宋旻鵬 汪金海 陳智威 李希豹 鄭小東

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266003)

水生動(dòng)物在經(jīng)過一段時(shí)間的饑餓或營養(yǎng)不足后恢復(fù)攝食, 表現(xiàn)出超過其正常生長速度的現(xiàn)象,稱為補(bǔ)償生長[1,2]。補(bǔ)償生長是水生動(dòng)物營養(yǎng)生理學(xué)的重要組成部分, 根據(jù)恢復(fù)生長的程度可以將補(bǔ)償生長分為不能補(bǔ)償生長、部分補(bǔ)償生長、完全補(bǔ)償生長和超補(bǔ)償生長四類[3], 關(guān)于其形成機(jī)制, 主要存在以下三種觀點(diǎn): (1)提高自身攝食量[4]; (2)提高食物轉(zhuǎn)化率[3]; (3)既提高自身攝食量又提高食物轉(zhuǎn)化率[5]。在實(shí)際生產(chǎn)中, 合理的利用動(dòng)物的補(bǔ)償生長可以有效提高飼料利用率、促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長、降低勞動(dòng)成本以及減輕水體污染[6], 對(duì)推動(dòng)科學(xué)養(yǎng)殖具有重要意義。目前, 水生動(dòng)物的補(bǔ)償生長研究, 已在貝類[7,8]、魚類[9,10]、甲殼類[11,12]等水生動(dòng)物中廣泛開展。

長蛸(Octopus minor)又稱八蛸、長腿蛸、章魚等, 廣布于我國南北沿海、朝鮮半島以及日本沿海海域[13], 是我國重要經(jīng)濟(jì)蛸類。近年來, 許多研究人員已針對(duì)長蛸細(xì)胞生物學(xué)[14]、遺傳學(xué)[15—17]、營養(yǎng)學(xué)[18]、胚胎發(fā)育[19]、增養(yǎng)殖[20]、攝食行為學(xué)[21]等方面開展過研究, 本課題組于2017年開展了生長期長蛸的補(bǔ)償生長研究, 分析了在不同饑餓時(shí)間后恢復(fù)投喂對(duì)長蛸補(bǔ)償生長的影響[4]。在補(bǔ)償生長研究中, 周期性饑餓被認(rèn)為是獲得理想補(bǔ)償生長效果的一種有效方法[6], 但關(guān)于長蛸生長期階段的周期性饑餓脅迫后的補(bǔ)償生長研究尚未見報(bào)道。在本研究中, 我們通過對(duì)生長期長蛸開展周期性饑餓再投喂實(shí)驗(yàn), 研究其生長、存活, 以及肌肉脂肪酸和氨基酸含量變化, 探討不同投喂模式對(duì)暫養(yǎng)長蛸的影響并制定出合理的投喂計(jì)劃, 旨在為我國長蛸增養(yǎng)殖健康發(fā)展提供參考資料和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)于2018年9—10月在山東馬山集團(tuán)育苗廠內(nèi)開展。選取體質(zhì)健壯、外觀完好的健康長蛸[體重(94.29±9.35) g, 胴背長(53.25±5.25) mm]120只野生個(gè)體用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間采用肉球近方蟹[Hemigrapsus sanguineus, 體重(7.52±1.38) g]作為餌料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前馴養(yǎng)3d, 馴養(yǎng)期間對(duì)長蛸進(jìn)行飽食投喂,馴養(yǎng)結(jié)束后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組, 包括1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)周期性饑餓再投喂組, 每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn), 每個(gè)平行10只長蛸。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:

對(duì)照組: 連續(xù)投喂24d;

S1F5組: 饑餓1d, 投喂5d, 持續(xù)4個(gè)周期;

S2F4組: 饑餓2d, 投喂4d, 持續(xù)4個(gè)周期;

S3F3組: 饑餓3d, 投喂3d, 持續(xù)4個(gè)周期;

實(shí)驗(yàn)于長方形水泥池(6 m×1 m×0.6 m)中進(jìn)行,水深0.5 m, 采用經(jīng)沙濾的自然海水, 鹽度28—31 psu,水溫19.8—22.2℃。自然光照, 持續(xù)充氧, 長流水養(yǎng)殖, 每日吸污1次, 每3d全換水1次。采用直徑90 mm,長度700 mm的灰色PVC管為蛸巢。每日17:00投餌, 次日上午8:00清理并統(tǒng)計(jì)殘餌。

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 分別統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組長蛸的成活率和體重。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取3只長蛸剖取肝臟測定肝體比, 并取其腕部肌肉于液氮中保存。

(1) 成活率(SR)、增重率(WG)、肝體比(HSI)、個(gè)體攝食量(FI)計(jì)算方法

其中:N1表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)個(gè)體數(shù)量,N2表示實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)個(gè)體存活數(shù)量;Wt1和Wt2分別表示實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)個(gè)體體重;Wg表示個(gè)體肝臟體重,Wt表示個(gè)體體重;WS1表示投餌質(zhì)量,WS2表示殘餌質(zhì)量。

(2) 肌肉脂肪酸含量測定方法

將長蛸肌肉樣品冷凍干燥48h, 后使用研缽將肌肉樣品研磨成粉末狀。取長蛸肌肉樣品100 mg,加入乙酰氯-甲醇溶液(1∶20) 2 mL, 80℃條件下水浴加熱20min, 待樣品冷卻后, 加入1 mL正己烷萃取, 期間注意遮光處理。后使用氣相色譜儀(HP6890 PLUS GC型)對(duì)提取的脂肪酸進(jìn)行分析, 測量結(jié)果以脂肪酸標(biāo)品(SIGMA公司生產(chǎn))為參照, 通過歸一法計(jì)算各個(gè)脂肪酸組分的百分含量。

(3) 氨基酸含量測定方法

稱取長蛸肌肉干粉20 mg于安培瓶中, 加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液, 充氮, 密封, 于110℃下水解24h,減壓蒸干, 加入0.02 mol/L鹽酸于10 mL容量瓶內(nèi)定容。后取0.2 mL該溶液以及三乙胺、異硫氰酸苯酯各0.1 mL置于離心管中, 室溫下靜置1h, 加入400 mL正己烷, 震蕩, 靜置10min, 使用0.45 μm膜對(duì)下層溶液進(jìn)行過濾, 將濾液置于氨基酸自動(dòng)分析儀(SYKAM, S-433D)中以測定氨基酸組成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。使用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì), 進(jìn)行ANOVA單因素方差分析和Duncan’s多重檢驗(yàn)分析, 以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 周期性饑餓再投喂對(duì)長蛸生長性能的影響

在實(shí)驗(yàn)開始前, 各實(shí)驗(yàn)組長蛸起始體重差異不顯著(P＞0.05; 表 1)。周期性饑餓再投喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 各組長蛸終末體重差異顯著具體情況如下: S1F5組長蛸終末體重(136.70±9.24) g顯著高于對(duì)照組值(127.69±6.51) g (P＜0.05), S3F3組長蛸終末體重(118.26±6.46) g顯著低于對(duì)照組值(P＜0.05), 而S2F4組終末體重(130.45±6.78) g與對(duì)照組值差異不顯著(P＞0.05; 表 1)。實(shí)驗(yàn)長蛸的成活率隨饑餓時(shí)間增長逐漸降低, 但各實(shí)驗(yàn)組均與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05), 各組成活率分別為: 對(duì)照組(93.33±11.55)%、S1F5組(93.33±5.77)%、S2F4組(86.67±15.28)%、S3F3組(83.33±5.77)%。

表 1 周期性饑餓再投喂對(duì)長蛸生長性能的影響Tab. 1 Effects of periodical starvation-refeeding on growth performance of O. minor

2.2 周期性饑餓再投喂對(duì)長蛸增重率、肝體比、個(gè)體攝食量以及餌料效率的影響

圖 1所示, 各組長蛸的增重率隨饑餓時(shí)間的增長先上升后下降, S1F5組的增重率顯著高于對(duì)照組,S3F3組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05), 其中增重率值最高的為S1F5組(0.46±0.10), 最低的為S3F3組(0.26±0.06)。長蛸的肝體比隨饑餓時(shí)間的增長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖 1), 其中, S1F5組肝體比值顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), S2F4組和S3F3組的肝體比值與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。具體排序?yàn)? S1F5組(0.070)＞對(duì)照組(0.062)＞S2F4組(0.059)＞S3F3組(0.052)。

圖 2所示, 實(shí)驗(yàn)長蛸的個(gè)體攝食量對(duì)饑餓時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢。其中, S1F5組、S2F4組以及S3F3組值均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。其具體排序?yàn)? S3F3組(5.13±1.25) g＞S2F4組(5.04±0.91) g＞S1F5組(4.76±1.11) g＞ 對(duì)照組(3.34±0.81) g。與個(gè)體攝食量變化趨勢不同, 個(gè)體體重變化量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中, S1F5組個(gè)體體重變化量(42.36±4.89) g顯著高于對(duì)照組值(33.78±4.39) g (P＜0.05),S3F3組值(23.93±3.73) g顯著低于對(duì)照組值(P＜0.05),S2F4組值(35.88±3.21) g與對(duì)照組值差異不顯著(P＞0.05)。

圖 1 周期性饑餓再投喂對(duì)長蛸增重率及肝體比值的影響Fig. 1 Effects of periodical starvation-refeeding on growth rate and hepatosomatic index of O. minor

圖 2 周期性饑餓再投喂對(duì)長蛸攝食量和體重變化量的影響Fig. 2 Effects of periodical starvation-refeeding on food ingestion and weight change of O. minor

表 2 周期性饑餓再投喂對(duì)長蛸肌肉脂肪酸含量的影響Tab. 2 Effects of periodical starvation-refeeding on muscle fatty acid content of O. minor

2.3 周期性饑餓再投喂對(duì)長蛸肌肉脂肪酸含量的影響

據(jù)表 2可知, 長蛸肌肉組織中共檢測出16種脂肪酸, 起始碳鏈長度為14—22, 包含6種飽和脂肪酸(SFA)和10種不飽和脂肪酸(UFA), 其中UFA包括4種單不飽和脂肪酸(MUFA)和6種多不飽和脂肪酸(PUFA)。各實(shí)驗(yàn)組SFA、UFA、MUFA、PUFA、Σn-3 PUFA、Σn-6 PUFA、Σn-9 PUFA含量均與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05), 但S1F5組中的值與對(duì)照組相比出現(xiàn)了一定程度的升高, S2F4組和S3F3組中值出現(xiàn)一定程度的下降; S1F5組和S3F3組中C18:0的含量顯著高于對(duì)照組的值(P＜0.05); S2F4組C18:1n-7和EPA的含量顯著高于對(duì)照組的值(P＜0.05), 且EPA / DHA也顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.4 周期性饑餓再投喂對(duì)長蛸肌肉氨基酸含量的影響

由表 3可知, 于長蛸肌肉組織中共檢測出17種氨基酸, 其中必需氨基酸9種, 非必需氨基酸8種。經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn), 僅S1F5組胱氨酸(Cys)含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 實(shí)驗(yàn)組中其余氨基酸含量均與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05); 此外, 必需氨基酸總量(TEAA)、氨基酸總量(TAA)以及必需氨基酸總量/氨基酸總量(TEAA/TAA)均與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05), 但隨饑餓時(shí)間的延長TEAA和TEAA/TAA的值有逐漸升高的趨勢。

表 3 周期性饑餓再投喂對(duì)長蛸影響Tab. 3 Effects of periodical starvation-refeeding on muscle amino acid content of O. minor

3 討論

3.1 長蛸補(bǔ)償生長的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在魚類養(yǎng)殖過程中, 補(bǔ)償生長被認(rèn)為是一種有效的方法用于加速魚類的生長, 但由于食物短缺引發(fā)的補(bǔ)償生長在接近對(duì)照組生長時(shí)具有減慢的現(xiàn)象, 使得最終的生長量并未出現(xiàn)顯著的提高[22]。因此建議采用周期性饑餓再投喂的方法, 在每次補(bǔ)償生長減弱時(shí)重新激活, 以增加補(bǔ)償生長的時(shí)間[23]。目前魚類補(bǔ)償生長的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)主要包含以下兩類:一、餌料禁食條件下產(chǎn)生的補(bǔ)償生長[24]; 二、限制餌料攝食條件下產(chǎn)生的補(bǔ)償生長[25]。在本研究中,我們采用的是第一類實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì), 在各組“饑餓+投喂”實(shí)驗(yàn)總持續(xù)時(shí)間相等的基礎(chǔ)上[26], 研究不同投喂模式對(duì)長蛸補(bǔ)償生長的影響。在實(shí)際生產(chǎn)中, 長蛸的成活率會(huì)隨饑餓時(shí)間的延長逐漸下降, 設(shè)定適宜時(shí)長的饑餓脅迫對(duì)研究長蛸的補(bǔ)償生長具有重要的影響, 本課題組于2017年開展的長蛸饑餓實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 長蛸的成活率自饑餓3d起開始呈現(xiàn)下降趨勢[4], 因此, 在本研究中, 我們將最長饑餓時(shí)間設(shè)定為3d。

3.2 周期性饑餓再投喂對(duì)長蛸生長的影響

目前, 補(bǔ)償生長的衡量指標(biāo)以攝食量和餌料利用率、蛋白質(zhì)合成率和能量儲(chǔ)備為主[27]。安琪和曾曉起[28]報(bào)道馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)的補(bǔ)償生長時(shí), 因海膽殼占濕重比例較大, 將性腺指數(shù)和生化組分作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。張濤等[26]將成活率和增重率作為無針烏賊(Sepiella japonica)補(bǔ)償生長的判斷標(biāo)準(zhǔn)。通過綜合前人的研究基礎(chǔ), 我們將成活率、增重率以及終末體重作為長蛸補(bǔ)償生長的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

在本實(shí)驗(yàn)中, S1F5組與對(duì)照組相比成活率相同, 而增重率和終末體重顯著高于對(duì)照組; S2F4組中的成活率、增重率和終末體重均與對(duì)照組差異不顯著。此結(jié)果表明S1F5和S2F4組個(gè)體均具有補(bǔ)償生長的能力, 且S1F5組個(gè)體更具備超補(bǔ)償生長能力。這一結(jié)果與大麻哈魚(Oncorhynchus nerka)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)在短期饑餓脅迫下具備補(bǔ)償生長能力的結(jié)果一致[29,30]。同時(shí), 我們還對(duì)長蛸的個(gè)體攝食量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì), 發(fā)現(xiàn)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組長蛸的個(gè)體攝食量均顯著高于對(duì)照組。因此,為保證養(yǎng)殖長蛸在再投喂期間能充分的發(fā)揮其補(bǔ)償生長能力應(yīng)保證充足的餌料供應(yīng)。綜上所述,從節(jié)約成本, 保證養(yǎng)殖長蛸的成活率和生長速度的角度來看, 建議長蛸的最佳投喂模式為周期性饑餓1d再投喂5d。

3.3 周期性饑餓再投喂對(duì)長蛸肌肉組織脂肪酸和氨基酸含量的影響

在饑餓條件下, 水生動(dòng)物會(huì)通過消耗自身脂肪酸來提供能量, 其脂肪酸的消耗具有一定的順序,即首先使用飽和脂肪酸, 再利用低不飽和脂肪酸,最后才動(dòng)用高不飽和脂肪酸[3]。如鮸(Miichthys miiuy)幼魚和點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)幼魚在饑餓過程中, 首先利用飽和脂肪酸(SFA), 其次利用單不飽和脂肪酸(MUFA), 最后才利用多不飽和脂肪酸(PUFA)[31,32]。在本研究中, 結(jié)果顯示3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的SFA、MUFA以及PUFA的含量均與對(duì)照組差異不顯著, 從含量變化上看, 長蛸肌肉中的脂肪酸從饑餓2d后開始出現(xiàn)下降且首先利用的是SFA、其次為MUFA、最后才利用PUFA。作者認(rèn)為肌肉脂肪酸的含量從饑餓2d后才開始下降, 這一現(xiàn)象可能是由于饑餓1d時(shí)間太短, 長蛸首先利用了儲(chǔ)存在肝臟內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì), 致使肌肉中的脂肪酸含量并未減少。

氨基酸是水生動(dòng)物必需的營養(yǎng)物質(zhì), 對(duì)維持水生動(dòng)物正常的生命活動(dòng)發(fā)揮著重要作用。當(dāng)水生動(dòng)物遭受饑餓脅迫時(shí), 其自身能夠?qū)被徂D(zhuǎn)化為葡萄糖來提供能量, 具體表現(xiàn)為必需氨基酸總量和氨基酸總量的下降[33,34]。不同種類水生動(dòng)物對(duì)氨基酸的利用也不盡相同, 鰻鱺(Anguilla japonica)經(jīng)長期饑餓脅迫后, 必需氨基酸量和氨基酸量均顯著降低, 且必需氨基酸量較氨基酸量下降的更為明顯[35]。大黃魚(Larimichthys crocea)幼魚在饑餓早期, 大多數(shù)氨基酸組分和氨基酸總量會(huì)稍微低于對(duì)照組, 但隨饑餓時(shí)間的增長, 會(huì)表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢[10]。斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)在遭受饑餓脅迫時(shí), 優(yōu)先利用非必需氨基酸作為能源物質(zhì)[36]。在本實(shí)驗(yàn)中, 不同實(shí)驗(yàn)組的TEAA總量、TAA總量以及TEAA/TAA均與對(duì)照組差異不顯著, 表明不同投喂模式對(duì)長蛸肌肉氨基酸的含量并未產(chǎn)生影響, 這與虎斑烏賊(Sepia pharaonis)幼體經(jīng)周期性饑餓再投喂后各實(shí)驗(yàn)組氨基酸含量與對(duì)照組差異不顯著的結(jié)果一致[6]。此外, 長蛸肌肉中檢測出的9種必需氨基酸和8種非必需氨基酸中, 僅Cys的含量顯著高于對(duì)照組, 這一結(jié)果與無針烏賊幼體經(jīng)過周期性饑餓再投喂處理后Cys含量顯著高于對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[26]。作者認(rèn)為這一現(xiàn)象可能與長蛸自身的新陳代謝有關(guān), 饑餓脅迫后降低了長蛸對(duì)該種氨基酸的需求量, 致使各實(shí)驗(yàn)組的Cys含量均高于對(duì)照組, 但具體原因需進(jìn)一步研究。

致謝:

感謝馬山集團(tuán)有限公司蔡兵經(jīng)理、王炳輝廠長、蔡輝廠長提供了實(shí)驗(yàn)場地和實(shí)驗(yàn)材料, 中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2017級(jí)碩士研究生南澤參與了部分實(shí)驗(yàn)工作。