母尹楠 李婉茹 何亮華 陳 炯 陳新華

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315832; 2. 福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院，福建省海洋生物技術(shù)重點實驗室，福州 350002)

低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織低氧應(yīng)答的關(guān)鍵分子, 包括HIF-1、HIF-2和HIF-3[1]。其中, HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β 兩個亞基組成的具有轉(zhuǎn)錄激活活性的異源二聚體。HIF-1α的分子量約為120 kD, 在細(xì)胞內(nèi)的含量受到氧濃度的影響, 是HIF-1的功能調(diào)節(jié)亞基; HIF-1β在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量相對穩(wěn)定, 不受氧濃度影響[2]。目前, 對于哺乳動物HIF-1α蛋白的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)研究得較為透徹, HIF-1α一般具有1個基礎(chǔ)的HLH/PAS結(jié)構(gòu)區(qū), 主要負(fù)責(zé)HIF-1α與HIF-1β二聚化, 以及與靶基因啟動子的調(diào)控區(qū)結(jié)合, 調(diào)節(jié)靶基因表達(dá); 在HIF-1α序列的中部存在一個氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(ODDD), 控制其常氧降解, 對調(diào)節(jié)HIF-1活性起關(guān)鍵作用; 羧基末端含有2 個反式激活結(jié)構(gòu)域(CTAD)和1個保守的天冬氨酸殘基, 可以被缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子(FIH-1)識別, 阻礙HIF-1α與轉(zhuǎn)錄輔激活子CBP/p300結(jié)合[3,4]。在常氧狀態(tài)下,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的HIF-1α蛋白ODDD結(jié)構(gòu)域中的2個脯氨酸殘基(Pro402和Pro564), 被脯酰胺羥化酶(PHD)催化而發(fā)生羥基化, 導(dǎo)致HIF-1α與腫瘤抑制基因蛋白(Von Hippel-Lindau tumor suppressor, VHL)相互作用, 通過泛素蛋白酶體通路被降解[5,6]。當(dāng)?shù)脱醢l(fā)生時, 脯氨酰基的羥基化過程受到抑制, 穩(wěn)定狀態(tài)的HIF-1α蛋白在細(xì)胞內(nèi)累積, 并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移與HIF-1β結(jié)合形成二聚體HIF-1, HIF-1再與靶基因表達(dá)調(diào)控區(qū)的低氧應(yīng)答元件(HRE)結(jié)合, 從而調(diào)控血管生成、紅細(xì)胞生成、糖酵解等通路相關(guān)基因的表達(dá)[7—9]。

近年來研究發(fā)現(xiàn), 低氧還影響多個免疫過程,包括免疫細(xì)胞遷移、凋亡、病原吞噬、抗原遞呈以及細(xì)胞因子和抗菌因子的產(chǎn)生[9]。HIF-1α在多種免疫細(xì)胞類群中都有表達(dá), 如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等, 并參與調(diào)控這些免疫細(xì)胞增值、發(fā)育和功能, 是協(xié)調(diào)低氧應(yīng)答與免疫應(yīng)答的重要因子[10]。特異性地敲除小鼠(Mus musculus)巨噬細(xì)胞HIF-1α基因會干擾其ATP的產(chǎn)生, 對巨噬細(xì)胞存活、遷移、聚集以及殺菌活性都會產(chǎn)生不利影響[11]。相反, 活化HIF-1α?xí)龠M(jìn)巨噬細(xì)胞向感染部位遷移, 增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力, 并增加細(xì)胞因子的表達(dá)[12]。敲除小鼠HIF-1α基因引發(fā)T淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯和B淋巴細(xì)胞凋亡, 影響T、B淋巴細(xì)胞的發(fā)育[13—15]。HIF-1α直接調(diào)控一些免疫基因的表達(dá), 例如IFN-γ基因的啟動子區(qū)域含有一個HRE位點, 實驗已經(jīng)證實低氧活化的HIF-1α能夠與之結(jié)合, 增強(qiáng)IFN-γ基因的表達(dá)[16]。此外, HIF-1α還能夠誘導(dǎo)趨化因子CCL5和CXCL12的產(chǎn)生[17]。目前,HIF-1α的序列和分子特征在多種魚類中都有報道, 包括鱖(Siniperca chuatsi)[18]、大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)[19]、青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)[20]、斑馬魚(Danio rerio)[21]等, 結(jié)果表明魚類HIF-1α的功能結(jié)構(gòu)域和哺乳動物相比高度保守。但是, 關(guān)于HIF-1α在魚類免疫應(yīng)答中的功能仍鮮有報道, 僅發(fā)現(xiàn)鱖HIF-1α蛋白過表達(dá)顯著地抑制鱖蛙虹彩病毒(MRV)和彈狀病毒(SCRV)復(fù)制[18]。

大黃魚(Larmichthys crocea)是我國重要的海水經(jīng)濟(jì)魚類, 2018年年產(chǎn)量達(dá)到19.8×107kg, 是我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的魚類[22]。然而, 隨著大黃魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大, 各種疾病頻繁爆發(fā), 尤其是一些危害較大的細(xì)菌性疾病和寄生蟲病, 嚴(yán)重地制約了大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[23]。大黃魚疾病暴發(fā)與高溫、低氧等環(huán)境脅迫密切相關(guān)。HIF-1α在低氧應(yīng)答和免疫應(yīng)答中都發(fā)揮重要作用, 是協(xié)調(diào)低氧應(yīng)答與免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子。因此, 解析HIF-1α在大黃魚免疫應(yīng)答中的功能, 對于理解低氧脅迫對大黃魚免疫應(yīng)答的影響, 以及大黃魚病害的免疫防治具有重要意義。本研究克隆并鑒定了大黃魚HIF-1α(LcHIF-1α)基因, 通過熒光定量PCR檢測其在健康大黃魚組織或器官, 以及免疫細(xì)胞中的表達(dá)水平,分析其在溶藻弧菌感染的大黃魚脾臟和腎臟, 以及LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)變化, 揭示LcHIF-1α參與大黃魚免疫應(yīng)答過程, 為闡明其在魚類免疫應(yīng)答中的功能和機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用大黃魚[體長: (21.0±1.5) cm; 體重:(104±13.6) g]均購自寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司, 養(yǎng)殖基地水溫在25℃左右。在適應(yīng)性養(yǎng)殖兩周后, 取健康大黃魚的腦、眼、心臟、肝臟、脾臟、頭腎、胃、腸、肌肉等組織或器官, 用于LcHIF-1α基因的組織分布研究。隨機(jī)選取60尾大黃魚分為對照組和實驗組, 每組各30尾, 在麻醉后, 對照組大黃魚腹腔注射200 μL生理鹽水, 實驗組大黃魚腹腔注射200 μL生理鹽水稀釋的濃度為1×108CFU/mL的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)菌液。分別于注射后6h、12h、24h和48h, 每個時間點隨機(jī)選取6尾大黃魚, 取脾臟和頭腎組織樣品, 樣品液氮速凍后放入-80℃超低溫冰箱保存。

實驗所用引物信息詳見表 1, 引物合成及DNA測序均由擎科生物完成。

表 1 引物序列Tab. 1 Primer information

1.2 大黃魚免疫細(xì)胞分離

大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞: 將大黃魚頭腎置于70 μm濾網(wǎng)上, 使用1 mL注射器的活塞反復(fù)研磨組織塊,加入RPMI-1640培養(yǎng)基(含1%青霉素、鏈霉素和肝素鈉)沖洗, 將洗下的細(xì)胞懸液320×g水平離心5min后收集細(xì)胞。使用RPMI-1640培養(yǎng)基把收集的細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液, 緩慢加到34%/51% Percoll分離液的表層, 650×g水平離心30min, 吸取中間層的細(xì)胞, 在細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)28℃培養(yǎng)2h, 去除未貼壁的細(xì)胞, 即得到大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞。

大黃魚外周血淋巴細(xì)胞: 使用2 mL注射器從大黃魚的尾靜脈抽取血液, L-15培養(yǎng)基稀釋后, 緩慢加到34%/51% Percoll分離液的表面, 650×g水平離心30min, 吸取中間層的細(xì)胞, 反復(fù)清洗2次后, 使用L-15培養(yǎng)基稀釋到1×106細(xì)胞/mL備用。

大黃魚頭腎中性粒細(xì)胞: 將大黃魚頭腎置于70 μm濾網(wǎng)上, 使用1 mL注射器的活塞反復(fù)研磨組織塊,加入無菌的PBS, 制成單細(xì)胞懸液, 緩慢加到72.5%Percoll分離液的表面, 400×g水平離心30min, 收集位于管底部的粒細(xì)胞, 用含1%肝素鈉的L-15培養(yǎng)基反復(fù)清洗兩次, 稀釋到1×106細(xì)胞/mL備用。

1.3 LcHIF-1α基因克隆與序列分析

LcHIF-1α基因序列來源于大黃魚基因組數(shù)據(jù)庫(GenBank登錄號: JRPU02000000)。使用大黃魚頭腎cDNA作為模板, 對其ORF序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序驗證, 所用引物序列見表 1, 測序結(jié)果與預(yù)測序列基本一致。利用SMART在線軟件預(yù)測LcHIF-1α蛋白功能結(jié)構(gòu)域, SignalP 4.1預(yù)測其信號肽,NetNGlyc1.0預(yù)測其潛在的糖基化位點, 系統(tǒng)進(jìn)化樹則使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建(近鄰法)。氨基酸序列多序列比對使用CLUSTAL Omega在線程序(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)。其他物種HIF-1α的氨基酸序列從NCBI數(shù)據(jù)庫收集所得,相應(yīng)的序列登錄號詳見表 2。

1.4 熒光定量PCR實驗

利用Trizol試劑提取來源于6尾大黃魚混合樣品的總RNA, 反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板, 大黃魚βactin作為內(nèi)參基因, 使用LcHIF-1α特異性引物(表 1,HIF-1α-F2 和HIF-1α-R2)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),檢測LcHIF-1α的表達(dá)水平。反應(yīng)體系如下: 2×SYBR GreenⅠ10 μL, 引物各0.5 μL, cDNA模板9 μL;反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性1min; 95℃ 10s, 58℃ 15s,72℃20s, 共40個循環(huán)。通過2-ΔΔCt方法計算LcHIF-1α的相對表達(dá)量, 使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著[24]。

表 2 大黃魚HIF-α與其他物種HIF-α氨基酸序列的同源性分析Tab. 2 The identity between large yellow croaker HIF-α and other known HIF-α proteins

1.5 LcHIF-1α在大黃魚免疫細(xì)胞中的表達(dá)模式分析

采用熒光定量PCR檢測LcHIF-1α在大黃魚中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的相對表達(dá)水平。再分別使用終濃度為50 μg/mL的LPS和等體積的無菌PBS處理大黃魚中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞, 于處理后不同的時間點收集細(xì)胞, 使用微量RNA提取試劑盒提取細(xì)胞的總RNA, 制備第一鏈cDNA, 通過熒光定量PCR檢測LcHIF-1α的表達(dá)水平變化。熒光定量PCR方法和數(shù)據(jù)處理方法如上。

2 結(jié)果

2.1 大黃魚HIF-1α分子特征

LcHIF-1α基因的開放閱讀框全長2256個核苷酸, 編碼一個由751個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(Gen-Bank登錄號: XP_027130453.1), 預(yù)測其蛋白分子量為84.2 kD, 理論等電點為4.64。序列分析發(fā)現(xiàn),LcHIF-1α與哺乳動物HIF-1α蛋白序列特征相似, 不具有信號肽和跨膜區(qū), 在氨基端具有一個基礎(chǔ)的HLH結(jié)構(gòu)域(第22—77位氨基酸)和2個PAS結(jié)構(gòu)域(第88—254位氨基酸; 第229—295位氨基酸), 共同組成HIF的特征基序HLH/PAS; 在羧基端具有1個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域HIF-1(第547—578位氨基酸)和1個HIF-1a-CTAD結(jié)構(gòu)域(第714—750位氨基酸)。氨基酸序列比對表明, LcHIF-1α與其他物種HIF-1α都具有5個保守的功能結(jié)構(gòu)域(HLH、2個PAS、HIF-1和HIF-1a-CTAD)和3個重要的羥基化位點(脯氨酸Pro402、Pro564以及天冬酰胺Asp803)。氨基酸序列同源性對比顯示, LcHIF-1α與棘頭梅童魚(Collichthys lucidus)和鱸(Dicentrarchus labrax)HIF-1α的序列一致性最高, 分別為99.2%和86.6%(表 2)。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中, 魚類HIF-1α形成一個大的分支,遠(yuǎn)離兩棲類、禽類和哺乳類的HIF-1α; LcHIF-1α與棘頭梅童魚HIF-1α的親緣關(guān)系最近(圖 1)。

2.2 LcHIF-1α在健康大黃魚不同組織中的表達(dá)情況

采用熒光定量PCR技術(shù)檢測健康大黃魚腦、眼、心臟、肝臟、脾臟、頭腎、胃、腸、肌肉等組織或器官中LcHIF-1α的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,LcHIF-1α在檢測的所有組織中都有表達(dá), 在皮膚中的表達(dá)量最高, 其次是血液、肌肉和心臟, 而在腸、腎臟和胃里面表達(dá)量相對較低(圖 2)。

2.3 溶藻弧菌感染對LcHIF-1α表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探明LcHIF-1α在大黃魚免疫反應(yīng)中的作用, 使用溶藻弧菌感染健康的大黃魚, 檢測LcHIF-1α在大黃魚脾臟和頭腎中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果如圖 3所示, 溶藻弧菌感染后6h和12h, 大黃魚脾臟中LcHIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平在顯著下調(diào), 然而, 24h和48h后表達(dá)量顯著增加, 在24h表達(dá)水平達(dá)到最高,是對照組的6.8倍(圖 3A); 在頭腎組織中,LcHIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平在感染后6h和12h無明顯變化, 24h和48h顯著上調(diào), 也是在24h 達(dá)到最高峰, 為對照組的2.9倍(圖 3B)。

圖 1 大黃魚與其他物種HIF-1α氨基酸序構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig. 1 A phylogenetic tree was constructed based on the amino acid sequences of HIF-1α from large yellow croaker and other vertebrates

圖 2 大黃魚HIF-1α組織表達(dá)譜Fig. 2 Tissue expression analysis of LcHIF-1α

2.4 LcHIF-1α在大黃魚免疫細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控模式

LcHIF-1α在大黃魚中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中都有表達(dá), 中性粒細(xì)胞中的相對表達(dá)水平最高, 巨噬細(xì)胞次之, 淋巴細(xì)胞中表達(dá)量相對較少(圖 4)。進(jìn)一步使用細(xì)菌的表面成分脂多糖(LPS)刺激大黃魚中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞, 檢測LcHIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果顯示, LPS誘導(dǎo)后LcHIF-1α在中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著升高, 都是于2h達(dá)到最高值, 是對照組的2.6倍和1.8倍(圖 5)。

圖 3 溶藻弧菌感染后大黃魚脾臟和頭腎中LcHIF-1α表達(dá)變化Fig. 3 Expression change of LcHIF-1α in spleen and head kidney of large yellow croaker after Vibrio alginolyticus stimulation

圖 4 LcHIF-1α在免疫細(xì)胞中的表達(dá)分析Fig. 4 LcHIF-1α expression in immune-related cells

圖 5 LPS刺激后中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中LcHIF-1α的表達(dá)變化Fig. 5 LcHIF-1α expression analysis in neutrophils and macrophages stimulated with LPS

3 討論

分子氧是地球上所有有氧生物生存所必需的成分[25]。魚類生活在水生環(huán)境中, 生長、攝食、運動、繁殖等各項生命活動都需要有充足的溶解氧進(jìn)行代謝來提供能量。然而, 無論是自然水環(huán)境還是人工養(yǎng)殖環(huán)境, 溶解氧的分布極不均勻, 濃度變化幅度大, 缺氧情況頻繁發(fā)生[26]。HIF-1信號通路是調(diào)控低氧應(yīng)答的重要途徑, 其中, HIF-1α是最關(guān)鍵的調(diào)控蛋白, 哺乳動物HIF-1α在低氧應(yīng)答中的功能和作用機(jī)制已經(jīng)研究的非常清楚。近年來, 研究發(fā)現(xiàn)HIF-1還與NF-κB信號通路交互作用, 參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程, 包括誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因的表達(dá), 調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化和功能等[27]。目前,已經(jīng)在多種魚類中克隆得到了HIF-1α序列, 發(fā)現(xiàn)低氧脅迫顯著誘導(dǎo)其表達(dá), 但是對其在免疫應(yīng)答中的表達(dá)模式和功能仍知之甚少。

本研究從大黃魚基因組數(shù)據(jù)中檢索到LcHIF-1α序列, 擴(kuò)增得到了其cDNA序列并測序驗證。LcHIF-1α的開放閱讀框全長為2256個核苷酸, 編碼1個751個氨基酸的蛋白。通過序列比對發(fā)現(xiàn),LcHIF-1α與其他魚類和高等動物HIF-1α蛋白結(jié)構(gòu)類似, 具有1個HLH結(jié)構(gòu)域, 2個PAS結(jié)構(gòu)域, 1個HIF-1結(jié)構(gòu)域和1個HIF-1a-CTAD結(jié)構(gòu)域, 并且這些物種HIF-1α功能結(jié)構(gòu)域的序列相似性較高, 表明HIF-1α在進(jìn)化過程中的保守性, 也預(yù)示著其功能的保守性。但是, 在功能結(jié)構(gòu)域以外的區(qū)域, 魚類HIF-1α與兩棲類、鳥類、哺乳類HIF-1α序列同源性相對較低, 出現(xiàn)多個差異較大的區(qū)域; 系統(tǒng)進(jìn)化分析也得到了相似的結(jié)果, 魚類的HIF-1α形成一個獨立的分支, 遠(yuǎn)離哺乳類、鳥類及兩棲類的HIF-1α,說明魚類HIF-1α在功能方面可能具有一些獨特之處。此外, 調(diào)節(jié)HIF-1α功能的兩個脯氨酸Pro402和Pro564在不同物種間高度保守, 這兩個位點發(fā)生羥基化后, 引導(dǎo)HIF-1α蛋白發(fā)生蛋白酶體降解[28]; 另一個重要的功能調(diào)控位點天冬酰胺Asp803在LcHIF-1α序列中也有發(fā)現(xiàn), 其發(fā)生羥基化將抑制HIF-1α蛋白的活性[28]; 這些結(jié)果表明大黃魚可能具有與哺乳動物相似的HIF-1α表達(dá)調(diào)控機(jī)制, 也預(yù)示著其在低氧應(yīng)答中功能的保守性。

組織表達(dá)分析表明,LcHIF-1α在所檢測的各組織中均有表達(dá), 在皮膚中表達(dá)量最高, 其次依次為血液、肌肉和心臟, 在腸、腎臟和胃里面表達(dá)量相對較低。鱖HIF-1α的組織分布模式與LcHIF-1α類似, 也是血液和心臟里面表達(dá)量較高, 但是其在肌肉中表達(dá)量最低, 與LcHIF-1α明顯不同[18]。大彈涂魚HIF-1α在小腸和心臟內(nèi)表達(dá)水平最高。雖然不同魚類HIF-1α的組織表達(dá)模式略有差異, 但在血液、心臟等部位的表達(dá)量相對較高, 可能由于血液是運輸氧的重要途徑,HIF-1α在含血量較高的組織中能夠更及時的感應(yīng)到氧濃度的變化, 調(diào)節(jié)低氧應(yīng)答反應(yīng)。此外,LcHIF-1α在大黃魚皮膚中高表達(dá),可能是由于皮膚是魚類的輔助呼吸器官, 對水環(huán)境中溶解氧濃度變化較為敏感。為了探明大黃魚HIF-1α在免疫應(yīng)答中的作用, 我們利用熒光定量PCR檢測了LcHIF-1α在兩個重要的免疫器官中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示, 溶藻弧菌感染后大黃魚脾臟和頭腎中LcHIF-1α的表達(dá)量都顯著增加。相似的結(jié)果在其他魚類HIF-1α基因的研究中也有報道, 愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)感染顯著上調(diào)大彈涂魚脾臟和腎臟中HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平[19], PMA和poly I:C都能夠誘導(dǎo)鱖HIF-1α的表達(dá)[18], 這些結(jié)果提示HIF-1α可能在魚類免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。脾臟和頭腎是魚類重要的免疫器官, 含有大量的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、堿性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞,LcHIF-1α在脾臟和頭腎中表達(dá)量升高, 可能是其在某些免疫細(xì)胞表達(dá)量增加導(dǎo)致的。因此,我們分析了LcHIF-1α在大黃魚免疫細(xì)胞中的表達(dá)模式, 發(fā)現(xiàn)LcHIF-1α在大黃魚中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)水平相對較高, LPS誘導(dǎo)后,LcHIF-1α在中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平顯著上調(diào), 與其組織表達(dá)模式一致。在愛德華氏菌刺激后, 大彈涂魚單核/巨噬細(xì)胞中HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都顯著上調(diào)[19]。斑馬魚HIF-1α通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞IL-1β表達(dá)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞NO產(chǎn)生, 抵御海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)感染[29]。這些結(jié)果進(jìn)一步說明了HIF-1α可能參與調(diào)控魚類的免疫應(yīng)答過程。

綜上所述, 本研究鑒定了LcHIF-1α基因的序列特征, 分析了魚類、兩棲類、鳥類和哺乳類HIF-1α的進(jìn)化關(guān)系, 通過熒光定量PCR技術(shù)分析了LcHIF-1α在不同組織中的表達(dá)水平, 溶藻弧菌感染后在脾臟和頭腎組織的表達(dá)變化, 以及免疫細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控模式, 表明LcHIF-1α功能結(jié)構(gòu)域相對保守, 可能參與大黃魚抗細(xì)菌免疫應(yīng)答過程, 這些結(jié)果為了解大黃魚和其他硬骨魚類低氧應(yīng)答與免疫應(yīng)答之間的關(guān)系提供數(shù)據(jù)參考。