杜賈賈 江 飚 唐嘉嘉 李安興

(中山大學生命科學學院，中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東省水生經濟動物繁育重點實驗室，廣州 510275)

L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase, LAAO)是一類特異性氧化L-氨基酸生成α-酮酸、氨和H2O2的黃素蛋白酶[1—3], 廣泛存在于自然界的各種生物中: 細菌、真菌、藻類、魚類和哺乳動物等[4]。目前, 蛇毒LAAO研究最為深入, 其含量豐富, 性質穩(wěn)定, 并且生物活性較廣[5—8]。研究表明, LAAO具有抑制細菌生長、殺傷寄生蟲、誘導細胞凋亡和降低艾滋病毒活性等功能, 在脊椎動物和無脊椎動物的免疫防御中發(fā)揮重要作用[9—12]。

目前關于魚類LAAO僅見少量報道。Nagashima等[13]和Kitani等[14]分別從許氏平鲉(Sebastes schlegeli)皮膚黏液和血清中分離純化出LAAO, 體外試驗表明其具有良好抗菌活性。Nagashima等[9]還從棘頭床杜父魚(Myoxocephalus polyacanthocephalus)皮膚黏液中分離純化出LAAO, 發(fā)現(xiàn)其同樣具有良好抑菌活性, 進一步研究發(fā)現(xiàn), 加入過氧化氫酶后, 其抗菌能力完全喪失, 推測其抗菌活性與H2O2有關。Wang等[15]從黃斑籃子魚(Siganus oramin)血清中分離純化的LAAO不但可抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichia coli)的活性, 還可有效殺滅刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)幼蟲和布氏錐蟲(Trypanosoma brucei); 籃子魚LAAO能引起刺激隱核蟲幼蟲纖毛脫落, 大核腫脹, 外膜破裂和胞質滲出, 導致幼蟲死亡[16,17]。在自然條件下, 籃子魚是刺激隱核蟲非易感宿主, LAAO可能是其抵抗刺激隱核蟲感染的主要因素[18]。

近年來, 斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)養(yǎng)殖漁業(yè)快速發(fā)展, 但隨著養(yǎng)殖密度增加和近海岸水質惡化, 刺激隱核蟲病大量暴發(fā), 給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失[19,20]。該實驗室前期轉錄組結果顯示, 在感染刺激隱核蟲后, 石斑魚LAAO表達量變化明顯, 推測其可能參與了石斑魚抵抗病原感染的免疫應答。為進一步了解石斑魚LAAO的基因序列特征和在刺激隱核蟲脅迫中的表達模式, 該研究克隆獲得石斑魚LAAO基因, 并對其序列結構特征進行分析,檢測其在組織分布情況和刺激隱核蟲感染后的表達情況。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚與刺激隱核蟲

斜帶石斑魚(90—110 g)購自廣東省海洋漁業(yè)試驗中心, 隨機選取3條進行體表寄生蟲檢查, 同時將石斑魚血清兩倍稀釋后取100 μL, 56℃ 30min孵育以滅活補體, 隨后加入100 μL含200個刺激隱核蟲幼蟲的滅菌海水, 室溫孵育1h后, 使用倒置顯微鏡觀察其是否出現(xiàn)游動緩慢, 纖毛交聯(lián), 蟲體凝集等阻動現(xiàn)象, 以確保試驗用魚未感染過刺激隱核蟲[21]。

試驗前暫養(yǎng)兩周, 每天投喂2次商業(yè)顆粒飼料,日投喂量為魚體重的2%—3%。

根據Dan等[22]的刺激隱核蟲傳代方法, 從感染了刺激隱核蟲的卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)中分離得到包囊, 收集幼蟲以進行石斑魚感染實驗。

1.2 RNA提取和基因克隆

根據說明書步驟, 使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取斜帶石斑魚頭腎RNA, 用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和A260/A280分別檢測RNA完整性和純度。利用Rever-Tra Ace反轉錄試劑盒(TOYOBO)進行cDNA第一鏈的合成。

石斑魚轉錄組測序結果中有兩段序列注釋到LAAO上,EcLAAO-1和EcLAAO-2。據此設計特異性引物(表 1), 以石斑魚cDNA為模板, 使用Prime-STAR HS DNA高保真聚合酶(TaKaRa)進行擴增,PCR程序為98℃ 3min; 98℃ 10s, 60℃ 15s, 72℃2min, 35個循環(huán); 72℃ 8min。陽性條帶用膠回收試劑盒(Omega)進行回收純化, 加A尾后與PMD19T(TaKaRa)質粒連接, 轉入DH5α感受態(tài)細胞, 經菌液PCR驗證后的陽性克隆進行測序驗證。

表 1 試驗所用引物Tab. 1 Primers used in the study

1.3 分子特征和進化分析

使用ORF-Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析測序結果的開放讀碼框, ExPAsy(https://web.expasy.org/compute_pi/)預測蛋白分子量與等電點, SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽序列, Smart Main Page(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析蛋白保守結構域, NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分析N-糖基化位點, NCBI BLASTp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行氨基酸多序列比對, MEGA7.0軟件鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 LAAO基因組織表達分析

根據Jiang等[23]石斑魚組織樣品采集方法, 麻醉后取樣3尾健康石斑魚鰓、皮膚、胸腺、肝臟、脾臟、中腸、后腸、頭腎、尾腎、肌肉、心臟和大腦共12個組織。參照1.2方法提取組織樣品RNA,并根據PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)說明書步驟將其反轉錄為cDNA樣品。根據測序結果設計熒光定量引物(表 1), 以組織cDNA為模板,β-actin為內參基因, 使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix(TaKaRa)試劑, 在熒光定量PCR儀(Roche LightCycler 480)上進行定量分析,擴增反應程序為: 95℃ 3min; 95℃ 5s, 60℃ 30s,40個循環(huán), 每個組織樣品3個重復。根據溶解曲線分析擴增產物的特異性, 使用2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達量[24]。

1.5 刺激隱核蟲感染后LAAO的表達模式

將石斑魚隨機分為兩組: 感染組和對照組, 每組40尾魚。參照Dan等[22]的刺激隱核蟲傳代和感染方法, 感染組感染劑量為1.0×104幼蟲/魚, 5 L海水/魚, 感染2h后將試驗魚轉移至含干凈海水的桶中養(yǎng)殖, 對照組則放在不含刺激隱核蟲幼蟲的水體中以同樣方式處理。在感染后6h、12h、24h、48h和72h時間點, 感染組和對照組分別取3尾魚的鰓和脾臟組織, 參照1.4的方法提取組織RNA、合成cDNA和采用RT-PCR分析感染后石斑魚LAAOmRNA表達量變化。使用SPSS軟件獨立樣本t檢驗進行試驗組和對照組的差異顯著性分析, 顯著性水平設為P＜0.05。

2 結果

2.1 斜帶石斑魚LAAO cDNA克隆及序列特征

該試驗克隆獲得了EcLAAO-1和EcLAAO-2 cDNA序列, ORF長度分別為1536和1569 bp, 編碼511和522個氨基酸, 理論蛋白分子量大小為56.75和58.52 kD, 等電點為6.29和6.20。兩個蛋白都有信號肽序列(1—28 aa); EcLAAO-1含跨膜結構(5—27 aa),位于信號肽序列內, EcLAAO-2無跨膜結構; 經SMART軟件分析兩者都包含Amino_oxidase結構域(67—507 aa、71—501 aa); 序列分析顯示皆含LAAO保守序列: DBM(64—87 aa、68—91 aa)和GG motif(91—98 aa、95—102 aa); NetNGlyc軟件分析N-糖基化位點表明: EcLAAO-1有5個糖基化位點, EcLAAO-2含3個糖基化位點。

2.2 同源性分析

氨基酸序列比對顯示, EcLAAO-1與EcLAAO-2序列相似度為61.09%, 皆與其他魚類氨基酸序列有較高的一致性, EcLAAO-1與尖吻鱸相似度高達90.61%, EcLAAO-2與大黃魚LAAO蛋白相似度最高, 為78.90%。但與哺乳動物序列一致性相對較低, 例如EcLAAO-1和EcLAAO-2與大鼠的相似度分別為47.9%和47.71%。與不同物種的LAAO氨基酸序列多重比對顯示, 不同物種間氨基酸序列存在差異, 但Amino_oxidase結構域高度保守。

MEGA7.0鄰接法構建進化樹結果顯示, 硬骨魚LAAO的14個分子聚為一支, 并與爬行綱、鳥綱和哺乳綱聚為一大支, 腹足綱則位于另一支。在硬骨魚綱中, EcLAAO-1與伯氏樸麗魚、奈氏樸麗魚和斑馬擬麗魚聚在一支; EcLAAO-2與貝氏隆頭魚聚為一支(圖 1)。

2.3 組織表達分析

為研究LAAO在健康石斑魚各組織的分布情況, 使用RT-PCR對12個組織進行了分析, 結果顯示,EcLAAO-1和EcLAAO-2在石斑魚12個組織中都有表達。2個基因均在皮膚、鰓、胸腺、肌肉和肝臟中有較高的表達量, 心臟、腦、脾臟、頭腎和后腎中表達量則較少, 但EcLAAO-1在中腸和后腸表達量較高, 而EcLAAO-2則在腸道組織中表達量較低(圖 2)。

圖 1 LAAO系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of LAAO

2.4 刺激隱核蟲感染后LAAO的表達模式

該試驗采用RT-PCR分析石斑魚感染刺激隱核蟲后不同時間點LAAO表達特性的變化, 結果顯示,刺激隱核蟲感染后, 石斑魚鰓和脾臟LAAO表達量均出現(xiàn)明顯升高(P＜0.05)。鰓組織EcLAAO-1,Ec-LAAO-2表達量在感染后迅速上升, 第12h達到峰值,第24h顯著下降(P＜0.05), 隨后EcLAAO-1恢復到對照組水平, 而EcLAAO-2仍顯著低于對照組(P＜0.05)。脾臟組織中EcLAAO-1表達量在感染后第6h明顯升高(P＜0.05), 隨后均保持高于對照組的表達水平。EcLAAO-2在感染早期(6h)表達量顯著下降(P＜0.05),第12h開始升高, 并在第24h達到最高值(P＜0.05), 隨后下降至對照組水平(圖 3)。

圖 2 斜帶石斑魚不同組織中EcLAAO-1(A)和EcLAAO-2(B)表達量Fig. 2 Expression of EcLAAO-1(A) and EcLAAO-2(B) in different tissues of E. coioides

3 討論

該研究克隆獲得2個斜帶石斑魚LAAOcDNA序列, 并對其序列特征和感染刺激隱核蟲后表達模式進行了分析。EcLAAO-1和EcLAAO-2理論蛋白分子量大小為56.75和58.52 kD, 與其他海洋動物的LAAO單體大小相近[25]。作為胞外分泌蛋白,LAAO具有信號肽序列[4], 預測結果顯示2個石斑魚LAAO序列均具有信號肽。研究表明, LAAO多為糖蛋白[5], 糖基化位點位于酶活性位點附近[26], 通過與靶細胞表面唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素結合從而錨定在細胞膜上, 隨后生成高濃度的H2O2, 繼而誘導細胞凋亡[27—29], 在石斑魚EcLAAO-1和Ec-LAAO-2也分別發(fā)現(xiàn)了5個和3個N-糖基化位點, 推測其有助于LAAO與病原結合。保守結構域分析顯示EcLAAO-1和EcLAAO-2均含Amino_ oxidase結構域(AOD), AOD結構在含黃素胺氧化酶家族中高度保守, 包括L-氨基酸氧化酶、單胺氧化酶和黃素單胺氧化酶, AOD結構包含三個子域: FAD結合域、螺旋域和底物結合域[30,31], 其中FAD作為LAAO的輔因子, 在酶促反應中催化電子轉移[32]; 底物結合域和螺旋域可在酶表面形成Y型通道, 以便底物進入與活性位點結合, 產物釋放, 均與酶發(fā)揮生物學活性緊密相關[5,33]。除此之外, 石斑魚LAAO還具有LAAO保守序列: DBM和GG motif, DBM可與輔酶結合, GG-motif位于DBM序列后第四個氨基酸處, 可增加輔酶與LAAO結合的穩(wěn)定性[5,34]。同時EcLAAO-1和EcLAAO-2氨基酸序列與其他硬骨魚類LAAO具有較高的相似性, LAAO家族進化樹分析也顯示其聚為一支, 推測斜帶石斑魚LAAO與其他硬骨魚類LAAO可能有著相似的結構和功能。

研究表明, 海洋動物LAAO具有較強的抗菌殺蟲以及抗腫瘤作用[25,35—37], 廣泛分布在魚體的各個組織中, 包括皮膚黏液、血清、鰓和脾臟等[16]。斜帶石斑魚所有被檢組織中均發(fā)現(xiàn)LAAO存在,Ec-LAAO-1和EcLAAO-2在皮膚、鰓、胸腺、肌肉、肝臟中都有較高的表達量。許氏平鲉[14]、黃斑籃子魚[38]、棘頭床杜父魚[9]和大西洋鱈(Gadus morhua)[39]等硬骨魚的鰓和皮膚也含有大量的LAAO。鰓和皮膚是魚體與外界環(huán)境直接接觸的場所, 也是重要的黏膜相關淋巴組織[40,41], LAAO在免疫器官中的大量存在可能有助于其抵抗病原入侵。鰓是刺激隱核蟲主要寄生部位[42], 石斑魚感染刺激隱核蟲后,鰓組織EcLAAO-1和EcLAAO-2迅速響應, 在感染早期表達量顯著上調, 表明鰓組織LAAO主要在感染早期參與機體的免疫應答, 而在感染中后期參與機體免疫應答的程度有所下降。脾臟是魚體重要的外周免疫器官, 在魚體固有免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要作用[43]。在刺激隱核蟲感染后, 脾臟組織EcLAAO-1和EcLAAO-2表達量均出現(xiàn)顯著變化, 但兩者變化趨勢存在差異, 脾臟組織EcLAAO-1在感染后均處于較高的表達水平, 而EcLAAO-2表達量變化則略為滯后, 出現(xiàn)先下調后上升的趨勢, 而造成這種差異的調控模式還有待進一步研究。病原脅迫后LAAO表達量顯著變化的現(xiàn)象在其他研究中也有報道, 黃斑籃子魚鰓和脾臟LAAO在感染刺激隱核蟲后, 表達量迅速上調, 24h達到峰值[38]; 在感染了無乳鏈球菌的羅非魚腸道、肝臟和脾臟等組織均發(fā)現(xiàn)LAAO表達量升高[43]。大西洋鱈魚感染鰻弧菌后48h, 皮膚、鰓、脾臟和頭腎組織LAAO均出現(xiàn)明顯上調[39]。LAAO在機體抵抗病原感染時大量表達, 推測其參與魚體先天性免疫, 并在機體免疫調控中發(fā)揮重要的作用[38]。

圖 3 感染刺激隱核蟲后LAAO在斜帶石斑魚鰓(A和C)和脾臟(B和D)組織中的表達量變化Fig. 3 The relative level of LAAO in the gill (A and C) and spleen (B and D) of E. coioides at various time points post C. irritans challenge

同工酶是催化相同反應但氨基酸序列不同的一類酶, 存在于生物同一種屬或同一個體的不同組織內[45]。LAAO同工酶現(xiàn)象也有報道, 一種蛇毒中可同時存在酸堿性不同的LAAO[5]。魚體中也含有多種不同類型LAAO, 棘頭床杜父魚皮膚黏液中分離純化得到3種大小不同的LAAO, 其中LAAO-1和LAAO-3亞基大小相似, 與LAAO-2差異明顯, 三者含量不同, 但均具有酶活性和抗菌能力[9]。許氏平鲉皮膚黏液和血清中也發(fā)現(xiàn)了幾種結構不同的LAAO, 都具有抵抗細菌感染的能力, 但血清LAAO抗菌譜更寬, 在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮更為重