羅 丹 趙媛莉 劉新華 章晉勇

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 農(nóng)業(yè)部淡水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室, 淮安中心, 武漢430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

異育銀鯽(Carassius auratus gibelioBloch)具有生長快、食性廣、抗病性強等特點, 是我國主要的鯽養(yǎng)殖品種, 年產(chǎn)量近300×107kg[1]。然而隨著異育銀鯽集約化養(yǎng)殖的發(fā)展, 病害問題日益嚴重; 其中黏孢子蟲病對當前異育銀鯽養(yǎng)殖的危害僅次于鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-Ⅱ)引起的“鰓出血”病。黏孢子蟲病可發(fā)生于異育銀鯽養(yǎng)殖全過程, 迄今缺乏有效的防控措施, 已成為制約我國異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要瓶頸問題[2]。黏孢子蟲物種多樣性高, 僅寄生于異育銀鯽的就有60余種。當前, 對異育銀鯽養(yǎng)殖產(chǎn)生嚴重危害的有4種[3—6], 其中危害最嚴重的是由洪湖碘泡蟲(Myxobolus honghuensis)引起的“喉孢子蟲病”; 自21世紀初流行于江蘇蘇北異育銀鯽主養(yǎng)區(qū)以來, 已傳播至全國大部分異育銀鯽養(yǎng)殖區(qū)[3]。該病對異育銀鯽的苗種培育及成魚養(yǎng)殖均造成嚴重危害?；疾◆~主要表現(xiàn)為魚體發(fā)黑消瘦、眼球凸出、咽喉部紅腫、鰓絲呈暗紫色、鰓絲及體表黏液增多等癥狀, 大量繁殖的蟲體引起咽部膨大并頂起鰓蓋, 最終導致患病魚進食、呼吸困難。在異育銀鯽主養(yǎng)區(qū)江蘇鹽城, 該病的發(fā)病季節(jié)為每年5—10月, 感染率及死亡率都很高, 最高可達100%。因此, 建立基于洪湖碘泡蟲生物學特征的鯽“喉孢子蟲病”防控手段迫在眉睫。

鑒于黏孢子蟲成熟孢子堅硬的外殼, 針對該階段的藥物防控幾乎不可能實現(xiàn)。盡管洪湖碘泡蟲的全生活史尚未闡明, 但黏孢子蟲的兩宿主發(fā)育, 即無脊椎動物(主要為底棲寡毛類)體內(nèi)的放射孢子蟲發(fā)育階段與脊椎動物(主要為魚類)體內(nèi)發(fā)育的黏孢子蟲階段, 已得到學術(shù)界普遍認同[7]。前期研究表明,相對于成熟黏孢子, 魚類黏孢子蟲生活史中的其他階段對藥物、環(huán)境等更為敏感, 因此, 發(fā)展基于非成熟孢子的魚類黏孢子蟲病防控措施更為可行。然而, 目前尚缺乏指導確定包括滅活養(yǎng)殖水體中放射孢子蟲活性、阻斷營養(yǎng)體或前孢子發(fā)育階段繼續(xù)發(fā)育等干預措施實施時機的技術(shù)手段。另一方面, 對鯽跨境貿(mào)易過程中出現(xiàn)的潛伏感染個體的檢疫、新的養(yǎng)殖系統(tǒng)發(fā)病風險的評價及所采取的干預措施的效果評價等都缺乏快速檢測方法。根據(jù)病害發(fā)生“宿主-環(huán)境-病原”三環(huán)理論, 養(yǎng)殖系統(tǒng)中一定豐度的病原蓄積是導致病害的爆發(fā)必要條件之一, 發(fā)展養(yǎng)殖系統(tǒng)中洪湖碘泡蟲全生活史發(fā)育階段的定量監(jiān)測技術(shù)是解決上述防控問題的關(guān)鍵。

目前, 洪湖碘泡蟲的檢測方法主要有基于顯微鏡檢查成熟孢子的形態(tài)學方法、基于抗體-抗原反應(yīng)的免疫學方法[8,9]、普通PCR法、多重PCR法及巢式PCR法[10,11]等。形態(tài)學方法雖然操作簡便, 但是存在檢測滯后、效率低、易于漏檢及不適宜病害的早期診斷等問題。由于黏孢子蟲生活史復雜,且種類繁多, 決定了挖掘適用于早期檢測的特異性抗原的困難, 因此盡管免疫學檢測具有快速且適用于生產(chǎn)實踐的等特點, 但考慮到洪湖碘泡蟲生活史各階段抗原譜變異大且早期階段特異性抗原尚未鑒定, 因此我們認為目前發(fā)展黏孢子蟲病的免疫學早期診斷方法存在較大困難[12]。分子檢測由于適用于檢測寄生蟲全生活史階段, 在水產(chǎn)寄生蟲病害檢測領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。然而現(xiàn)有的針對洪湖碘泡蟲的分子生物學方法只能定性檢測。

SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好、操作簡便、用時短和可自動定量分析等優(yōu)點, 已被廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測[13]。因此, 本研究根據(jù)洪湖碘泡蟲的ITS基因序列設(shè)計了一對特異性引物, 建立了洪湖碘泡蟲的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量檢測方法,其特異性好、靈敏度較常規(guī)PCR高1000倍, 且在對養(yǎng)殖系統(tǒng)中的環(huán)境樣品進行定量監(jiān)測的應(yīng)用中顯示出良好的性能, 可為基層水產(chǎn)病害檢疫部門或大型養(yǎng)殖企業(yè)開展鯽“喉孢子蟲病”的苗種檢疫、早期診斷、暴發(fā)風險預警、防控干預措施實施時機的確定及干預效果評價提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

洪湖碘泡蟲、多涅茨尾孢蟲(Henneguya doneci)、倪李碘泡蟲(Myxobolus nielii)、普洛寧碘泡蟲(Myxobolus pronini)、吳李碘泡蟲(Myxobolus wulii)蟲體的基因組DNA均為本實驗室保存。3份發(fā)病鯽的喉部組織、3份無明顯感染癥狀鯽的喉部組織、3份水樣和3份泥樣樣品均采集自湖北黃岡市蘄春縣八里湖五里墩正大水產(chǎn)(湖北)有限公司周年發(fā)生喉孢子蟲病的池塘。

洪湖碘泡蟲各類型樣品的采集與保存方法如下: 發(fā)病鯽的喉部組織, 在喉孢子蟲病發(fā)病時期, 從池塘中采集3尾患喉孢子蟲病癥狀明顯的鯽, 將鯽的喉部組織取出, 保存于無水酒精中; 無明顯感染癥狀鯽的喉部組織, 在喉孢子蟲病發(fā)病時期, 從池塘中采集3尾無明顯感染癥狀的鯽, 將鯽的喉部組織取出, 保存于無水酒精中; 水樣, 在喉孢子蟲病發(fā)病時期, 用采水器在距離池塘水層表面的50 cm處收集3份500 mL水體, 用3個洗凈的1 L塑料瓶收集并低溫帶回實驗室, 用0.2 μm濾膜在真空泵上過濾,將濾膜保存于無水酒精中; 泥樣, 在喉孢子蟲病發(fā)病時期, 用彼得森采泥器采集池塘表層3份50 g底泥, 用錫箔紙包裹后置于凍存管中, 帶回實驗室于-20℃保存。

1.2 ITS基因克隆及引物設(shè)計

由于洪湖碘泡蟲小核糖體RNA(18S)基因序列與吳李碘泡蟲相似性過高(93%以上), 因此我們選擇變異度較大的核糖體間隔區(qū)域(ITS)為引物設(shè)計靶序列[14]。

分別以洪湖碘泡蟲、多涅茨尾孢蟲、倪李碘泡蟲、普洛寧碘泡蟲、吳李碘泡蟲基因組DNA為模板, 使用黏孢子蟲18S通用上游引物F(18R: 5′-CGT AACAAGGTTTCCGTAG-3′)和28S通用下游引物R(Myxo28S1F: 5′-CACTTCACTCGCAGTTACT-3′)進行常規(guī)PCR擴增[15]。PCR擴增體系為: 10×PCR Buffer MIX 12.5 μL, 上游引物F(10 μmol/L) 1 μL,下游引物R(10 μmol/L)1 μL, DNA模板 1 μL, 滅菌ddH2O補加至25 μL; 反應(yīng)程序為: 94℃預變性5min, 94℃變性50s, 54℃退火50s, 72℃ 2min, 35個循環(huán), 最后72℃延伸10min[15]。

在擴增結(jié)束后將擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳, 使用膠回收試劑盒將擴增得到條帶切膠回收,與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞成功的菌落純化培養(yǎng), PCR鑒定篩選得到陽性克隆。分別將陽性克隆菌液送往武漢擎科生物技術(shù)有限公司進行測序和序列拼接, 即獲得5種黏孢子蟲的ITS序列。利用Clustal X軟件對5種黏孢子蟲的ITS基因序列進行同源性分析, 根據(jù)比對結(jié)果確定洪湖碘泡蟲特異的非同源性區(qū)段, 利用Primer 5.0設(shè)計一對特異性引物, 設(shè)計的引物序列如下: 上游引物HH-F: 5′-CCACGTTTGTCAGAGTGATTGC-3′;下游引物HH-R: 5′-GGTCGTATATTCACTGCGAC T- 3′, 擴增產(chǎn)物長度為176 bp。引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 洪湖碘泡蟲陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以洪湖碘泡蟲基因組DNA為模板進行常規(guī)PCR擴增。采用25 μL反應(yīng)體系: 10×PCR Buffer MIX 12.5 μL, HH-F(10 μmol/L) 0.8 μL, HH-R(10 μmol/L) 0.8 μL, DNA模板2 μL, 滅菌ddH2O補加至25 μL;反應(yīng)程序為: 94℃預變性5min, 94℃變性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸30s, 共循環(huán)30次, 最后72℃延伸5min。

擴增結(jié)束后取5 μL PCR擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳, 切膠回收, 純化后的擴增片段與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。對轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞成功的菌落純化培養(yǎng), PCR鑒定篩選得到陽性克隆。將陽性克隆菌液送往武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序。測序驗證的陽性克隆菌液使用質(zhì)粒小提試劑盒作少量提取和純化。所提取的質(zhì)粒純度及溶度用Nano Drop 2000測定的260/280 nm比值判斷和計算(1.8—2.0), 換算為拷貝數(shù), 拷貝數(shù)計算公式:Nc=(6.02×1014×Cp) /(Ln+ 2694)×660,Nc為目的基因的拷貝數(shù), 單位為 copies/μL;Cp為質(zhì)粒濃度, 單位ng/μL;Ln為插入載體的基因長度, 單位bp。

1.4 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的建立與優(yōu)化

反應(yīng)條件的建立: 反應(yīng)體系為iQTMSYBR?Green Supermix 10.0 μL, HH-F(10 μmol/L) 0.8 μL,HH-R(10 μmol/L) 0.8 μL, 重組質(zhì)粒DNA 1.0 μL,ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序為: 95℃預變性3min;95℃變性12s; 55℃退火20s, 72℃延伸20s, 75.5℃ 收集熒光5s, 40個循環(huán); 溶解曲線溫度、時間設(shè)置為65℃ 5s, 95℃ 5min。反應(yīng)條件的優(yōu)化: 通過對反應(yīng)體系中的退火溫度、重組質(zhì)粒用量和引物用量等進行摸索, 獲得擴增效率高、穩(wěn)定性好、無特異性擴增的反應(yīng)條件。

1.5 標準曲線的建立

將測定濃度的洪湖碘泡蟲陽性重組質(zhì)粒作10倍倍比稀釋, 取106—102copies/μL重組質(zhì)粒為模板在優(yōu)化的反應(yīng)條件下同時進行擴增, 每個濃度做3個重復, 并設(shè)置空白對照。在擴增過程中, 實時熒光定量PCR儀根據(jù)不同拷貝數(shù)重組質(zhì)粒擴增產(chǎn)物的熒光信號到達設(shè)定域值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)生成相應(yīng)的Ct值。以106—102copies/μL重組質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值為橫坐標, 以相應(yīng)的ΔCt值為縱坐標, 利用Excel繪制標準曲線。

1.6 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的特異性、可重復性、靈敏性檢測

特異性檢測: 分別以洪湖碘泡蟲、多涅茨尾孢蟲、倪李碘泡蟲、普洛寧碘泡蟲、吳李碘泡蟲的基因組DNA為模板在優(yōu)化的反應(yīng)條件下同時進行擴增, 并設(shè)置空白對照。此外, 擴增結(jié)束后取5 μL QPCR擴增產(chǎn)物加loading Buffer進行2%瓊脂糖凝膠電泳,加以驗證該方法的特異性。

可重復性檢測: 將106—102copies/μL重組質(zhì)粒作為模板在優(yōu)化的反應(yīng)條件下分別進行組內(nèi)和組間重復性試驗。組內(nèi)重復性試驗, 每個濃度做3個重復; 組間重復性試驗, 同一次反應(yīng)每個濃度做3個重復, 重復3次反應(yīng), 同時設(shè)空白對照。通過組內(nèi)和組間Ct值變異系數(shù)(標準偏差/重復值平均數(shù)), 以驗證該方法的可重復性。

靈敏性檢測: 將105—101copies/μL重組質(zhì)粒作為模板分別取1 μL在優(yōu)化的反應(yīng)條件下和上述常規(guī)PCR條件下進行擴增, 并設(shè)置空白對照。常規(guī)PCR擴增結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。通過比較兩種方法的最低檢測限, 以驗證該方法的靈敏性。

1.7 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的應(yīng)用

為了驗證所建立的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR擴增方法的臨床應(yīng)用性。對采集自湖北黃岡市蘄春縣八里湖五里墩正大水產(chǎn)(湖北)有限公司周年發(fā)生喉孢子蟲病池塘的3份發(fā)病鯽的喉部組織、3份未無明顯感染癥狀鯽的喉部組織、3份水樣和3份泥樣待檢樣品進行洪湖碘泡蟲的檢測。待檢樣品分別采用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue,EZNA Water DNA Kit, EZNA Soil DNA Kit試劑盒提取基因組DNA后, 以待檢品基因組DNA為模板,在優(yōu)化的反應(yīng)條件下進行擴增, 每個樣品均做3個重復, 將檢測到的ΔCt值(3個Ct值取平均值)代入建立的標準曲線方程中, 計算出樣品中洪湖碘泡蟲的初始濃度和對應(yīng)初始濃度的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 洪湖碘泡蟲陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以洪湖碘泡蟲基因組DNA為模板, 使用設(shè)計合成的HH-F和HH-R引物進行常規(guī)PCR擴增, 獲得約為176 bp擴增片段。經(jīng)PCR鑒定的陽性重組質(zhì)粒,測序顯示擴增片段成功插入pMD-18T載體中, 說明陽性重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的洪湖碘泡蟲陽性重組質(zhì)粒在Nano Drop 2000上測得260/280 nm比值為1.97, 濃度為95 ng/μL, 對應(yīng)濃度的拷貝數(shù)為3.02×1010copies/μL。

2.2 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的建立與優(yōu)化

在優(yōu)化的反應(yīng)條件下, SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的擴增效率為102.3%, 擴增效率高,組內(nèi)和組間重復性試驗的變異系數(shù)均小于2%, 穩(wěn)定性好, 溶解曲線為單峰, 無特異性擴增。

2.3 標準曲線的建立

以3.02×106—3.02×102copies/μL重組質(zhì)粒為模板在優(yōu)化的反應(yīng)條件下同時進行擴增, 標準曲線方程為Y=-3.2577X+39.043, 相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999, 擴增效率為102.3%(圖 1)。重組質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值與QPCR的Ct值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。重組質(zhì)粒對應(yīng)的擴增產(chǎn)物溶解曲線呈現(xiàn)單峰,Tm值為77.5,表明無引物二聚體和非特異性擴增。

2.4 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的特異性、可重復性、靈敏性檢測

特異性檢測: 在建立的優(yōu)化的反應(yīng)條件下, 分別以洪湖碘泡蟲、多涅茨尾孢蟲、倪李碘泡蟲、普洛寧碘泡蟲、吳李碘泡蟲基因組DNA為模板同時進行擴增, 只有洪湖碘泡蟲基因組DNA出現(xiàn)典型“S”型擴增曲線, 其余均未出現(xiàn)典型“S”型擴增曲線,空白對照未見擴增(圖 2)。電泳結(jié)果也顯示(圖 3),僅有洪湖碘泡蟲基因組DNA出現(xiàn)一條條帶, 大小約為176 bp, 而其他黏孢子蟲和空白對照均未出現(xiàn)條帶, 說明所建立的方法具有良好的特異性。

可重復性檢測: 將3.02×106—3.02×102copies/μL 重組質(zhì)粒作為模板在優(yōu)化的反應(yīng)條件下分別進行組內(nèi)和組間重復性試驗, 3次組內(nèi)和組間重復性試驗的變異系數(shù)均小于2%(表 1), 說明所建立的方法具有較好的重復性。

圖 1 3.02×106—3.02×102 copies/μL重組質(zhì)粒實時熒光定量PCR標準曲線Fig. 1 Standard curve of QPCR by using the serially diluted recombined plasmid at a concentration of 3.02×106—3.02×102 copies/μL

靈敏性檢測: 將3.02×101—3.02×105copies/μL重組質(zhì)粒作為模板分別取1 μL 在優(yōu)化的反應(yīng)條件下和上述常規(guī)PCR條件下進行擴增, 3.02×101—3.02×105copies/μL 重組質(zhì)粒均呈現(xiàn)典型“S”型擴增曲線(圖 4和圖 5), 最低檢測限為3.02×101copies/μL, 而普通PCR 的最低檢測限為3.02×104copies/μL, 說明所建立的熒光定量PCR方法檢出率較高, 是常規(guī)PCR方法的1000倍, 具有較高的靈敏性。

2.5 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的應(yīng)用

圖 2 實時熒光定量PCR特異性性檢測Fig. 2 Specificity of the developed QPCR

圖 3 電泳檢測QPCR的特異性Fig. 3 Specificity of the developed QPCR detected by gel electrophoresis

采用所建立的洪湖碘泡蟲SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法對采集自蘄春周年發(fā)生喉孢子蟲病池塘的3份鯽喉部組織、3份無明顯感染癥狀的鯽喉部組織、3份水樣和3份泥樣樣品進行洪湖碘泡蟲的檢測, 空白對照(ddH2O)無擴增, 在3份鯽喉部組織、3份未無明顯感染癥狀的鯽喉部組織、3份水樣和3份泥樣樣品均能檢測到洪湖碘泡蟲(表 2)。這說明所建立的方法擴增效果良好, 既能從發(fā)病的鯽喉部組織中檢測出洪湖碘泡蟲, 又能從未發(fā)病但已感染的鯽喉部組織中檢測出洪湖碘泡蟲。對周年發(fā)病池塘的水樣與泥樣環(huán)境樣品中的洪湖碘泡蟲定量檢測結(jié)果表明, 采樣池塘存在洪湖碘泡蟲蓄積, 具備鯽喉孢子蟲病發(fā)病風險。同時也表明, 采樣時, 水柱中存在感染源, 為采取相應(yīng)的措施滅活或消降感染源豐度以降低發(fā)病風險提供了技術(shù)支撐。

3 討論

在建立SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測病原生物的過程中, 選擇合適的靶序列尤為重要。在洪湖碘泡蟲的早期分子檢測中, 應(yīng)用到的分子標記主要有18S rDNA和ITS區(qū)序列[8,9], 然而通過序列比對發(fā)現(xiàn)洪湖碘泡蟲與吳李碘泡蟲的18 SrDNA序列相似度為93%, ITS序列相似度為69%, 因此我們選擇變異度較大的核糖體間隔區(qū)域(ITS)為引物設(shè)計靶序列, 建立洪湖碘泡蟲的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法。

表 1 SYBR Green I實時熒光QPCR方法的組內(nèi)與組間重復性試驗Tab. 1 Intraassay and interassay repeatability tests of the SYBR Green I real-time QPCR assay

圖 4 實時熒光定量PCR靈敏性檢測Fig. 4 Sensitivity of the developed QPCR

圖 5 常規(guī)PCR靈敏性檢測Fig. 5 Sensitivity of the conventional PCR

通過以洪湖碘泡蟲的ITS基因為靶標設(shè)計特異性引物, 對退火溫度、重組質(zhì)粒用量和引物用量等進行摸索, 優(yōu)化反應(yīng)條件, 建立了洪湖碘泡蟲SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法。該方法的標準曲線方程為Y=-3.2577X+39.043, 相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999, 擴增效率為102.3%, Eff%在90%—110%[16],具有良好的線性關(guān)系; 溶解曲線為單峰, 產(chǎn)物的Tm值均一, 沒有引物二聚體和非特異性擴增。為了驗證所建立方法的特異性, 采用該方法對4種黏孢子蟲進行檢測, 并將擴增產(chǎn)物進行電泳分析, 由實驗結(jié)果可知, 所建立的方法與4種黏孢子蟲均不發(fā)生交叉反應(yīng), 表明該方法具有較好的特異性, 可以特異地檢測洪湖碘泡蟲?？紤]到魚類黏孢子蟲多樣性眾多, 今后應(yīng)擴大特異性檢測種類范圍, 以進一步該方法的特異性。由靈敏性實驗結(jié)果可知, 該方法的最低檢測限為3.02×101copies/μL(9.5×10-8pg/μL), 比李丹[10]建立的洪湖碘泡蟲PCR檢測方法的靈敏度(1×10-6pg/μL)高出約兩個數(shù)量級, 與普通PCR相比, 靈敏度高出常規(guī)PCR約1000倍, 表明該方法具有較高的靈敏性。由可重復性實驗結(jié)果可知, 組內(nèi)和組間重復性試驗的變異系數(shù)均小于2%,表明該方法具有較好的穩(wěn)定性和可重復性。

表 2 臨床樣品的SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測Tab. 2 Detection results of clinical samples by the developed SYBR Green I real-time PCR

采用所建立的方法對臨床樣品進行洪湖碘泡蟲的檢測。結(jié)果表明, 該方法擴增效果良好, 不僅能從發(fā)病的鯽喉部組織中檢測出洪湖碘泡蟲, 還能從未發(fā)病但已感染的鯽喉部組織中檢測出洪湖碘泡蟲。不僅如此, 本方法可應(yīng)用于周年發(fā)生喉孢子蟲病的池塘水樣、泥樣環(huán)境樣品中洪湖碘泡蟲的定量監(jiān)測, 為實時監(jiān)控養(yǎng)殖系統(tǒng)中病原的豐度, 實施對鯽喉孢子蟲病的早期干預措施奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

綜上所述, 本研究所建立的洪湖碘泡蟲SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法具有很好的特異性、較高的靈敏性、較好的穩(wěn)定性和重復性、良好的應(yīng)用性, 既可以用于臨床的快速早期檢測,又可對環(huán)境中的洪湖碘泡蟲進行實時監(jiān)控, 為洪湖碘泡蟲病的診斷和防控提供了有力的技術(shù)支持。