化程度越高，惡性程度越低，相應(yīng)CTCs值越少，預(yù)后越好。這與劉濤等［15］研究結(jié)果一致，其研究證明CTCs數(shù)目與食管鱗癌腫瘤分化程度，浸潤深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。說明食管癌外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量可以在一定程度上反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展程度，通常來說，疾病治療效果欠佳或疾病治療后處于進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量將會(huì)增多［27］，患者預(yù)后將會(huì)變差。目前也有研究結(jié)果表明CTCs在乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中在腫瘤微轉(zhuǎn)移、預(yù)后檢測(cè)有重要的意義，可能是監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在替代標(biāo)志物，最新NCCN乳腺癌指南（2017．V3）已將CTCs納入TNM分期系統(tǒng)［28－30］。因此動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞，可以在腫瘤播散前，及時(shí)調(diào)整個(gè)體治療方案，以此來改善腫瘤患者預(yù)后效果。

2．ADC及CTCs對(duì)低分化食管鱗癌診斷效能

本研究結(jié)果顯示，腫瘤病變區(qū)ADC＞1．711×10－3mm2／s時(shí)，其診斷非低分化食管鱗癌的效能優(yōu)于間質(zhì)型CTCs，可見DWI可以在分子水平上更早的顯示腫瘤組織的超微結(jié)果。本文采用CanPatrolTM CTC－二代富集技術(shù)分離富集CTCs，采用RNA－ISH技術(shù)將CTCs精確分型，根據(jù)ROC結(jié)果分析可知，間質(zhì)型CTCs診斷低分化食管鱗癌的效能較好。這與以往學(xué)者證明的間質(zhì)型CTCs與腫瘤的預(yù)后和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［31，32］，Han等［33］也認(rèn)為，間質(zhì)型CTCs及混合型CTCs是食管癌預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究聯(lián)合ADC值及間質(zhì)型CTCs診斷低分化食管鱗癌效能優(yōu)于單一因素診斷效能，王準(zhǔn)等［34］也研究了，食管癌DWI與食管癌組織Sirtuin1（SIRT1）蛋白表達(dá)相關(guān)，其兩者可以有效預(yù)測(cè)食管癌的輻射抵抗。將影像結(jié)果和臨床結(jié)果相結(jié)合，更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)食管鱗癌的病理分級(jí)，有效指導(dǎo)臨床治療。

3．本研究的局限性

第一，在世界范圍內(nèi)食管癌主要類型是食管鱗癌，然而現(xiàn)在歐美國家食管腺癌發(fā)病率逐漸超過食管鱗癌［1］，我國主要病理類型為食管鱗癌，因此入組患者選擇食管鱗癌，未選擇食管腺癌或者其他類型食管癌。第二，由于入組患者均需手術(shù)獲得病理結(jié)果，而且同時(shí)需具有CTCs檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于無法進(jìn)行手術(shù)者則不能歸入；而且CTCs檢測(cè)及食管MRI檢查目前尚不是食管癌常規(guī)檢查手段，因此納入病例只有68例，各組病理分級(jí)樣本相對(duì)較少。第三，DWI可以定量區(qū)分腫瘤實(shí)性組織和腫瘤組織中的壞死部分，但是圖像容易受b值影響，因此本研究選擇b為700s／mm2，且入組數(shù)據(jù)均經(jīng)過圖像質(zhì)量評(píng)估，勾畫ROI時(shí)結(jié)合了BLADETSE－T2WI及radial－VIBE序列，有效的提高了ROI勾畫的準(zhǔn)確性。

綜上所述，ADC、M＋CTCs與食管鱗癌的病理分級(jí)相關(guān)，且ADC值診斷效能優(yōu)于M＋CTCs診斷效能，兩者之間是獨(dú)立不相關(guān)的；聯(lián)合兩者有效因素診斷診斷效能更佳。