呂里康 張思敏 李吉方 溫海深

(中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266003)

魚類性別決定與分化除了遺傳型性別決定(Genetic Sex Determination, GSD)外, 還存在環(huán)境型性別決定(Environmental Sex Determination, ESD),以及遺傳+環(huán)境型性別決定[1]。影響魚類性別分化的環(huán)境因子主要包括溫度、光周期、pH、鹽度、種群密度等[2]。溫度是影響魚類性腺分化的一種重要環(huán)境因素。除了溫度外, 光周期也能夠影響魚類的性腺分化, 稱為光周期依賴型性別決定(Photoperiod-dependent sex determination, PSD)。Brown等[1]研究表明, 在加利福尼亞銀漢魚(Leuresthes tenuis)的性腺分化時(shí)期, 長(zhǎng)光照(L∶D=15∶9)下性腺分化偏雌性發(fā)育, 短光照(L∶D=12∶12)下偏雄性發(fā)育。盡管光周期對(duì)魚類的性腺分化有一定的影響,但目前在光周期影響魚類性腺分化這方面的報(bào)道較少, 大部分關(guān)注的是光周期對(duì)魚類性腺發(fā)育和成熟, 比如: 月銀漢魚(Menidia beryllina)[3]、金魚(Carassius auratus)[4]等。

魚類性別決定和性腺分化相關(guān)基因的研究主要集中在cyp19a、sox9、dmrt1上,ERα、ERβ2等核受體基因, 以及foxl2、sox3和amh等基因的相關(guān)報(bào)道也逐漸增多。例如在日本鰻鱺(Anguilla japonica)的性腺分化時(shí)期cyp19a1a基因的表達(dá)量顯著增加[5]。在對(duì)金錢魚(Scatophagus argus)的研究可見雌激素受體在精巢和卵巢發(fā)育中都具有重要的作用[6]。同時(shí)魚類的性別分化也與內(nèi)分泌系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系。環(huán)境因素對(duì)魚類性腺分化及發(fā)育的調(diào)控主要是各種性類固醇激素通過下丘腦-垂體-性腺軸實(shí)現(xiàn)的[7], 這些性類固醇包括雌二醇(Estradiol,E2)、睪酮(Testosterone, T)和11-酮基睪酮(Ketotestosterone, 11-KT)等。

許氏平鲉(Sebastes schlegelii)屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉科(Scorpaenidae)、平鲉屬(Sebastes), 俗稱“黑頭”、“黑石鱸”等, 是一種分布在西北太平洋近海巖礁底棲卵胎生硬骨魚魚類。其肉質(zhì)鮮美, 營(yíng)養(yǎng)豐富, 生長(zhǎng)快速且抗病能力強(qiáng), 已成為我國(guó)北方沿海人工養(yǎng)殖的重要品種之一。其產(chǎn)仔期間正值4—6月, 晝夜時(shí)長(zhǎng)變化劇烈, 發(fā)育階段仔稚魚會(huì)隨著發(fā)育向水底下沉。目前對(duì)許氏平鲉性腺分化相關(guān)研究較少, 本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)其性腺分化模式及溫度影響下性腺分化情況展開了相關(guān)研究(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本研究在這一時(shí)期進(jìn)行不同光周期處理實(shí)驗(yàn), 探究光周期對(duì)許氏平鲉性腺分化的影響。通過組織學(xué)切片技術(shù)觀察許氏平鲉仔魚性腺分化與發(fā)育情況, 通過測(cè)定性類固醇激素水平和性別分化相關(guān)基因的表達(dá)情況, 探究不同光周期對(duì)性腺分化影響中的潛在機(jī)制。同時(shí)為光周期對(duì)卵胎生魚類性腺分化的影響提供一定的資料和依據(jù), 并對(duì)許氏平鲉養(yǎng)殖生產(chǎn)提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

實(shí)驗(yàn)所用仔稚魚于2016年5月采至山東省青島市貝寶有限責(zé)任公司養(yǎng)殖群體, 養(yǎng)殖環(huán)境水溫14—19℃, 鹽度(29±1)‰。在自然條件下養(yǎng)殖, 30 dpb(day post birth)后挑選體質(zhì)健康, 發(fā)育良好的仔稚魚[體長(zhǎng) (1.190±0.028) cm, 體質(zhì)量(0.032±0.001) g]轉(zhuǎn)至實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖, 共布3個(gè)玻璃缸(40 cm×40 cm×40 cm), 水溫19—22℃, 鹽度30‰, 養(yǎng)殖密度為2尾/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

從30 dpb時(shí)開始, 暫養(yǎng)4d, 35 dpb開始正式實(shí)驗(yàn)。設(shè)置3組, 分別為: 短光照組(L∶D=8∶16, 光照時(shí)間為7:00—15:00)、長(zhǎng)光照組(L∶D=16∶8, 光照時(shí)間為7:00—23:00)和對(duì)照組(L∶D=12∶12, 光照時(shí)間為7:00—19:00), 因在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 所有光照條件均為8.5 W節(jié)能燈補(bǔ)充, 其他條件不變。每日8:00和15:00投喂鹵蟲無節(jié)幼體, 實(shí)驗(yàn)第10天添加配合飼料。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)布研究結(jié)果顯示, 卵巢在35 dpb左右開始出現(xiàn)分化, 精巢分化時(shí)間較晚, 在60—65 dpb左右, 70 dpb出現(xiàn)明顯的精原細(xì)胞和輸精管, 故本實(shí)驗(yàn)從35 dpb為開始實(shí)驗(yàn)的第1天, 實(shí)驗(yàn)到第21天為止。從1d起, 每3天采1次樣, 隨機(jī)取2—3尾許氏平鲉仔稚魚樣品于Bouin固定液中保存;取8尾許氏平鲉仔稚魚樣品在液氮中快速冷凍, 于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 石蠟組織切片及觀察

許氏平鲉仔稚魚全魚經(jīng)過Bouin固定液固定24h后, 經(jīng)梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 浸蠟, 石蠟包埋, 待石蠟?zāi)毯笮拚瀴K, 全魚連續(xù)縱切, 切片厚度為7 μm, 展片, 38℃烘箱烘干, 進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(H.E染色), 中性樹脂封片, 晾干。在顯微鏡下觀察拍照, 并統(tǒng)計(jì)性別比例。

1.4 許氏平鲉仔稚魚雌二醇(E2)和睪酮(T)含量的測(cè)定

因稚魚規(guī)格太小, 無法抽取血液, 故使用未去除內(nèi)臟團(tuán)的全魚組織勻漿進(jìn)行激素測(cè)定。每1尾魚為一個(gè)樣本, 1個(gè)時(shí)期3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 共3尾魚。制備全魚組織勻漿, 采用碘I125雌二醇放射免疫分析試劑盒(九鼎, 天津)及RIA液相平衡競(jìng)爭(zhēng)放射性免疫分析法測(cè)定E2和T的水平, 參考Shi等[8]的方法。

1.5 許氏平鲉仔稚魚性別分化相關(guān)基因表達(dá)分析

運(yùn)用Trizol法按照相應(yīng)的步驟提取全魚總RNA, 每個(gè)時(shí)期3尾, 使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa, 日本)去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

cyp19a1a(FJ594995.2)、ERβ2(HQ452829.1)、foxl2(JN998083.1)和βactin(KF430616.1)基因序列來源于GenBank,ERα、sox9、amh、sox3和dmrt1的基因序列均來源于許氏平鲉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號(hào):SRR4409372)。實(shí)驗(yàn)中所用的特異性引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)(表 1)。

采用SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa, 日本)在StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, 美國(guó))上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)性腺分化相關(guān)基因表達(dá)量, 每個(gè)時(shí)期5尾魚的cDNA(500 ng/μL)等體積混為一個(gè)樣本。實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系及上機(jī)程序見本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文章[9]。以β-actin為內(nèi)參基因, 根據(jù)2－ΔΔCt法計(jì)算得到許氏平鲉性腺分化相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA), 探究許氏平鲉稚魚不同發(fā)育階段以及不同光周期下各數(shù)據(jù)的差異顯著性, 在假定方差齊性的條件下, 作Tukey-HSD多重比較分析(若不滿足方差齊性, 采用Games-Howell法)。所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 不同光周期對(duì)許氏平鲉性腺發(fā)育及分化的影響

根據(jù)本研究室前期研究結(jié)果, 35 dpb左右稚魚性腺開始分化, 并且卵巢先分化。一部分性腺出現(xiàn)小的裂隙, 可能發(fā)育為卵巢腔, 性腺雙葉大小差別明顯, 這類性腺一般發(fā)育為卵巢; 另外一部分性腺雙葉大小差別不明顯, 性腺中無裂隙出現(xiàn), 這類性腺一般發(fā)育為精巢(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

處理第0天, 許氏平鲉性腺分化已開始, 根據(jù)對(duì)全魚組織學(xué)切片分析(圖 1), 卵巢發(fā)育程度為長(zhǎng)光照組發(fā)育最快, 短光照組最慢。該時(shí)期卵巢中有血管的深入和卵巢腔的出現(xiàn), 在短光照組中, 卵巢體積較小, 卵巢腔的裂隙較小, 而對(duì)照組與長(zhǎng)光照組卵巢腔裂隙較大, 微血管明顯, 卵巢體積相對(duì)較大,其中長(zhǎng)光照組卵巢體積最大。而2個(gè)處理組中精巢均呈梨形或橢圓形, 性腺雙葉大小差別不明顯, 精巢發(fā)育程度差別不明顯。統(tǒng)計(jì)性別比例結(jié)果為短光照組、對(duì)照組和長(zhǎng)光照組的雌雄比均為1∶1。

處理21d后(圖 2), 卵巢的發(fā)育程度為對(duì)照組最快, 短光照組發(fā)育最慢, 對(duì)照組中卵巢體積最大, 卵巢腔發(fā)育較為完整, 并可見數(shù)個(gè)卵母細(xì)胞; 短光照組和長(zhǎng)光照組的卵巢腔裂隙較小, 卵巢體積最小。精巢的發(fā)育程度為對(duì)照組和短光照組大于長(zhǎng)光照組, 對(duì)照組精巢中出現(xiàn)輸精管, 短光照組精巢中可觀察到數(shù)個(gè)精原細(xì)胞, 精巢分化開始, 對(duì)照組和短光照組中的精巢體積均較長(zhǎng)光照組中的大, 長(zhǎng)光照組中未出現(xiàn)輸精管或精原細(xì)胞的出現(xiàn), 體積較小,呈梨形(圖 2)。統(tǒng)計(jì)性別比例結(jié)果為: 短光照組和長(zhǎng)光照組雌雄比無變化, 均為1∶1, 對(duì)照組雌性率升高, 達(dá)到66.7%, 說明光周期為L(zhǎng)∶D=12∶12時(shí), 性腺分化偏雌性發(fā)育。

綜合分析性腺發(fā)育程度和性別比例, 可以看出非自然光周期(短光照和長(zhǎng)光照)均會(huì)影響性腺分化, 可能導(dǎo)致了性腺發(fā)育速度減慢, 同時(shí)通過對(duì)長(zhǎng)光照和短光照樣品組織學(xué)比較發(fā)現(xiàn)在性腺發(fā)育受影響的情況下, 短光照中精巢發(fā)育較長(zhǎng)光照快, 說明短光照可能會(huì)導(dǎo)致部分性腺雄性化。

2.2 不同光周期對(duì)許氏平鲉性類固醇激素水平的影響

如圖 3A所示, 在對(duì)照組中, 實(shí)驗(yàn)0—6d無顯著性變化, 9d時(shí), E2水平顯著上升至最大值(P＜0.05),12d時(shí)E2水平顯著下降(P＜0.05), 之后趨于平穩(wěn); 在短光照組中, 實(shí)驗(yàn)第3天E2水平顯著上升(P＜0.05),3—15d E2水平基本處于較高水平, 18d后顯著下降為(P＜0.05), 之后趨于平穩(wěn); 長(zhǎng)光照組處理0—3d無顯著性變化, 6d時(shí), E2水平顯著上升(P＜0.05)后開始下降, 至12d時(shí)E2水平顯著下降(P＜0.05), 之后趨于平穩(wěn)?？梢娫趯?shí)驗(yàn)整個(gè)階段中, E2水平波動(dòng)基本出現(xiàn)在0—18d。并且在短光照中, E2水平更早出現(xiàn)峰值。

如圖 3B所示, 對(duì)照組0—6d時(shí), T的含量處于較低水平, 9d時(shí), T水平顯著上升至最大值(P＜0.05),12d時(shí)T水平顯著下降(P＜0.05), 之后趨于平穩(wěn); 短光照組0—6d, T水平逐漸降低(P＜0.05), 到第9天開始上升并維持至15d之間, T水平基本處于較高水平, 至18d的T水平顯著下降(P＜0.05), 之后趨于平穩(wěn); 長(zhǎng)光照組第3天T水平顯著下降, 第6天時(shí)顯著上升至最大值(P＜0.05), 并在12d之前含量一直維持在較高水平, 第15天時(shí)開始顯著下降(P＜0.05),之后趨于平穩(wěn)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中, T水平在3個(gè)處理中均在9d時(shí)達(dá)到峰值, 到18—21d, 各組之間趨于穩(wěn)定。

表 1 基因表達(dá)分析的特異性引物Tab. 1 Primer sequences for mRNA expression analysis

2.3 光周期對(duì)許氏平鲉性腺分化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

如圖 4所示,cyp19a1a在短光照組第1天時(shí)開始顯著下降(P＜0.05), 第9天時(shí)進(jìn)一步顯著下降(P＜0.05), 之后水平基本保持不變; 對(duì)照組中從第6天逐漸下降至接近0, 之后處于極低水平, 21d時(shí)有所上升, 但仍處于較低水平; 長(zhǎng)光照組9d之后處于極低水平, 21d時(shí)有所上升, 但仍處于較低水平。可見cyp19a1a在實(shí)驗(yàn)第6天均出現(xiàn)下降趨勢(shì), 并在后期處于較低的穩(wěn)定期, 不同處理之間無明顯差異。ERα的相對(duì)表達(dá)水平在短光照組的波動(dòng)類似cyp19a1a, 呈波動(dòng)下降趨勢(shì), 從第3天開始下降, 在15d時(shí)出現(xiàn)一個(gè)較小的峰值, 然后趨于穩(wěn)定; 對(duì)照組和長(zhǎng)光照組均呈先上升后下降的趨勢(shì), 對(duì)照組中1—12d逐漸上升至峰值后逐漸下降, 長(zhǎng)光照中1—9d逐漸上升峰值后有所下降, 但整體處于較高水平?？梢娫?個(gè)處理組中, 短光照組的ERα在中后期表達(dá)受到了明顯的抑制。ERβ2的相對(duì)表達(dá)水平在短光照組第6天時(shí)顯著上升但在9d時(shí)迅速顯著下降(P＜0.05), 之后均處于極低水平, 21d時(shí)有所上升;對(duì)照組和長(zhǎng)光照組均呈穩(wěn)定下降的趨勢(shì), 并在9d后趨近于0。類似于ERα, 短光照組對(duì)ERβ2表達(dá)模式有同樣的影響。foxl2的相對(duì)表達(dá)水平在短光照組6d時(shí)顯著上升并在9d時(shí)顯著下降至極低水平, 之后有輕微上升趨勢(shì); 對(duì)照組和長(zhǎng)光照組均呈先下降后趨于平穩(wěn)再上升的趨勢(shì)。在對(duì)照組中第6天后逐漸下降并在之后處于極低水平, 21d時(shí)有所上升; 而在長(zhǎng)光照組中第9天逐漸下降并在之后處于極低水平,21d時(shí)有所上升。由此可見相對(duì)短光照處理, 長(zhǎng)光照處理對(duì)foxl2的表達(dá)未見影響。

圖 1 不同光周期下第0天許氏平鲉的性腺組織切片F(xiàn)ig. 1 The gonads histologic section of Sebastes schlegelii at day 0 under the different photoperiod conditions

如圖 5所示,sox3的相對(duì)表達(dá)水平在短光照組3—6d顯著上升至最大然后在第9天時(shí)開始下降,18d時(shí)顯著上升至較高水平(P＜0.05)然后在21d時(shí)開始下降; 對(duì)照組處理階段在21d之前sox3均處于較低水平, 21d時(shí)顯著上升(P＜0.05); 在長(zhǎng)光照組中第6天和18d處于較高水平, 其他時(shí)期均處于較低水平。sox9的相對(duì)表達(dá)水平在短光照組1—6d逐漸上升但在第9天顯著下降至較低水平(P＜0.05), 第21天逐漸上升; 對(duì)照組在1—6d逐漸下降后趨于穩(wěn)定,21d時(shí)顯著上升(P＜0.05); 長(zhǎng)光照組在6d后逐漸下降后保持在較低水平。sox9的表達(dá)模式在長(zhǎng)光照組中并未受影響, 但在短光照處理下出現(xiàn)不同的表達(dá)模式, 尤其是在6d前顯著上升。amh的表達(dá)水平在短光照組中從第3天時(shí)顯著下降(P＜0.05), 之后保持在較低水平; 對(duì)照組在1—6d逐漸下降之后基本不變, 但在18d時(shí)顯著上升(P＜0.05); 長(zhǎng)光照組總體呈上升趨勢(shì), 21d上升至最大值。不同的光照對(duì)amh的表達(dá)模式影響顯著, 短光照抑制其表達(dá), 長(zhǎng)光照則相反。dmrt1的表達(dá)水平在短光照組中除了第6d外,其他時(shí)期均處于較低水平; 對(duì)照組中15d之前基本處于較低水平, 15d時(shí)顯著上升(P＜0.05), 之后逐漸下降; 長(zhǎng)光照組中除了第6和第15天外, 其他時(shí)期均處于較低水平, 其中15d時(shí)達(dá)到最大值。

圖 2 不同光周期下第21天許氏平鲉的性腺組織切片F(xiàn)ig. 2 The gonads histologic section of Sebastes schlegelii at day 21 under the different photoperiod conditions

3 討論

3.1 光周期對(duì)許氏平鲉性腺分化的影響

魚類生殖受多種因素影響, 在中高緯度季節(jié)變化中, 光周期對(duì)其影響尤其大[10]。本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表結(jié)果顯示, 本實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(30 dpb)性腺已開始分化。本實(shí)驗(yàn)處理21d時(shí), 對(duì)照組的卵巢發(fā)育速度最快, 其次是長(zhǎng)光照組, 短光照組最慢, 對(duì)照組和短光照組精巢的發(fā)育速度差異不明顯, 但快于長(zhǎng)光照組,短光照組和長(zhǎng)光照組雌雄比無變化, 對(duì)照組雌雄比升高, 光周期為L(zhǎng)∶D=12∶12時(shí), 性腺分化偏雌性發(fā)育。綜合分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果性腺發(fā)育程度和性別比例, 可以看出非自然的光周期尤其是較短的光照,均會(huì)不同程度地影響性腺分化時(shí)期性腺發(fā)育程度;并且短光照會(huì)導(dǎo)致部分性腺雄性化。在加利福尼亞銀漢魚的性腺分化時(shí)期, 長(zhǎng)光照(L∶D=15∶9)處理下性腺分化偏雌性發(fā)育, 短光照(L∶D=12∶12)處理下偏雄性發(fā)育[1], 這與本研究的結(jié)果有所不同。從性腺發(fā)育速度來看, 在本研究中卵巢與精巢對(duì)光周期的響應(yīng)相反, 對(duì)照組中卵巢和精巢發(fā)育均較快。在松江鱸(Trachidermis fasciatus)[11]生長(zhǎng)和性腺發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期, 長(zhǎng)光照14h較自然光照周期有利于促進(jìn)松江鱸的性腺發(fā)育, 長(zhǎng)光照組的卵巢較自然光對(duì)照組發(fā)育更快。月銀漢魚[3]、金魚[4]等性腺發(fā)育研究表明, 光照時(shí)間越長(zhǎng)發(fā)育成熟速度越快, 但對(duì)大西洋鮭(Salmo salar)的研究結(jié)果相反[12]。因此,這說明在同一光照周期下, 不同物種的性腺分化和發(fā)育速度對(duì)光照周期的應(yīng)答和敏感程度不同。

3.2 光周期對(duì)許氏平鲉全魚性類固醇激素水平的影響

光照周期在硬骨魚類性腺分化、發(fā)育和成熟等過程中起著重要的作用, 主要是各種性激素通過下丘腦-垂體-性腺軸實(shí)現(xiàn)調(diào)控的[7], 其中包括E2、T、11-KT等。Frisch[13]的研究表明, E2和11-KT在魚類性別改變中也起著重要的作用, 而T不能直接影響性別的改變, 但是可以間接地通過影響其他激素(如E2)的合成來影響性別改變。在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)性腺分化中, 尤其是卵巢分化中, 雌激素的合成起著重要的作用[14]。在本研究中, 在3組不同光周期處理下第9天時(shí), E2和T均達(dá)到較高水平, 12d時(shí)對(duì)照組E2和T水平下降到較低水平, 而長(zhǎng)光照組E2和T水平下降到較低水平是在12d和15d, 短光照組E2和T在18d時(shí)才下降到較低水平。結(jié)合組織切片結(jié)果可知, 性腺分化過程中的前期E2和T處于較高水平, 之后下降到較低水平。因此, 對(duì)照組卵巢發(fā)育最快, 短光照組的精巢發(fā)育較快, 可能是由于T的含量處于較高水平時(shí)間較長(zhǎng)所導(dǎo)致。綜合來說, 光周期為L(zhǎng)∶D=12∶12時(shí)有利于許氏平鲉的性腺分化,但不同的物種E2和T對(duì)光周期的應(yīng)答不同, 比如對(duì)半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[15]的研究中光周期對(duì)T和E2的影響不顯著; 在對(duì)虹鱒[16]的研究中, 增加光照周期, E2和T含量增高, 在短光照下, 2種激素含量上升更快, 證明短光照刺激使E2和T含量升高,短光照對(duì)虹鱒性腺成熟發(fā)育非常重要。

圖 3 不同光周期對(duì)許氏平鲉仔稚魚E2(A)、T(B)水平的影響Fig. 3 Effects of the E2 (A) and T (B) level of Sebastes schlegelii larvae under different photoperiod condition

3.3 光周期對(duì)許氏平鲉性腺分化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

目前, 大多數(shù)對(duì)硬骨魚類性別分化相關(guān)基因的研究表明, 與性腺分化相關(guān)的基因主要有dmrt基因家族、cyp11a1基因、sox基因家族、核受體基因(雌激素受體和雄激素受體)、amh基因和foxl2基因等[17]。其中cyp19a1a、ERα、ERβ2和foxl2基因與卵巢的分化密切相關(guān), 在卵巢分化中起著重要的調(diào)控作用; 而sox3、sox9、amh和dmrt1基因與精巢的分化相關(guān), 但sox3基因在一些魚類的卵巢分化也起著一定的作用[18]。外界環(huán)境通過這些基因來調(diào)控性腺分化和發(fā)育等過程。

圖 4 不同光周期下許氏平鲉卵巢分化相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平(A、B、C和D分別為cyp19a1a、 ERα、ERβ2和foxl2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平)Fig. 4 The relative mRNA expression level of ovary differentiation related genes in Sebastes schlegelii under different photoperiod condition (A, B, C and D showed the relative mRNA expression level of cyp19a1a, ERα, ERβ2 and foxl2, respectively)

cyp19a1a是介導(dǎo)雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶基因, 被認(rèn)為是一個(gè)魚類卵巢分化的早期標(biāo)志,并且在性腺分化過程中有重要作用[19]。研究表明,cyp19a1a基因只在卵巢中表達(dá), 在精巢中基本上沒有表達(dá), 并且其表達(dá)水平及活性與雌激素的合成緊密相連[18]。在暗紋東方鲀(Takifugu obscures)[20]性腺分化期間用芳香化酶抑制劑處理仔魚, 雌魚cyp19a基因表達(dá)被顯著抑制, 原始卵巢退化, 并向功能性精巢發(fā)育。在本研究中, 實(shí)驗(yàn)第1天(35 dpb)時(shí)性腺已開始分化, 在3組實(shí)驗(yàn)中cyp19a1a的表達(dá)量均逐漸下降, 之后穩(wěn)定在較低水平。在開始時(shí)3組的cyp19a1a的表達(dá)量處于較高水平, 可能是由于此時(shí)是卵巢分化時(shí)期, 21d時(shí)均已降低到最低水平, 但長(zhǎng)光照組表達(dá)量相對(duì)較高。結(jié)合組織切片初步推斷, 性腺分化時(shí)期光周期為L(zhǎng)∶D=12∶12時(shí), 性腺分化偏雌性發(fā)育, 較長(zhǎng)的光照時(shí)間可能導(dǎo)致卵巢發(fā)育速度加快, 短光照可能使精巢分化速度加快。

圖 5 不同光周期下許氏平鲉精巢分化相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平(A、B、C和D分別為sox3、sox9、amh和dmrt1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平)Fig. 5 The relative mRNA expression level of testis differentiation related genes in Sebastes schlegelii under different photoperiod condition (A, B, C and D showed the relative mRNA expression level of sox3, sox9, amh and dmrt1, respectively)

在魚類中ER包含3種類型, 分別為ERα、ERβ1和ERβ2, 參與魚類的性別分化等生理過程[21]。有研究表明, 核受體也可以調(diào)控芳香化酶[22]。在本研究中,ERβ2、foxl2和cyp19a1a的表達(dá)水平的總趨勢(shì)基本一致,ERβ2的表達(dá)可能也和cyp19a1a的表達(dá)有關(guān)。21d時(shí), 在短光照組中ERβ2的表達(dá)顯著上升, 說明ERβ2可能在精巢的分化中也起一定的作用。在金錢魚[6]的研究表明, 雌激素受體可能在精巢和卵巢發(fā)育中都具有重要的作用。在甲狀腺激素誘導(dǎo)斑馬魚(Danio rerio)[23]雄性化的研究中, 性腺分化期間,esr1、esr2a和esr2b的表達(dá)水平下降。而在本研究中ERα與ERβ2、foxl2和cyp19a1a的表達(dá)模式不同, 在短光照組中, 除了第1天處于較高水平, 之后一直處于較低水平, 長(zhǎng)光照組的ERα表達(dá)水平基本比其他兩組都高, 對(duì)照組次之。這說明短光照可能抑制了ERα的表達(dá), 長(zhǎng)光照可能會(huì)促進(jìn)ERα的表達(dá), 但在性腺分化中起的作用并不大。

foxl2基因是目前發(fā)現(xiàn)的最早的脊椎動(dòng)物卵巢分化的標(biāo)志性啟動(dòng)基因, 對(duì)卵巢芳香化酶和卵巢分化起重要作用[17]。foxl2在烏鱧(Channa argus)[24]早期性腺分化中起重要作用, 在1—11日齡表達(dá)顯著上調(diào), 27日齡時(shí)在卵巢中表達(dá)量升高。有研究表達(dá)明,foxl2參與cyp19a1a的上游調(diào)節(jié),foxl2和cyp19a1a的表達(dá)具有顯著的正相關(guān)關(guān)系[25]。在本研究中,foxl2表達(dá)水平總趨勢(shì)與cyp19a1a的一致, 開始時(shí)處于較高水平可能是由于此時(shí)期為卵巢分化時(shí)期, 精巢未分化, 隨著卵巢的逐漸發(fā)育,foxl2和cyp19a1a的表達(dá)逐漸降低, 最后穩(wěn)定在較低水平。在短光照處理的第6天,foxl2的相對(duì)表達(dá)水平突然上升, 可能是由于樣品的原因, 具體仍需進(jìn)一步研究。光周期為L(zhǎng)∶D=12∶12在21d時(shí)foxl2相對(duì)表達(dá)水平較其他兩組顯著上升, 這與組織切片結(jié)果一致, 進(jìn)一步說明非自然光照有可能影響性腺的發(fā)育和分化。

sox3和sox9均屬于sox基因家族, 與SYR基因序列有較高的相似性, 并在性腺分化中起著重要的作用。dmrt1基因是dmrt基因家族中的一員, 該基因被認(rèn)為是性別分化基因, 與雌雄性別發(fā)育相關(guān)[17,26]。Sutton等[27]的研究表明, 特殊品系的小鼠中sox3基因通過介導(dǎo)sox9表達(dá)上調(diào)的途徑誘導(dǎo)精巢的分化。常重杰等[28]研究發(fā)現(xiàn), 大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)的sox9基因的表達(dá)水平在精巢中顯著較高, 可能精巢分化與形成有一定的關(guān)系。在本研究中,sox3、sox9和dmrt1基因的表達(dá)水平變化總趨勢(shì)基本一致, 也可能是由于sox9基因是sox3和dmrt1基因上游調(diào)節(jié)基因, 調(diào)節(jié)sox3和dmrt1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。sox3、sox9和dmrt1基因在實(shí)驗(yàn)后期表達(dá)量逐漸升高可能與精巢分化較晚有關(guān)。結(jié)合組織切片結(jié)果, 短光照組的sox9和dmrt1的表達(dá)水平顯著上升可能與精巢的分化有關(guān), 進(jìn)一步說明, 短光照有利于精巢的分化。

目前對(duì)amh基因的研究表明, 雖然在硬骨魚類中沒有繆勒氏管的存在, 但在其性腺中也檢測(cè)到了amh, 這說明amh可能在魚類性腺分化和雄性性腺的維持中起一定的作用[29]。在斑馬魚[30]性腺分化中,amh的表達(dá)呈性別二態(tài)性, 在31日齡的幼魚的精巢中amh較高。在本實(shí)驗(yàn)后期amh的相對(duì)表達(dá)水平逐漸升高, 這可能與精巢的后分化有關(guān)。但在21d時(shí),amh與sox3、sox9和dmrt1基因的表達(dá)模式不同, 在長(zhǎng)光照下amh的表達(dá)顯著上升, 隨著光照時(shí)間的增長(zhǎng)amh的表達(dá)水平逐漸上升, 初步推測(cè),amh可能與卵巢分化有一定的關(guān)系。

本研究通過對(duì)許氏平鲉30 dph的仔稚魚進(jìn)行不同光周期處理, 對(duì)其性腺分化及發(fā)育情況進(jìn)行探索,發(fā)現(xiàn)非自然的光周期尤其是較短的光照, 均會(huì)不同程度地影響性腺分化時(shí)期性腺發(fā)育程度, 并且短光照會(huì)導(dǎo)致部分性腺雄性化; E2水平在非自然光周期影響尤其是在短光照下更早出現(xiàn)峰值, 而T在不同處理下水平均較高; 4個(gè)卵巢分化相關(guān)基因cyp19a1a、ERα、ERβ2和foxl2的相對(duì)表達(dá)水平在短光照處理下均受到抑制, 聯(lián)系組織切片結(jié)果可發(fā)現(xiàn), 短光照在一定層面上影響卵巢的發(fā)育, 導(dǎo)致性腺雄性化;4個(gè)精巢分化相關(guān)基因sox3、sox9、amh和dmrt1的相對(duì)表達(dá)水平未見明顯規(guī)律, 可能與精巢分化時(shí)間較晚有關(guān)。綜合而言, 較短的光照會(huì)影響性腺的發(fā)育以及性腺的分化, 抑制卵巢分化基因的表達(dá), 誘導(dǎo)原始性腺雄性化。