趙姍姍 孫 源 鄭國棟 陳 杰 鄒曙明

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部團頭魴遺傳育種中心, 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種植資源重點實驗室,水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 上海 201306)

在脊椎動物中, 細胞因子在包括體內(nèi)平衡和免疫反應(yīng)在內(nèi)的許多生理過程中發(fā)揮著極其重要的作用。細胞因子之間的相互作用與細胞因子信號抑制因子密切相關(guān), 許多細胞因子通過JAK/STAT途徑發(fā)揮作用[1,2]。細胞因子信號抑制因子(SOCS)蛋白通過調(diào)控JAK/STAT信號通路, 最終達到調(diào)控細胞活動的目的[3]。SOCS家族的所有成員(SOCS1-7和CIS)皆由N-端結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS盒子構(gòu)成[4], 而在SOCS家族的成員中只有SOCS1和SOCS3在N端區(qū)域有激酶抑制區(qū)域, 激酶抑制區(qū)域可以作為JAKs的偽底物。

SOCS3作為SOCS蛋白家族新發(fā)現(xiàn)的一員, 人們發(fā)現(xiàn)SOCS3可被多種免疫細胞因子誘導(dǎo), 如白細胞介素(IL)等[5]。近年來, SOCS3已經(jīng)在青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)、斑馬魚(Danio rerio)、紅旗東方鲀(Fugu rubripes)、三刺魚(Gasterosteus aculeatus)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、鯉(Cyprinus carpio)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草魚(Ctenopharyn-godon idellus)等魚種中被發(fā)現(xiàn)[6—11]。在魚類中鑒定出的所有SOCS家族成員都應(yīng)該是由特定的魚類基因復(fù)制事件引起的[12,13]。有研究表明, SOCS3是許多生物過程的關(guān)鍵影響因素, 包括免疫反應(yīng)和細胞存活等[14,15]。目前魚類SOCS3的兩個拷貝基因在表達水平上比較分析只有少數(shù)的研究。

草魚(Ctenopharyngodon idellus)作為一種主要的食草性淡水魚, 因其味道鮮美在中國廣受歡迎。2017年, 我國草魚產(chǎn)量達到5.35×109kg[16]。在本研究中, 我們從草魚中克隆了SOCS3b, 確定了成體組織中SOCS3a和SOCS3b表達模式。此外, 研究了注射嗜水氣單胞菌后草魚SOCS3s基因的表達情況。本研究將為后續(xù)草魚SOCS3s基因的功能研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究中所有的實驗都是按照上海海洋大學(xué)動物實驗和護理委員會批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進行的。本研究中草魚取自上海海洋大學(xué)濱海基地。本實驗中所有草魚取組織前都先用100 mg/L的MS-222(三卡因甲磺酸鹽, Sigma)處理?？焖偃〔蒴~成魚組織, 包括腦、眼、鰓、心、肝、脾、腸、腎、皮、肌和性腺, 儲存在-80℃冰箱中。

1.2 草魚SOCS3b基因的克隆

按照說明書要求, 總RNA提取試劑盒(Promega)提取草魚總RNA, 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(GoScriptTMReverse Transcription System. Promega)得到第一鏈cDNA。實驗室克隆得到的團頭魴SOCS3b基因(GenBank Acc. No. MH107242)為模板, 設(shè)計引物對F1/R1(表 1)擴增草魚SOCS3bcDNA片段一, 然后設(shè)計引物對F2/R2(表 1)擴增草魚SOCS3bcDNA片段二。經(jīng)過測序結(jié)果整合后, 總擴增出1398 bp cDNA片段, 用于設(shè)計基因特異性引物3′RACE(3RACE-O, 3RACE-I)和5′RACE(5RACE-O, 5RACE-I)。5′和3′RACE使用SMART RACE cDNA擴增試劑盒(Clontech)進行擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過處理后進行測序, 具體操作參考杜尚可[17]。測序結(jié)果用BioEdit 7.0.0.1軟件, 拼接得到草魚SOCS3b基因cDNA全長序列。

1.3 嗜水氣單胞菌攻毒實驗

健康草魚幼魚(23±4) g在室內(nèi)水泥池飼養(yǎng)2周。從病魚中提取的致病性嗜水氣單胞菌, 接種到LB液體培養(yǎng)基中, 搖床28℃培養(yǎng)16h。細菌的濃度即每毫升菌液的菌落數(shù)(CFU/mL)通過使用平板計數(shù)法獲得。離心收集嗜水氣單胞菌, 制備成4×106CFU/mL磷酸鹽(PBS, 上海生工生物技術(shù)公司)菌懸液。實驗組感染18條幼魚, 腹腔注射0.1 mL上述PBS菌懸液, 對照組對18條幼魚注射0.1 mL PBS溶液。注射后的草魚放回水泥池, 水溫維持在28℃左右。注射后0、2h、4h、8h、12h和24h, 隨機抽取兩組各3條魚進行麻醉, 取其肝、脾、腸和腎超低溫保存。

1.4 序列及進化樹分析

使用BioEdit 7.0.0.1分析SOCS3a和SOCS3bcDNA的核苷酸序列[18]。通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)ORF Finder在線查找開放閱讀框,BLASP和Search程序?qū)Σ煌锓N的SOCS3蛋白推測序列進行比較[17]。Compute pI/Mw(http://web.expasy.org/compute_pi)預(yù)測蛋白分子量和等電點。Phyre2和Pymol軟件預(yù)測SOCS3蛋白的二級結(jié)構(gòu)[19]。MEGA 6.06[20]構(gòu)建SOCS3系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 實時定量PCR(qRT-PCR)分析

實時定量PCR在CFX96 TouchTMreal-time PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)中進行[21]。以18S(引物對為18S-F/-R)為對照[22], 使用SYBR Green Premix ExTaq(TaKaRa)進行qRT-PCR檢測。數(shù)據(jù)以Mean±SE的形式表示, 用SPSS Statistics 17.0軟件采用單因素方差法分析。

2 結(jié)果

2.1 草魚SOCS3b cDNA序列

本文克隆的到的草魚SOCS3b基因序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫, 基因庫編號MH463452。草魚SOCS3b基因全長2126 bp, 5′非編碼區(qū)長170 bp, 開放閱讀框為651 bp, 3′非編碼區(qū)長1307 bp。分析得到該序列編碼216個氨基酸, 預(yù)測等電點為7.15, 相對分子質(zhì)量為23.90 kD。NCBI數(shù)據(jù)庫草魚SOCS3(GenBank Accession No. EU625352.1)經(jīng)序列對比,與斑馬魚SOCS3a(NM199950.1)相似度為87%, 與團頭魴SOCS3a(MH107241)相似度99%, 我們判斷它與斑馬魚和團頭魴SOCS3a直系同源(Orthologue)。為了方便區(qū)分, 本文中將上述草魚SOCS3在稱為草魚SOCS3a。序列分析草魚SOCS3b包含一個SH2域和一個SOCS盒, 與草魚SOCS3a和其他物種SOCS3相似。通過 Phyre2 程序和 Pymol 軟件預(yù)測草魚SOCS3b二級結(jié)構(gòu), 并與人類(Homo sapiens)SOCS3、斑馬魚SOCS3s和草魚SOCS3a對比, 發(fā)現(xiàn)人類、斑馬魚與草魚SOCS3二級結(jié)構(gòu)都主要包括α螺旋和無規(guī)則卷曲(圖 1), 且結(jié)構(gòu)相似。

通過NCBI BLASP發(fā)現(xiàn),SOCS3a和SOCS3b基因都廣泛存在于硬骨魚中, 包括鯉科、異鳉科、棘魚科和副棘魚科。BioEdit 7.0.0.1分析得出, 草魚SOCS3a和SOCS3b的成熟肽具有72%相似度,SOCS3a的SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS盒分別與SOCS3b序列相似度分別為76%和78%。草魚SOCS3a/3b和人SOCS3的氨基酸序列相似度分別為63%和62%。草魚和斑馬魚SOCS3a氨基酸序列相似度(87%)低于草魚和斑馬魚SOCS3b氨基酸相似度(91%)。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明草魚SOCS3a和SOCS3b與其他硬骨魚種的直系同源體均有良好的聚類關(guān)系(圖 2)。草魚SOCS3a和SOCS3b的成熟肽相似度(72%), 小于草魚和斑馬魚SOCS3a氨基酸序列相似度(87%), 也小于草魚和斑馬魚SOCS3b氨基酸相似度(91%)。因此所有魚類SOCS3a聚類為一簇, 而所有SOCS3b聚類為一簇。

2.2 SOCS3a和SOCS3b的表達模式

通過qRT-PCR方法檢測到SOCS3a和SOCS3b在草魚成魚11個組織中均有所表達, 但表達略有不同。草魚SOCS3a在鰓、脾、腸、肝、肌、腎和皮中表達較高, 在心、腦、眼和性中表達較低(圖 3);SOCS3b在鰓、肝、脾、腸、性、皮和腎中表達較高, 在肌、心、腦和眼中表達較低(圖 3)。

圖 1 預(yù)測人類、斑馬魚及草魚SOCS3二級結(jié)構(gòu)Fig. 1 The predicted the secondary structure of SOCS3 in human, zebrafish and grass carp

圖 2 草魚SOCS3s基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of grass carp SOCS3s sequences in vertebrates

2.3 嗜水氣單胞菌處理后草魚組織中SOCS3s的表達

為了研究注射嗜水氣單胞菌后草魚中SOCS3a和SOCS3b的表達模式, 在草魚幼魚腹腔內(nèi)注射相同劑量的嗜水氣單胞菌[23]。在目前的研究中, 注射嗜水氣單胞菌后SOCS3a和SOCS3b在肝臟、脾、腸和腎臟組織的表達顯著(P＜0.01, 圖 4)。經(jīng)qRTPCR檢測后發(fā)現(xiàn), 與對照組相比, 肝臟中SOCS3a/3bmRNAs表達峰值出現(xiàn)在注射后2h(2 hpi), 分別為對照組的21.6倍和17.5倍, 然后表達量幾乎減少到原始水平; 在脾臟中,SOCS3a/-3bmRNAs表達峰值出現(xiàn)在4 hpi(17.6倍和18.8倍), 然后幾乎下降到原始水平; 在腸道中,SOCS3a和SOCS3b最高表達量出現(xiàn)在4 hpi(分別為21.4倍和16.1倍);SOCS3a/3bmRNAs在腎臟中的相對表達量在12 hpi時達到峰值, 與對照組相比分別約29.6倍和22.2倍(圖 4)。

3 討論

3.1 草魚SOCS3b序列分析

哺乳動物、鳥類和兩棲動物SOCS3只有一個拷貝, 現(xiàn)發(fā)現(xiàn)硬骨魚中SOCS3有兩個拷貝[24]。在本研究中, 我們在草魚中克隆了SOCS3b基因。草魚SOCS3a和SOCS3b的成熟肽區(qū)域中均含有脊椎動物中保守表達的SH2結(jié)構(gòu)域、SOCS盒子以及N端分泌信號, 預(yù)測的草魚SOCS3b二級結(jié)構(gòu)圖與人類、斑馬魚和草魚SOCS3相似, 說明草魚SOCS3s基因在長期進化中高度保守。通過對氨基酸半胱氨酸殘基的觀察, 發(fā)現(xiàn)SOCS3b分子中還含有除團頭魴外與其他魚類不同的半胱氨酸殘基(Cys-105)。這表明草魚和團頭魴SOCS3b結(jié)構(gòu)的特殊性,可能與其他魚類SOCS3b有略微不同。

草魚SOCS3a和SOCS3b成熟肽相似度為72%,這與斑馬魚SOCS3a和SOCS3b相似度(68%)相似。草魚SOCS3a/-3b氨基酸序列和斑馬魚SOCS3a/-3b相似度分別為87%和92%, 說明草魚SOCS3s與斑馬魚SOCS3s同源性高。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明, 草魚SOCS3a和SOCS3b與其他硬骨魚種的直系同源體均有良好的聚類關(guān)系, 這表明它們是硬骨魚特異性基因組復(fù)制的結(jié)果。

3.2 草魚SOCS3s表達模式分析

研究部分硬骨魚發(fā)現(xiàn),SOCS3在成體組織中表達[8]。同樣, 草魚SOCS3a和SOCS3b都在成體組織中表達。我們檢測到性腺中SOCS3b表達量高, 而SOCS3a表達量低, 說明這兩個基因表達有不同之處。此外, qRT-PCR檢測到草魚SOCS3s基因在鰓、肝、脾、腎、腸、皮膚等免疫相關(guān)組織中高度表達。先前研究報道虹鱒SOCS3在脾、腸、鰓和皮中大量表達[7], 大菱鲆SOCS3在鰓、脾、肝、腎中大量表達[9], 鯉SOCS3在鰓、頭腎、皮和脾中大量表達[8], 說明本研究結(jié)果與前人的一致。根據(jù)這些表達特征可以推斷草魚SOCS3s基因可能與免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)。

圖 3 草魚SOCS3s在成體不同組織的表達情況Fig. 3 The SOCS3s mRNA levels in adult tissues of grass carp

3.3 嗜水氣單胞菌處理后草魚組織中SOCS3s表達分析

近年來越來越多的研究表明, SOCS3與免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)。在我們的研究中, 嗜水氣單胞菌感染草魚后, 肝、脾、腸和腎中SOCS3s的表達量首先顯著增加, 然后幾乎下降到原來的水平。我們的研究結(jié)果與前人的相似, 有研究報道LPS(脂多糖)注射到河豚后, 脾和肝的SOCS3表達水平顯著升高[6];鯉感染SVCV(鯉病毒春季病毒血癥)后, 脾、腸和腎組織的SOCS3表達模式在感染后顯著升高, 隨后幾乎下降到正常水平[8]。大菱鲆感染魚源鰻線蟲的實驗中, 隨著時間的變化誘導(dǎo)腎臟、脾臟和肝臟中的SOCS3 mRNA的轉(zhuǎn)錄[9]。我們的結(jié)果表明草魚SOCS3s與草魚的免疫反應(yīng)相關(guān), 似乎引發(fā)了草魚對嗜水氣單胞菌的炎癥反應(yīng), 這表明魚類中的SOCS3s也可能在平衡細胞因子利害關(guān)系中發(fā)揮著重要作用。我們的研究和前人的報道都表明硬骨魚SOCS3s可能在調(diào)節(jié)細菌誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮積極的作用。

圖 4 嗜水氣單胞菌處理后幼魚各組織中草魚SOCS3的表達情況Fig. 4 The SOCS3 mRNA level in juvenile tissues after Aeromonas hydrophila injection of grass carp

綜上所述, 我們克隆了草魚的SOCS3b基因。序列和表達結(jié)果表明, 草魚的兩個SOCS3基因應(yīng)該是由一個祖先基因進化而來。據(jù)檢測, 草魚SOCS3s基因在鰓、肝、脾、腎、腸、皮膚等免疫相關(guān)組織中高度表達。經(jīng)過嗜水氣單胞菌處理后, 各免疫相關(guān)組織中SOCS3s可以被誘導(dǎo)表達升高, 然后幾乎降低到正常水平。本研究將為后續(xù)草魚SOCS3s基因的功能研究提供相關(guān)參考依據(jù), 為參與調(diào)節(jié)細胞因子信號傳遞和硬骨魚的細菌防御的SOCS3s機制的研究提供新的線索。