宋冉

疫情之下，基因療法賽道持續(xù)火熱。有業(yè)內(nèi)人士認(rèn)為，基因療法即將“引領(lǐng)生物醫(yī)藥的第三次產(chǎn)業(yè)革命”，會(huì)成為繼化學(xué)小分子藥物、生物大分子藥物之后的第三代治療藥物。

不過，基因治療始終繞不過的一道坎就是遞送，遞送技術(shù)是打開基因治療大門的“鑰匙”。

常用的遞送工具有 AAV、LNP、外泌體等，其中 AAV 是基因治療臨床上最常用的載體技術(shù)，也是 FDA 批準(zhǔn)上市的基因治療藥物中最安全的病毒載體之一?，F(xiàn)在，有超過2/3的基因療法公司都在使用 AAV 作為遞送工具。究其本原是因?yàn)?AAV 是非致病性的，而且可以有效靶向組織和器官。

然而，正如硬幣的正反面一樣，AAV 亦有其兩面性，正所謂成也病毒，敗也病毒。有臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，基因治療載體 AAV 會(huì)引起強(qiáng)烈的天然免疫反應(yīng)，這可能會(huì)降低治療效果，甚至引發(fā)嚴(yán)重的副作用。2020 年發(fā)生了3例由于高劑量用藥而引發(fā)的基因療法致死案例，雖然現(xiàn)在還沒有證據(jù)證明始作俑者是免疫原性，但是卻引發(fā)了人們對(duì)于 AAV 載體安全性的擔(dān)憂。

George Church 教授及其學(xué)生Ying KaiChan

過度免疫反應(yīng)是基因治療的一大挑戰(zhàn)，科學(xué)家們一直在尋求優(yōu)化和改進(jìn) AAV 載體，降低免疫反應(yīng)。

近日，由“當(dāng)代基因組學(xué)教父” George Church 領(lǐng)銜的哈佛團(tuán)隊(duì)在 Science Translational Medicine 發(fā)表了一項(xiàng) AAV 載體的最新研究。研究顯示，他們利用“偶聯(lián)免疫調(diào)節(jié)”（coupled immunomodulation）開發(fā)了一種“更安全”的 AAV 載體，這種經(jīng)工程化修飾的 AAV 載體可以明顯減少炎癥和 T 細(xì)胞反應(yīng)，同時(shí)改善小鼠和豬模型中的基因表達(dá)。

Ying Kai Chan 告訴生輝：“ 在基因療法臨床試驗(yàn)中，減低或者消除免疫反應(yīng)難題的常用策略是服用免疫抑制性藥物，包括全身用糖皮質(zhì)激素或者減少病毒載體中的 CpG。我們的方法利用了合成生物學(xué)思維，采用了‘即插即用的方式，將人體內(nèi)發(fā)揮免疫監(jiān)視作用的基因片段插入 AAV 載體 DNA 序列中，幫助 AAV 實(shí)現(xiàn)‘隱身。”他是 George Church 的學(xué)生，也是這項(xiàng)研究的第一作者。

George Church、Ying Kai Chan 等成立了一家基因療法公司 Ally Therapeutics，專注于破解 AAV 免疫原性難題，開發(fā)“更安全”的 AAV 載體及其基因療法。

Crunchbase 的數(shù)據(jù)顯示，公司成立伊始，便獲得了美國生命科學(xué)領(lǐng)域知名風(fēng)投機(jī)構(gòu) Arch Venture Partners、Alta Partners，和企業(yè)戰(zhàn)略風(fēng)險(xiǎn)投資基金 UCB Ventures 的種子輪融資。

給 AAV 穿上“隱身衣”

模式識(shí)別受體 —— Toll 樣受體（TLR）是一類跨膜受體，在機(jī)體免疫活動(dòng)中扮演重要角色。目前，在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)了 11 個(gè) TLR 家族成員，其中機(jī)理較為清楚的是 TLR2、TLR4、TLR5 和 TLR9。

基因治療先驅(qū)詹姆斯威爾遜（James Wilson）最先證明了當(dāng) AAV 載體進(jìn)入人體細(xì)胞中，人體可以通過一組 TLR 對(duì) AAV 做出反應(yīng)?？梢哉f TLR 是 AAV 載體進(jìn)入人體細(xì)胞后引發(fā)過度免疫反應(yīng)的“幕后推手”。

具體來說，當(dāng) AAV 載體進(jìn)入人體細(xì)胞后，體內(nèi)抗原提呈細(xì)胞 DC 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，通過模式識(shí)別受體 TLR9、TLR2 等檢測(cè)識(shí)別 AAV 載體上的病原體相關(guān)分子模式，并激活下游的相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥和致敏等過度免疫反應(yīng)。比如血液中的漿細(xì)胞樣 DC（pDC）、肝臟中的庫普弗細(xì)胞（Kupffer cell）的 TLR9 可以識(shí)別 AAV 基因組核酸。

詹姆斯威爾遜把 TLR 比作是天然免疫的“哨兵”，TLR 能夠監(jiān)視與識(shí)別各種不同的病原體相關(guān)分子模式（PAMP）。這些“哨兵”是免疫系統(tǒng)的第一道防線，如果它們發(fā)現(xiàn)任何抗原，就會(huì)立刻發(fā)出警報(bào)。這就意味著，正常細(xì)胞需要一種方法來告訴 TLR 受體自己是安全的，無需啟動(dòng)防御系統(tǒng)。

George Church、Ying Kai Chan 等哈佛團(tuán)隊(duì)正是通過抑制 TLR9 的激活，實(shí)現(xiàn)了 AAV 載體的 “隱身 ”。

在研究中，我們以“即插即用 ”的方式 TLR9 抑制序列整合到 AAV2 血清型病毒載體中，當(dāng) AAV 進(jìn)入體內(nèi)后，這些基因序列會(huì)與體內(nèi)的 TLR 受體結(jié)合，并告訴這些受體無需啟動(dòng)免疫警報(bào)系統(tǒng)，這樣就相當(dāng)于給 AAV2 穿上了‘隱身衣。這種‘隱身的 AAV 也可以稱為 AAV2.0，進(jìn)入體內(nèi)后可以減輕天然免疫和炎癥反應(yīng)，甚至增加有效載荷的表達(dá)。

在論文中研究人員們寫道：“這種‘偶聯(lián)免疫調(diào)節(jié)策略可以實(shí)現(xiàn)‘即插即用，可能為不同的 AAV 基因治療提供一種通用的、廣泛適用的解決方案，同時(shí)也不會(huì)影響衣殼或載體基因組元件等?！?/p>

Ying Kai Chan 還向媒體透露，他們研究小組將修飾后的 AAV 注射到豬和小鼠模型的肌肉，肝臟和眼睛中后，AAV 引發(fā)的免疫反應(yīng)比傳統(tǒng)載體明顯減少。

哈佛大學(xué)的研究小組認(rèn)為，在動(dòng)物模型中令人鼓舞的結(jié)果表明了抑制 TLR9 可以生產(chǎn)更安全、更有效的 AAV 載體，從而避免 AAV 基因組引發(fā)的免疫應(yīng)答。

不過在猴子身上的表現(xiàn)并不明顯。該研究團(tuán)隊(duì)將這種載體注射到了非人靈長類動(dòng)物的眼睛中，在視網(wǎng)膜下給藥時(shí)，顯示出了更高的安全性;直接注射到猴子玻璃體腔內(nèi)時(shí)，仍然引發(fā)了明顯的炎癥反應(yīng)。“挑戰(zhàn)仍然存在?！盰ing Kai Chan 說。

Ying Kai Chan 在接受外媒采訪時(shí)還表明，新論文只是其修飾 AAV 的 1.0 版，此后他們還對(duì) AAV 進(jìn)行了重大改進(jìn)。

誠然如此，AAV 還有很長的路要走。比如說，動(dòng)物模型仍然不能很好地預(yù)測(cè)人類免疫反應(yīng)，在安全性試驗(yàn)中還存在很大的漏洞。在猴子身上表現(xiàn)出免疫沉默的載體仍可能引發(fā)人體免疫反應(yīng)，反之亦然。盡管 AAV 在動(dòng)物體內(nèi)的作用已有充分文獻(xiàn)記載，但仍不清楚 TLR 在人體內(nèi)對(duì) AAV 反應(yīng)中所扮演的角色。

現(xiàn)在，Ally Therapeutics 將利用 TLR9 編輯的 AAV 技術(shù)平臺(tái)，尋求開發(fā)免疫原性較低的基因療法。

降低免疫原性的其他方式

有業(yè)內(nèi)相關(guān)人士表示，AAV 作為一種常用的遞送工具，需要特別關(guān)注以下幾點(diǎn)。第一，一定要降低免疫源性，避免人體中和抗體對(duì)它的清除;第二，必須要有非常高的組織特異性，才能夠把病毒內(nèi)的核酸正常遞送到組織細(xì)胞的表面;第三，轉(zhuǎn)導(dǎo)率，病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)率取決于遞送內(nèi)容有多少能夠進(jìn)到細(xì)胞內(nèi)部。

衣殼蛋白和基因組都是 AAV 免疫原性成分，AAV 的衣殼蛋白決定了其對(duì)不同組織的靶向性及免疫原性，也有不少科學(xué)家通過改造衣殼蛋白的方式降低 AAV 的免疫原性。

經(jīng)工程化改造的 AAV 衣殼蛋白

擁有 DNA 合成和測(cè)序背景的埃里克·凱爾西奇利用 AI 系統(tǒng)優(yōu)化并篩選 AAV 衣殼，其搭建的 AI 技術(shù)平臺(tái)可以對(duì)一種特定 AAV 血清型的所有衣殼變體進(jìn)行高通量篩選。其創(chuàng)立的基因療法公司 Dyno Therapeutics 正在基于其 AI 篩選平臺(tái)開發(fā)更安全的“下一代”基因治療載體。

而馬賽諸塞州眼耳醫(yī)院基因治療中心的負(fù)責(zé)人盧克范登伯格則持有不同的看法。據(jù)了解，盧克范登伯格曾經(jīng)嘗試了埃里克凱爾西奇利用 AI 優(yōu)化 AAV 衣殼的方式，但是失敗了。因此，他對(duì)于埃里克凱爾西奇是否有足夠的知識(shí)用通過 AI 改造優(yōu)化 AAV 衣殼蛋白表示懷疑。

“該領(lǐng)域在開發(fā)攜帶大片段基因以及躲避中和抗體的載體方面能力很薄弱”。盧克范登伯格說。

他創(chuàng)立的基因療法 Affinia Therapeutics 目前正在利用專有的 AAV 文庫和技術(shù)改造病毒衣殼蛋白的免疫原性和組織定向性，治療領(lǐng)域集中在中樞神經(jīng)疾病和肌肉疾病。

而 George Church、Ying Kai Chan 使用的方式不同，他們的方法只是將抑制性 TLR9 基因片段整合到了 AAV 載體中，不會(huì)影響衣殼或載體基因組元件。哈佛研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，抑制 TLR9 這一路徑可能在解決 AAV 基因療法引發(fā)的高免疫原性問題中扮演更為重要角色。

有業(yè)內(nèi)人士預(yù)言，2021 年將會(huì)是“細(xì)胞基因治療年”。作為基因治療的“命門”，AAV 仍是當(dāng)下基因遞送工具中的最優(yōu)解。無論是 AAV改造衣殼蛋白還是其基因組，進(jìn)一步提高AAV的安全性和有效性將會(huì)被是未來基因治療公司需要不斷演算的一道必答題。（摘自美《深科技》）（編輯/多洛米）