費(fèi)樹站 劉昊昆 韓 冬 金俊琰 楊云霞 朱曉鳴 解綬啟

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

飼料原料的營養(yǎng)價(jià)值由多方面因素決定, 包括原料的營養(yǎng)成分, 動(dòng)物對(duì)原料中各營養(yǎng)成分的消化、吸收及利用率[1]。表觀消化率測定是評(píng)價(jià)飼料原料營養(yǎng)價(jià)值的重要內(nèi)容, 也是配制營養(yǎng)平衡飼料的前提[2]。植物蛋白中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子, 如豆粕中含有胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白、寡糖等[3],菜粕中含有硫苷、單寧、唑烷硫酮、異硫氰酸酯、植酸等[4], 在一定程度上影響了飼料的適口性和安全性。研究發(fā)現(xiàn)通過生物發(fā)酵可明顯降低豆粕中胰蛋白酶抑制因子、植酸、大豆凝集素、寡糖、抗原蛋白、脲酶的含量, 發(fā)酵還可以提高粗蛋白質(zhì)、氨基酸、多種活性物質(zhì)的含量, 同時(shí)產(chǎn)生特殊氣味, 提高動(dòng)物適口性[5,6]; 在菜粕經(jīng)發(fā)酵后, 硫苷、唑烷硫酮、異硫氰酸酯、單寧、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量都有所降低, 粗蛋白和酸溶蛋白含量都有所提升[7]。

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)具有產(chǎn)量大、生長快、耐低溫低氧、含肉率高和肉質(zhì)細(xì)嫩等優(yōu)點(diǎn), 是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。本實(shí)驗(yàn)通過投喂黃顙魚豆粕與發(fā)酵豆粕、菜粕與發(fā)酵菜粕飼料, 比較黃顙魚攝食不同飼料原料時(shí)的蛋白質(zhì)、能量消化率、氨基酸利用率及消化酶活性和血液指標(biāo), 以評(píng)定這幾種原料對(duì)黃顙魚的營養(yǎng)價(jià)值, 為開發(fā)優(yōu)質(zhì)環(huán)保的黃顙魚配合飼料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

黃顙魚購買于武漢市江夏區(qū)鄧家洲國營黃顙魚原種場, 選用同批幼魚, 暫養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中, 期間以商品飼料每天兩次表觀飽食投喂,使幼魚適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。馴化1個(gè)月后挑選體格健碩、規(guī)格均勻者隨機(jī)分組開始正式實(shí)驗(yàn), 初始平均體重為12.88 g。實(shí)驗(yàn)采用室內(nèi)流水養(yǎng)殖系統(tǒng), 共設(shè)置12個(gè)缸, 每缸40尾, 每種飼料3個(gè)平行, 溶氧6.0 mg/L以上, pH 6.8—7.2, 水溫22—28℃, 滴加硫代硫酸鈉溶液除去余氯。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料的設(shè)計(jì)與配制

4種原料為豆粕和發(fā)酵豆粕(武漢邦之德牧業(yè)科技有限公司)、菜粕和發(fā)酵菜粕(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所)。4種原料的營養(yǎng)成分見表 1。

實(shí)驗(yàn)共制作了5種飼料, 分別是基礎(chǔ)飼料和4種實(shí)驗(yàn)飼料, 基礎(chǔ)飼料以魚粉、豆粕、菜粕為主要蛋白源, 添加0.5%的Cr2O3作為外源指示劑, 基礎(chǔ)飼料配方和營養(yǎng)成分見表 2, 4種實(shí)驗(yàn)飼料由70%的基礎(chǔ)飼料和30%的待測原料(豆粕、發(fā)酵豆粕、菜粕和發(fā)酵菜粕)組成, 將各成分粉碎過60目篩網(wǎng), 混合,制成粒徑為4 mm的顆粒。以上各顆粒飼料70℃烘干后于-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 飼養(yǎng)管理及糞便收集

正式實(shí)驗(yàn)前各缸用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)實(shí)驗(yàn)魚1周,待其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境后每天定時(shí)收集糞便, 待基礎(chǔ)飼料糞便收集足夠后再分別投喂4種不同原料飼料,1周后分別收集糞便。實(shí)驗(yàn)期間日投喂體重的3%—4%, 每天投喂3次, 在每天8:00、14:00和19:00各投一次, 1h后清除殘餌, 3—4h后用虹吸法收集糞便,挑選包膜完整的糞便, -20℃保存, 實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行33d,糞便用冷凍干燥機(jī)凍干, -20℃保存待測。

1.4 樣品分析及計(jì)算

測定的生化成分包括原料和飼料的粗蛋白、能量、灰分、水分及氨基酸含量, 糞便的粗蛋白、能量及氨基酸含量, 以上參數(shù)參照AOAC的方法測定[8]。采用105℃干燥恒重法測定樣品水分含量; 粗蛋白含量采用凱氏定氮儀(2300 Kjeltec Analyzer Unit, FOSS TECATOR, Sweden)測定; 灰分采用馬福爐550℃灼燒測定; 樣品中外源性標(biāo)記物Cr2O3的測定采用酸消化、比色法測定[9], 能值采用Phillipson微量能量計(jì)(Phillipson microbomb calorimeter,Gentry Instrument Inc., Aiken, USA)測定, 氨基酸含量采用高效液相色譜儀(LC-20AT, 津島)由中國廣州分析測試中心測定。

各表觀消化率的計(jì)算參考李英等[10]。

表 1 原料的化學(xué)組成Tab. 1 Chemical composition of six feed ingredients (%)

表 2 基礎(chǔ)飼料配方及化學(xué)組成 (干物質(zhì), %)Tab. 2 Formulation and chemical composition of the basal diet(dry matter, %)

1.5 樣品處理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有缸實(shí)驗(yàn)魚饑餓24h, 每缸隨機(jī)取2尾魚, 每個(gè)處理6尾, MS-222(80 mg/L)麻醉,肝素鈉抗凝劑潤洗無菌注射器, 尾部靜脈采血,3000 r/min離心10min, 分離血漿保存于-80℃冰箱,血液指標(biāo)采用全自動(dòng)生化分析儀(邁瑞Mindray,BS-460)測定; 每缸再隨機(jī)抽取魚3尾, 每個(gè)處理9尾,冰盤取肝臟、胃、前腸和中后腸, 液氮速凍, 分裝保存于-80℃超低溫冰箱待測消化酶活力。樣品分析前于4℃冰箱內(nèi)解凍, 在冰盤剪碎并迅速準(zhǔn)確稱取一定量組織, 根據(jù)不同酶活測定要求加入一定體積的勻漿介質(zhì), 在冰水浴條件下機(jī)械勻漿, 4℃下2500 r/min離心10min, 取上清液測定消化酶活力。

1.6 消化酶活力的測定

消化道胰蛋白酶、糜蛋白酶和淀粉酶活性均是購買南京建成生物工程研究所的試劑盒根據(jù)其說明書進(jìn)行測定。

胰蛋白酶活力單位定義: 在pH 8.0時(shí), 37℃條件下, 每毫克組織蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使其吸光度變化0.003即為一個(gè)酶活力單位。

糜蛋白酶活力單位定義: 在37℃條件下, 每毫克組織蛋白每分鐘分解蛋白生成1微克氨基酸相當(dāng)于1個(gè)酶活力單位。

淀粉酶活力單位定義: 在37℃條件下, 每毫克組織蛋白與底物反應(yīng)30min, 水解10 mg淀粉即為1個(gè)淀粉酶活力單位。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS 分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),并用Duncan氏進(jìn)行多重比較, 顯著性水平為P＜0.05, 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Means±error)表示。

2 結(jié)果

2.1 飼料及原料的表觀消化率

表 3和表 4結(jié)果顯示, 黃顙魚對(duì)4種飼料及原料的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率結(jié)果相似,發(fā)酵菜粕飼料及原料的表觀消化率最低, 干物質(zhì)和蛋白質(zhì)表觀消化率最低, 且與其他飼料及原料差異顯著(P＜0.05), 能量表觀消化率均沒有顯著性差異(P＞0.05)。比較發(fā)酵與非發(fā)酵原料顯示, 黃顙魚對(duì)豆粕與發(fā)酵豆粕之間各表觀消化率沒有顯著性差異(P＞0.05), 對(duì)發(fā)酵菜粕的蛋白質(zhì)表觀消化率顯著低于菜粕(P＜0.05), 干物質(zhì)及能量表觀消化率沒有顯著性差異(P＞0.05)。

表 3 黃顙魚對(duì)4種飼料干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率Tab. 3 The apparent digestibility coefficients (ADCS) of dry matter,protein and energy in four diets for Pelteobagrus fulvidraco (%)

表 4 黃顙魚對(duì)4種原料的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率Tab. 4 The apparent digestibility coefficients (ADCS) of dry matter, protein and energy in four ingredients for Pelteobagrus fulvidraco (%)

表 5顯示, 黃顙魚對(duì)不同原料的16種氨基酸的表觀消化率有較大的差異, 氨基酸表觀消化率的變化規(guī)律與蛋白質(zhì)表觀消化率的變化基本一致, 發(fā)酵菜粕中氨基酸的利用率均顯著低于其他飼料組(P＜0.05), 其他氨基酸的利用率均在85%—98%。蛋氨酸和組氨酸消化率最低, 均低于83%, 各組沒有顯著性差異(P＞0.05), 精氨酸和谷氨酸的消化率較高, 都在93%以上; 豆粕和發(fā)酵豆粕中的天冬氨酸、絲氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的利用率顯著高于菜粕和發(fā)酵菜粕組, 菜粕中脯氨酸的利用率要顯著高于其他組(P＜0.05)。

2.2 消化酶活性

表 6顯示, 胰蛋白酶活力在胃里有顯著性差異,其中菜粕組顯著高于發(fā)酵豆粕組, 其他組織沒有顯著性差異。各組織胰蛋白酶活力呈現(xiàn)出前腸＞中后腸＞胃的趨勢。

糜蛋白酶活力僅在中后腸組織表現(xiàn)出顯著性差異, 發(fā)酵豆粕組最低, 豆粕組最高, 發(fā)酵菜粕次之,各組織糜蛋白酶活力呈現(xiàn)胃＞前腸＞中后腸的趨勢。

淀粉酶活力在各組織沒有顯著性差異, 但攝食發(fā)酵菜粕淀粉酶活力要高于攝食其他原料, 各組織間淀粉酶活性呈現(xiàn)出前腸＞胃＞中后腸的規(guī)律。黃顙魚屬于有胃魚類, 因此淀粉酶活力相對(duì)較高, 但對(duì)餌料的消化吸收主要是在前腸, 因此前腸淀粉酶活力要高于其他組織。

2.3 血液生化指標(biāo)

表 7顯示, 豆粕飼料組血液的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)顯著高于其他組, 攝食菜粕與發(fā)酵菜粕沒有顯著性差異, 相對(duì)于豆粕和發(fā)酵豆粕低。

3 討論

3.1 黃顙魚對(duì)飼料原料干物質(zhì), 蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率

干物質(zhì)消化率的高低是衡量飼料原料總體消化水平的重要指標(biāo), 其與飼料中纖維素、灰分的含量及營養(yǎng)物質(zhì)被吸收的程度有關(guān)[2]。在本實(shí)驗(yàn)條件下, 黃顙魚對(duì)飼料原料干物質(zhì)的表觀消化率是隨著原料灰分的含量增加而顯著降低的, 這與Reigh 等[11]的研究結(jié)果一致。黃顙魚對(duì)飼料原料干物質(zhì)和能量的表觀消化率總體偏低, 這可能是因?yàn)辄S顙魚是偏肉食性動(dòng)物的原因, 其次可能是魚類缺乏消化纖維素的酶系統(tǒng), 植物性原料中含有一些魚類難以消化的碳水化合物, 如纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等,因此可能會(huì)對(duì)魚類能量的消化產(chǎn)生負(fù)面影響[12,13]。此外, 這些物質(zhì)的還可能降低魚體對(duì)其他營養(yǎng)物質(zhì)的利用[12,13]。

表 5 黃顙魚對(duì)4種原料氨基酸的表觀消化率Tab. 5 The apparent digestibility coefficients (ADCS) of amino acids in four ingredients for Pelteobagrus fulvidraco (%)

表 6 攝食4種原料對(duì)黃顙魚活力的影響Tab. 6 Effects of four ingredients on digestive enzyme activity of Pelteobagrus fulvidraco

表 7 四種飼料原料對(duì)黃顙魚血液生化指標(biāo)的影響Tab. 7 Effects of four ingredients on blood biochemical parameters of Pelteobagrus fulvidraco

本研究表明黃顙魚對(duì)豆粕、發(fā)酵豆粕和菜粕的蛋白質(zhì)的表觀消化率均在90%以上, 其中發(fā)酵豆粕的蛋白和能量的利用率最高, 說明黃顙魚能夠較好的利用這些植物蛋白, 其中發(fā)酵后的豆粕更能有效利用, 這可能是發(fā)酵降低豆粕中胰蛋白酶抑制因子、植酸、大豆凝集素、寡糖、抗原蛋白等的含量, 提高粗蛋白質(zhì)、氨基酸、多種活性物質(zhì)的含量[5,6]。比較其他研究[12,14,15], 鳙對(duì)豆粕和菜粕的蛋白質(zhì)表觀消化率分別是84.7%和83.7%, 吉富羅非魚對(duì)豆粕和菜粕的利用是91.2%和85.7%, 均略低于黃顙魚對(duì)豆粕和菜粕的利用。發(fā)酵菜粕的蛋白質(zhì)和能量表觀消化率則顯著低于菜粕, 這可能與原料的發(fā)酵工藝有關(guān), 不同的發(fā)酵工藝對(duì)植物蛋白原料的發(fā)酵效果不同, 如在菌株的選擇差異上、菌株的組合差異及發(fā)酵時(shí)的環(huán)境因子等都能導(dǎo)致發(fā)酵效果的不同, 因此造成發(fā)酵后營養(yǎng)價(jià)值存在差異[16,17]。目前對(duì)發(fā)酵菜粕在水產(chǎn)動(dòng)物表觀消化率的研究還未見報(bào)道, 還無法與其他魚類做出對(duì)比, 因此有待進(jìn)一步研究。

3.2 黃顙魚對(duì)飼料原料氨基酸的表觀消化率

從生理方面來講, 魚類對(duì)蛋白質(zhì)的需求實(shí)質(zhì)上是對(duì)組成蛋白質(zhì)的氨基酸的需求。然而由于魚體不能合成必需氨基酸(EAA)或合成的量不足維持生理需求, 因此需從食物中獲取某些必需氨基酸, 故了解飼料原料中EAA的消化率, 對(duì)飼料配方的設(shè)計(jì)及原料的選擇顯得尤為重要[12]。在本實(shí)驗(yàn)中, 黃顙魚對(duì)各原料蛋白質(zhì)的表觀消化率與氨基酸的表觀消化率變化基本一致。水解氨基酸總的表觀消化率差異與飼料原料蛋白質(zhì)的表觀消化率差異相似,均表現(xiàn)為發(fā)酵菜粕組消化率顯著低于其他組。本實(shí)驗(yàn)中黃顙魚對(duì)各飼料原料的蛋氨酸、組氨酸有較低的表觀消化率, 可能是因?yàn)橹参锏鞍装被岵黄胶鈱?dǎo)致該氨基酸消化率較低; 其他氨基酸表觀消化率均在85%—98%, 且均表現(xiàn)為發(fā)酵菜粕顯著低于其他三種原料, 其中精氨酸和谷氨酸的消化率較高, 都在93%以上; 此外, 豆粕與發(fā)酵豆粕的天冬氨酸、絲氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的表觀消化率顯著大于菜粕和發(fā)酵菜粕。在本實(shí)驗(yàn)中, 發(fā)酵菜粕大部分氨基酸的表觀消化率均顯著低于其他原料, 這可能是發(fā)酵菜粕不能被消化利用, 發(fā)酵菜粕中的氨基酸未被吸收, 其次氨基酸含量不平衡導(dǎo)致較低的消化率水平。總覽氨基酸消化率, 不同原料中相同氨基酸及相同原料不同氨基酸的消化率均存在較大差異, 這與葉元土等研究結(jié)論相同[18]。Terrazasfierro等[19]指出在飼料加工過程中, 過高的溫度會(huì)破壞部分氨基酸的分子結(jié)構(gòu)使得在糞便中不能檢測到, 從而導(dǎo)致消化率偏高。在魚體中不同部位消化道的消化酶性質(zhì)不同, 腸中提取的蛋白酶為堿性蛋白酶,在堿性條件下酶活性較高, 胃中蛋白酶為一種酸性蛋白酶, 在酸性條件下酶活性較高[20]。研究表明, 不同消化道部位的營養(yǎng)消化不同, 其酶活性也不同, 無論是有胃魚還是無胃魚以及魚類的食性如何, 其前腸是消化蛋白質(zhì)的主要場所[19], 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與該觀點(diǎn)相一致。而后腸活性最差, 這可能與養(yǎng)分濃度和被消化程度有關(guān), 也可能是飼料中抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)在后腸造成明顯病理變化的原因[21]。

3.3 四種原料對(duì)黃顙魚各組織中消化酶活性的影響

糜蛋白酶是胰腺分泌的內(nèi)切酶, 可專一性水解由芳香族氨基酸或帶有較大非極性側(cè)鏈的氨基酸羧基形成的肽鍵[22]。糜蛋白酶活性在本實(shí)驗(yàn)條件下在胃組織里活性最高, 前腸的糜蛋白酶活性要高于中后腸, 該結(jié)果跟其他研究者的觀點(diǎn)相似, 認(rèn)為大多數(shù)魚類腸黏膜層分泌蛋白酶的能力由前向后逐漸減弱[23]。

淀粉酶主要是肝胰臟分泌, 有些魚類的腸道也是分泌淀粉酶的重要器官, 魚類對(duì)食物中淀粉的消化能力與淀粉酶分泌機(jī)能的強(qiáng)弱直接相關(guān)[21—24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明前腸淀粉酶活性高于胃組織淀粉酶活性, 中后腸淀粉酶活性最低, 該結(jié)論與王宏田等[25]和余德光等[26]對(duì)牙鲆消化道淀粉酶的研究結(jié)果相似。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)是細(xì)胞線粒體中重要的氨基轉(zhuǎn)移酶, 主要參與氨基酸代謝, 廣泛存在于肝臟中。當(dāng)組織受損時(shí), 細(xì)胞膜滲透增大, 細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶大量釋放進(jìn)入血液中,使得血清中轉(zhuǎn)氨酶的活性升高[27]。因此, 血清中AST和ALT的活性可作為魚類評(píng)價(jià)肝臟損傷程度以及確定一些營養(yǎng)素需求量的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)豆粕飼料組谷草轉(zhuǎn)氨酶顯著高于其他組, 這可能是大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子影響了機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的代謝。孫玲[28]研究表明, 豆粕中含有大豆抗原, 而大豆抗原能引起血漿轉(zhuǎn)氨酶活性的升高, 同時(shí)還會(huì)影響組織消化酶活性, 抑制蛋白酶的分泌。

本實(shí)驗(yàn)研究表明, 黃顙魚對(duì)4種飼料營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率均較高, 飼料原料干物質(zhì)的表觀消化率在70.85%—78.55%, 其利用率依次為豆粕、發(fā)酵豆粕、菜粕及發(fā)酵菜粕, 蛋白質(zhì)的表觀消化率較高,均在90%以上, 能量的表觀消化率在81.75%—86.15%,說明這些飼料原料均可作為黃顙魚飼料中的蛋白來源。