任 萍 梁旭方 方 劉 何 珊 肖倩倩 史登勇

(1. 華中農業(yè)大學水產學院, 華中農業(yè)大學鱖魚研究中心, 武漢 430070; 2. 農業(yè)部鱖魚育種創(chuàng)新基地, 農業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070; 3. 長江大學動物科學學院, 荊州 434025; 4. 湖北省水產良種試驗站, 武漢 430070)

糖作為魚類經(jīng)濟高效的能量來源之一, 飼料中提供足夠多的碳水化合物可以減少蛋白質的分解供能, 增加蛋白質的保留率[1,2]。大多數(shù)魚類可以通過增加飲食中脂質和碳水化合物的比例來提高蛋白質利用效率[3,4]。然而, 飼料中過多的碳水化合物會加重魚體負擔, 魚體會將多余的碳水化合物排出體外從而造成浪費。魚類利用糖的能力存在物種差異[5,6], 肉食性魚類對碳水化合物的利用能力低于雜食性和草食性魚類。在不減少魚類生長的情況下, 黃尾魚(Caranx malam)飼料中最大糊精添加水平是10%, 紅鯛(Pagrus major)是20%, 而鯉(Cyprinus carpio)是30%[7]。大多數(shù)肉食性魚類表現(xiàn)出糖不耐受[8—10], 葡萄糖攝入后出現(xiàn)持續(xù)高血糖現(xiàn)象[11—13]。然而, 肉食性魚類不能高效利用碳水化合物的分子機制尚不清楚。魚類對不同形式碳水化合物的利用能力亦存在差異, 對多糖和寡糖的利用要好于單糖和二糖[14—17], 這可能與糖分子的結構有關[18—20]。葡萄糖是自然界分布最廣的單糖, 糊精是-型多糖, 已有研究表明白鱘(Acipenser transm ontanus)[21]、鯰(Ictalurus punctatus)[9]、鯉[22]、羅非魚(Oreochromis niloticus×O. aureus)[23]對糊精的利用比葡萄糖好。因此, 魚類對不同形式糖類利用差異的原因有待進一步研究。

鱖(Siniperca chuatsi)是典型的肉食性魚類, 在自然條件下以活魚蝦為食, 梁旭方團隊研究了鱖馴食機理, 經(jīng)馴化后可接受人工飼料, 是研究肉食性魚類碳水化合物利用機制的優(yōu)良模型[24—26]。灌喂方法對魚的刺激性小, 可以準確反映魚對糖的耐受性[27], 據(jù)報道, 研究魚類對碳水化合物的利用能力可以用灌喂方法[11,13,28]。本研究采用灌喂法比較研究鱖對葡萄糖和糊精的代謝差異, 檢測尿糖、血糖、血胰島素、血甘油三酯、肝糖原和肌糖原含量及糖代謝相關基因表達水平。通過比較肉食性魚類對不同碳水化合物的利用差異, 有助于更好地了解肉食性魚類對碳水化合物利用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗魚及養(yǎng)殖條件

本試驗中使用的鱖購自湖北省麻城市浮橋河水庫。試驗開始前, 將64尾鱖(200±5) g 放在華中農業(yè)大學養(yǎng)殖基地350 L魚缸中, 進行為期4周的暫養(yǎng)。在此期間, 每天根據(jù)鱖體重的3%—5%投喂麥鯪(Cirrhinus mrigala)。水溫維持在(25±1)℃, pH 7.11—7.59, 溶氧為7.26—7.86 mg/L, 氨氮及亞硝酸鹽＜0.1 mg/L。

1.2 灌喂碳水化合物和樣品采集

在試驗開始前, 將鱖分成兩組, 禁食24h, 并用200 mg/L MS-222麻醉。使用裝有塑料管的注射器以1670 mg/kg[11,22,29]劑量灌喂葡萄糖或糊精, 將魚放回原來的養(yǎng)殖魚缸中, 灌喂參照文獻報道方法[11]。兩組均灌喂32尾鱖, 灌喂后于0、1h、2h、3h、4h、8h、12h和24h各個時間點每組均取4尾鱖并尾靜脈抽血, 并收集水樣, 室溫下, 4500×g離心5min以分離血漿。解剖魚體, 取0.2 g的肌肉和肝臟于液氮中速凍并保存在-80℃。通過葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測量血糖及水體中糖含量(尿糖含量)。通過堿消化法測量肝糖原和肌糖原含量。通過酶比色法測量甘油三酯含量。通過酶聯(lián)免疫法檢測血胰島素。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 相關基因表達水平檢測

根據(jù)Promega公司提供的RNA提取說明書提取組織RNA, 并通過多功能酶標儀(BioTek)檢測2 L RNA濃度。使用逆轉錄酶(購自Takara公司)將1 μg RNA逆轉錄成cDNA。核糖體蛋白L13a (Ribosomal protein L13a,rpl13a)作為內參基因, 采用實時熒光定量RT-qPCR的方法檢測鱖肝臟中的葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)、脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthetase,FAS)、乙酰輔酶A羧化酶Ⅰ型(Acetyl-CoA Carboxylase Type Ⅰ,ACC1)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase,PEPCK)、糖原合酶(Glycogen Synthase,GS)、檸檬酸合成酶(Citroyl synthetase,CS)以及鱖肌肉中的糖原合酶(Glycogen Synthase,GS)基因的相對表達水平。Real Time PCR擴增反應反應體系為: 10 μL AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(諾唯贊, 南京)、1 μL cDNA、0.4 μL Forward Primer(10 mmol/L)、0.4 μL Reverse Primer(10 mmol/L)、8.2 μL ddH2O。反應液的配制在冰上進行, 反應程序為:95℃, 30s; 95℃, 5s; 40×cycles; 58℃, 30s; 72℃, 30s;溶解曲線: 65—95℃, 每上升0.5℃ 停留5s。使用Primer Primer 5.0軟件設計熒光定量引物, 引物序列[30]示于表 1中。在每個時間點設置4個生物學重復, 并為每個樣品設置3個技術重復。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0軟件(SPSS, 美國芝加哥)評估數(shù)據(jù)的正態(tài)性, 同一時間點不同組間采用獨立樣本t檢驗, 同一組內不同時間點采用單因素方差分析(one-way ANOVA)來判斷平均值間的顯著性。通過2-ΔΔCt分析獲得基因的相對表達水平, 結果采用平均值±標準誤的形式表示,P＜0.05表示差異顯著。

表 1 本研究實時定量PCR引物Tab. 1 Primers used for real-time PCR used in this study

2 結果

2.1 灌喂不同碳水化合物對鱖尿糖及血糖的影響

鱖經(jīng)灌喂葡萄糖后尿糖含量在1—12h內迅速增加且各個時間點均顯著高于灌喂前水平, 在8h達到最大值是0.467 mg/(kg·h), 隨后開始下降, 并在24h時降至灌喂前水平且含量是0.101 mg/(kg·h), 而灌喂糊精組鱖尿糖含量僅在灌喂后8h顯著高于其他各個時間點及灌喂前水平, 表明鱖對不同碳水化合物表現(xiàn)出不同的尿糖情況。此外, 灌喂葡萄糖組的鱖尿糖含量在1h、2h、3h、4h、8h和12h時極顯著高于糊精組(P＜0.01, 圖 1A), 葡萄糖組鱖血糖含量先升高再降低, 在2h時達到最大值, 在24h降至最小值, 血糖值在2h和24h兩個時間點有顯著差異(P＜0.05), 但與灌喂前水平相比, 無顯著差異。灌喂糊精組鱖血糖含量在24h內各個時間點均無顯著差異(P＞0.05, 圖 1B)。然而, 在灌喂后24h內每個時間點, 兩組之間血糖水平?jīng)]有顯著差異(P＞0.05, 圖 1B)。

2.2 灌喂不同碳水化合物對鱖血胰島素、血甘油三酯、肝糖原及肌糖原的影響

灌喂不同碳水化合物后, 鱖血胰島素變化趨勢一致。葡萄糖組和糊精組鱖在灌喂后24h內, 血胰島素在各個時間點之間均無顯著差異(P＞0.05), 在24h內每個時間點兩組鱖血胰島素含量相比, 均無顯著差異(P＞0.05, 圖 2A)。此外, 兩組鱖血甘油三酯含量變化趨勢相似, 均是先升高再降低。兩組鱖均在灌喂后2 h達到最大值且顯著高于灌喂前水平(P＜0.05), 但與其他各個時間點相比, 無顯著差異(P＞0.05), 2h以外的其它時間點與灌喂前水平相比無顯著差異(P＞0.05, 圖 2B)。

在灌喂不同碳水化合物后24h內, 兩組肝糖原含量先增加后減少。葡萄糖組的肝糖原含量在灌喂后1—12h各個時間點均顯著高于灌喂前水平,4h時達最大值42.43 mg/g, 24h時降至灌喂前水平(P＜0.05, 圖 2C)。而糊精組鱖肝糖原含量在8h時達最大值(58.61 mg/g)并顯著高于4h時的肝糖原含量(P＜0.05), 但4h和8h時肝糖原含量各自與各個時間點相比, 無顯著差異, 且灌喂后24h內各個時間點均顯著高于灌喂前水平, 在1h時, 葡萄糖組肝糖原含量顯著低于糊精組(P＜0.05, 圖 2C)。此外, 葡萄糖組肌糖原含量變化緩慢, 24h時顯著高于灌喂前水平及灌喂后的1—4h (P＜0.05, 圖 2D)。糊精組肌糖原含量在灌喂后1—24h內各個時間點均顯著高于灌喂前水平(P＜0.05, 圖 2D), 但各個時間點之間均無顯著差異(P＞0.05)。在灌喂后24h內的每個時間點, 葡萄糖組的肌糖原含量顯著低于糊精組(P＜0.05,圖 2D)。

圖 1 灌喂不同碳水化合物對鱖尿糖及血糖含量的影響Fig. 1 Effects of the oral administration of different carbohydrates on the urine glucose and plasma glucose concentrations in Chinese perch

2.3 灌喂不同碳水化合物對鱖糖脂代謝相關基因的影響

鱖經(jīng)灌喂不同碳水化合物后, 糖脂代謝相關基因表達水平變化趨勢相似, 均是先升高后降低。葡萄糖組GK(葡萄糖激酶)基因相對表達水平在4h時達到最大值, 顯著高于灌喂前水平及灌喂后其他各個時間點(P＜0.05), 而糊精組GK基因相對表達水平在8h時達到最大值, 顯著高于灌喂前水平及灌喂后1h、2h、3h、12h和24h時GK基因相對表達值(P＜0.05, 圖 3A)。兩組鱖FAS(脂肪酸合成酶)基因相對表達量在24h內各個時間點均無顯著差異(P＞0.05, 圖 3B)。葡萄糖組鱖ACC1(乙酰輔酶A羧化酶Ⅰ型)基因相對表達值在12h時顯著高于灌喂前水平及1h和2h (P＜0.05), 糊精組鱖ACC1基因相對表達值在4h和24h顯著高于灌喂前水平(P＜0.05,圖 3C)。葡萄糖組PEPCK(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)基因相對表達值在12h和24h時顯著高于灌喂后1h、2h和3h (P＜0.05, 圖 3D), 卻與灌喂前水平無顯著差異, 而糊精組PEPCK基因相對表達值在24h內無顯著差異(P＞0.05, 圖 3D)。葡萄糖組GS(糖原合酶)在8h時顯著高于灌喂前水平及24h內各個時間點(P＜0.05), 而糊精組GS在4h和12h時顯著高于灌喂前水平及1h和3h (P＜0.05, 圖 3E)。葡萄糖組中CS(檸檬酸合成酶)基因表達水平在4h時顯著高于灌喂前水平及其1h、2h和3h (P＜0.05),CS最大值在8h時出現(xiàn), 且顯著高于灌喂前水平及24h內各個時間點, 而糊精組CS在24h內各個時間點無顯著差異(P＞0.05, 圖 3F)。此外, 不同碳水化合物灌喂鱖1h時, 葡萄糖組中GK、FAS和ACC1相對基因表達水平顯著低于糊精組(P＜0.05)。然而, 兩個組PEPCK基因表達水平在灌喂后24h內各個時間點均無顯著差異(P＞0.05)。在灌喂后8h時, 葡萄糖組中GS基因表達量顯著高于糊精組(P＜0.05)。此外, 葡萄糖組中CS基因表達水平在1h顯著低于糊精組(P＜0.05), 然而, 葡萄糖組中CS在8h和12h顯著高于糊精組(P＜0.05)。

3 討論

與肉食性魚類不同, 草食和雜食性魚類能更好地利用碳水化合物, 表現(xiàn)出較低的餐后血糖和較高的糖耐受能力[8,31]。因此, 本論文研究肉食性魚類鱖對不同碳水化合物(葡萄糖和糊精)的利用差異。已有研究表明肉食性魚類攝入含糖食物后血糖水平持續(xù)升高[22], 鯉的血糖恢復到攝食前水平需要5h[10], 草魚需要10h[28]。然而, 本研究發(fā)現(xiàn)鱖經(jīng)灌喂葡萄糖后3h時已降至灌喂前水平, 而糊精組鱖血糖水平在灌喂后24h內未發(fā)生較大波動(圖 1B)。葡萄糖屬于單糖, 易于吸收, 鱖經(jīng)灌喂葡萄糖后, 血糖含量迅速升高, 3h時已降至灌喂前水平, 表明葡萄糖組鱖降低高血糖的能力較強, 這與石斑魚對高血糖的應答情況相似[29]。而糊精組鱖攝入糖后不會改變血糖水平, 推測糖主要以其他形式進行代謝。參與維持鱖恒定血糖水平的途徑可能包括糖代謝相關酶活性及基因表達、胰島素內分泌調控等[32,33]。

胰島素作為一種多功能肽激素, 可促進糖的利用和轉化, 抑制糖異生和降低血糖水平[34]。攝入糖后, 大鱗大馬哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)[10]和石斑魚(Epinphelus coioides)血胰島素水平下降, 血糖水平升高。與恒定血糖水平相適應, 本研究發(fā)現(xiàn)血胰島素水平在灌喂葡萄糖或糊精后24h內亦未發(fā)生變化(圖 2A), 歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)中也發(fā)現(xiàn)了類似的結果[35]。

圖 2 灌喂不同碳水化合物對鱖血胰島素、血甘油三酯、肝糖原及肌糖原含量的影響Fig. 2 Effects of the oral administration of different carbohydrates on insulin, triglycerides, hepatic glycogen and muscle glycogen in Chinese perch

灌喂葡萄糖后鱖尿糖水平顯著高于糊精組(圖 1A),且葡萄糖組鱖在灌喂后1—12h內各個時間點均顯著高于灌喂前水平, 表明鱖攝入的葡萄糖會通過尿排出體外, 而攝入糊精后通過尿排出較少?？紤]到碳水化合物其他代謝途徑, 本研究也檢測了肝糖原和肌糖原含量。肝臟和肌肉是葡萄糖以糖原形式儲存在體內的兩個主要器官, 大量研究表明魚類攝入糖后肝糖原和肌糖原水平顯著升高[8,27]。本研究發(fā)現(xiàn), 葡萄糖組鱖肝糖原含量在灌喂后1—12h內各個時間點均顯著高于灌喂前水平, 而糊精組鱖肝糖原含量在灌喂后1—24h內各個時間點均顯著高于灌喂前水平, 在1h時葡萄糖組肝糖原水平顯著低于糊精組, 其他時間點沒有顯著差異(圖 2C)。葡萄糖組鱖肌糖原含量在灌喂后24h時均顯著高于各個時間點, 而糊精組鱖肌糖原含量在灌喂后1—24h內各個時間點均顯著高于灌喂前水平, 葡萄糖組肌糖原含量在24h內各個時間點均顯著低于糊精組(圖 2D)。以上結果表明, 在鱖攝入葡萄糖或糊精后, 可轉化為肝糖原和肌糖原存儲在體內, 且糊精的轉化能力優(yōu)于葡萄糖, 而不是主要以尿糖的形式排出體外。

圖 3 灌喂不同碳水化合物對鱖GK、FAS、ACC1、PEPCK、GS和CS基因表達水平的影響Fig. 3 The mRNA expression levels of GK, FAS, ACC1, PEPCK, GS and CS in Chinese perch after the oral administration of two different carbohydrates

已有研究表明魚類中糖代謝關鍵酶類基因表達水平受攝食糖水平的影響[36]。糖原合酶(GS)是糖原合成中的關鍵酶, 在肝糖原和肌糖原合成中起重要作用[37]。本研究中, 鱖灌喂葡萄糖8h后, 糖原合酶基因表達水平顯著高于灌喂糊精組(圖 3E)這進一步解釋糖原合成增多的原因。葡萄糖激酶(GK)是糖酵解過程中的關鍵酶, 有效催化葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸, 這是糖酵解過程的第一步[38]。本研究中灌喂葡萄糖1h后,GK基因表達水平顯著低于糊精組(圖 3A), 表明鱖對葡萄糖的分解利用好于糊精。檸檬酸合成酶(CS)是三羧酸循環(huán)的關鍵限速酶, 葡萄糖組CS基因表達水平在灌喂1h時顯著低于糊精組, 灌喂8h和12h時卻顯著高于糊精組(圖 3F)。磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)是糖異生過程中的關鍵酶, 鱖灌喂兩種不同形式碳水化合物后, 葡萄糖組鱖PEPCK基因表達水平在12h和24h時顯著高于灌喂前水平, 而糊精組PEPCK基因表達水平并未表現(xiàn)出差異(圖 3D), 表明葡萄糖對鱖糖異生的作用優(yōu)于糊精。這與錦鯉(Cyprinus carpio)和紅鯛中的研究結果相似[15]。以上結果表明,鱖可以很好地利用葡萄糖和糊精, 并轉化為肝糖原和肌糖原存儲下來, 葡萄糖可以加速鱖體內糖酵解進而糖異生過程, 且作用優(yōu)于糊精。

在糖進入體內后, 不僅可以分解利用, 還可與脂代謝發(fā)生聯(lián)系, 轉化為脂肪。因此, 本研究檢測了鱖經(jīng)灌喂不同碳水化合物后血甘油三酯水平, 發(fā)現(xiàn)灌喂葡萄糖和糊精均可促進血甘油三酯合成(圖 2B),且葡萄糖的促進作用低于糊精。歐洲鱸[39]、白鱘(Acipenser transm ontanus)[12]和異育銀鯽(Carassiusauralus gibelio)[40]的研究中亦發(fā)現(xiàn)相同結果, 糖攝入可促進脂肪的生成。脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰輔酶A羧化酶I型(ACC1)是脂肪酸合成過程中關鍵的催化酶, 葡萄糖組FAS和ACC1基因表達水平在灌喂后1h時顯著低于糊精組(圖 3B和圖 3C), 因此, 葡萄糖和糊精的攝入可以有效激活脂肪酸合成代謝,促進糖轉化為脂肪, 而減少未利用糖以尿糖形式排出, 且葡萄糖的促進作用低于糊精。

綜上所述, 肉食性魚類鱖對不同形式碳水化合物表現(xiàn)出不同的代謝效率, 攝入糖后可以促進糖原和脂肪的合成, 轉化為糖原和甘油三酯, 從而減少未利用糖的排出, 且鱖對葡萄糖的利用低于糊精。本論文為比較研究不同食性魚類糖代謝利用的分子機制, 提供了理論依據(jù)。