肖培培，綺麗格爾，李澤華，張夢圓，吾力江，李才善，張 楊

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）屬于毛圓科、血矛屬，是一種分布廣泛的反芻動物胃腸道寄生性線蟲，可引起捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病[1]。感染反芻動物的胃腸道線蟲主要是血矛線蟲，而捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在同類感染性線蟲中對羊群的致病力最強(qiáng)。羔羊和青年羊?qū)δ磙D(zhuǎn)血矛線蟲較易感，感染后引起的發(fā)病率和死亡率最高，而成年羊?qū)δ磙D(zhuǎn)血矛線蟲的抵抗力較強(qiáng)，且感染后有“自愈”現(xiàn)象，即有蟲體排除或不發(fā)生再感染[2]。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在我國草地牧區(qū)普遍流行，可引起宿主消瘦、貧血等慢性消耗性癥狀，嚴(yán)重感染時可引起死亡，給我國畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于基層養(yǎng)殖人員常忽視寄生線蟲病的危害，缺乏基本的防控常識和驅(qū)蟲意識，從而錯過了預(yù)防和治療該病的最佳時機(jī)。目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的防控仍以藥物防治為主，因而會出現(xiàn)抗藥性、環(huán)境污染、藥物殘留等問題。而該病的免疫防控研究進(jìn)展緩慢，目前還沒有有效的疫苗用于實際生產(chǎn)[3-6]。

本研究對新疆博樂及塔城地區(qū)采集的羊皺胃內(nèi)的線蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)檢測，對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲陽性樣品進(jìn)行測序鑒定對比，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，同時進(jìn)行多重序列比對，分析2個地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲對苯并咪唑類藥物的敏感性，以期為今后制定更有效、更有針對性的防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2018年6—7月隨機(jī)采集新疆塔城和博樂地區(qū)的羊皺胃32個，其中塔城地區(qū)20個（綿羊18個、山羊2個），博樂地區(qū)12個（綿羊皺胃）。對采集的皺胃進(jìn)行處理并分離蟲體，并裝入EP管保存于實驗室，-20 ℃待檢。

1.2 主要試劑

EasyPure Genomic DNA kit，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增試劑，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；無水乙醇，購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 試驗儀器

體視顯微鏡ST-39，購自中國邁克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司；旋渦混合器QL-866，購自上海圣科儀器設(shè)備有限公司；Gel Doc 2000紫外凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀，購自美國Bio-Rad公司；DK-600A型電熱恒溫水浴鍋，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RADIAL20型臺式高速離心機(jī)，購自西班牙ORTO ALRESA公司。

2 方法

2.1 蟲體采集

參照何添文等[7]的方法進(jìn)行。鏡檢蟲體形態(tài)后，將雌雄蟲體分開保存于70%酒精中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 DNA提取

按照 EasyPure Genomic DNA kit說明書進(jìn)行，將提取的DNA置于-20 ℃保存。

2.3 PCR目的片段擴(kuò)增

PCR引物應(yīng)用薄新文[8]設(shè)計的引物合成。其引物主要根據(jù) GenBank 發(fā)表的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-微管蛋白（β-tubulin）基因組（登錄號X67489）的第三外顯子序列設(shè)計。上游引物P1：5'-CGT TCT GGA CCG TAT GGA CA-3'；下游引物P4：5'-ATG TTC ACG GCT AAC TTG CG-3'。引物由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司引物合成。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲PCR 反應(yīng)體系（25 μL）如下：2×EsTaqMaster Mix（Dye）13 μL，上游引物、下游引物、模板DNA各1 μL，9 μL滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。PCR 反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s（30個循環(huán)）；72 ℃ 延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳（1%瓊脂糖）檢測后，通過瓊脂糖凝膠成像儀熒光成像觀察。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取博樂地區(qū)2個捻轉(zhuǎn)血矛線蟲陽性樣品（編號16、23），塔城地區(qū)4個樣品（編號1FTTacheng、4FTTacheng、4FHTacheng、21FHTacheng）進(jìn)行測序，將測序結(jié)果用BLAST進(jìn)行相似性檢索；選取與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲同科、不同屬的環(huán)紋背帶線蟲（登錄號分別為KF483653.1、KF483647.1、KP204098.1、KP204100.1）以及不同科、不同屬的羊仰口線蟲（登錄號為KP792295.1），應(yīng)用 MEGA6.0軟件，以所選擇的18種線蟲的β-tubulin基因為靶標(biāo)（表1），以最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹，并計算遺傳距離進(jìn)行分析；同時，對所選擇的同科同種的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲序列與測定序列進(jìn)行序列比對分析。

2.5 抗性分析

對確定為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin基因的6個序列（16、23、1FTTacheng、4FTTacheng、4FHTacheng、21FHTacheng）與抗苯丙咪唑標(biāo)準(zhǔn)序列（登錄號X67489.1），采用序列分析軟件ESPript 3和CLUSTALW進(jìn)行多序列比對，分析博樂和塔城地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲抗苯并咪唑類藥物的抗性。

3 結(jié)果

3.1 蟲體收集

在塔城地區(qū)收集的20個羊皺胃中，從14個羊皺胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)寄生性線蟲，共采集到85只蟲體；在博樂地區(qū)收集的12個羊皺胃中，從7個羊皺胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)寄生性線蟲，共采集到210只蟲體。

表1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲及其他線蟲β-微管蛋白基因

3.2 病原鑒定

將形態(tài)學(xué)鑒定初步鑒定為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的蟲體提取DNA后，通過PCR檢測。電泳結(jié)果顯示，基因片段大小約798 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。最終確定：塔城地區(qū)分離到的85只蟲體中，有27只為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲；在博樂地區(qū)分離到的210只蟲體中，有55只為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲。

3.3 遺傳進(jìn)化分析

測序所得序列與從GenBank下載序列進(jìn)行比對，運(yùn)用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）并計算遺傳距離（圖3）。

圖1 部分樣品的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲PCR檢測結(jié)果

圖2 運(yùn)用最大似然法構(gòu)建的β-tubulin基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹

將博樂地區(qū)（16、23）和塔城地區(qū)（1FTTacheng、4FTTacheng、4FHTacheng、21FHTacheng）測序獲得的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin 基因序列進(jìn)行BLAST比對，選取不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin 基因序列（登錄號分別為KX246658.1、KX246651.1、KX246666.1、KJ410522.1、KJ410523.1、KX246667.1、KX246668.1），同科、不同屬的環(huán)紋背帶線蟲（登錄號分別為KF483653.1、KF483647.1、KP204098.1、KP204100.1） 以及不同科、不同屬的羊仰口線蟲（登錄號為KP792295.1），應(yīng)用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，本試驗所測捻轉(zhuǎn)血矛線蟲序列與GenBank上發(fā)表的相應(yīng)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲株序列聚為一支，置信度為100%，與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲同科、不同屬的環(huán)紋背帶線蟲蟲株序列相聚類，置信度為100%，其外群為不同科、不同屬的羊仰口線蟲，登錄號為KP792295.1，內(nèi)群與外群分別形成獨立的進(jìn)化分支。

圖3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的遺傳距離矩陣

用MEGA6.0軟件計算的遺傳距離矩陣顯示：環(huán)紋背帶線蟲的種間距離為0～0.059，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲為0～0.082，1FTTacheng為0.009～0.080，4FHTTacheng為0.05～0.061，4FHTacheng為0.021～0.080，16Bole為0.012～0.074，23Bole為0.033～0.065。本試驗測定的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲遺傳距離均在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲種間距離內(nèi)，說明為同種，同時也說明毛圓科的β-tubulin基因種間遺傳距離為0～0.082。

3.4 序列比較分析

將進(jìn)化樹中從GenBank上下載的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin基因序列與本研究測定的序列進(jìn)行排序比對，發(fā)現(xiàn)相似度為96.86%，有89個變異位點（圖4），其中KJ410522.1與KJ410523.1，KX246658.1與KX246651.1的 G、A、T、C含量相同。本研究測定序列4FHTacheng的G和C含量低于其他捻轉(zhuǎn)血矛線蟲序列，其他測定序列在G、A、T、C含量上無明顯差異（表2）。

從13種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin基因序列堿基分布表中可看出，G基因堿基分布平均在21%左右，A基因在27%左右，T基因在30%左右，C基因在21%左右，說明堿基在長期進(jìn)化過程中出現(xiàn)了顛倒轉(zhuǎn)換、缺失、突變等變化。整體上看，G+C的含量小于A+T的含量，說明出現(xiàn)了堿基偏移。

3.5 抗藥性分析

經(jīng)多序列比對發(fā)現(xiàn)，與突變株相比，所采集的6個樣品的第200位氨基酸殘基密碼子為TTC（苯丙氨酸），而突變株為TAC（酪氨酸），說明采集的這6個樣品為敏感型（圖5）。

4 討論

圖4 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin基因序列比對結(jié)果

表2 13種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-tubulin基因序列堿基分布%

圖5 博樂地區(qū)、塔城地區(qū)及突變株β-tubulin基因多序列比對結(jié)果

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲作為一種腸道寄生線蟲廣泛流行于世界各地。國內(nèi)學(xué)者對全國各地捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染情況的調(diào)查結(jié)果顯示，不同地區(qū)感染率差異較大，為12.5%～100%。我國新疆地區(qū)地域遼闊，牧草資源豐富，養(yǎng)羊業(yè)多采用散養(yǎng)放牧的養(yǎng)殖方式。與圈養(yǎng)相比，放牧環(huán)境下的羊接觸污染草料和土地的概率明顯增高，因此感染寄生蟲的概率更高。本次試驗結(jié)果顯示，博樂地區(qū)共發(fā)現(xiàn)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲55只，塔城地區(qū)發(fā)現(xiàn)27只，感染情況并不太高。這可能是因為本次流行病學(xué)調(diào)查采集樣品的時間為6—7月，屬于夏季。而捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染一般在春季和秋季較嚴(yán)重，這兩個季節(jié)氣候條件相對適宜，非常適合寄生蟲生長繁殖，因而感染率相對較高。

近年來，基因分類學(xué)以及進(jìn)化分析手段已應(yīng)用于寄生蟲生態(tài)學(xué)、流行病學(xué)以及進(jìn)化相關(guān)研究中，為更好地掌握寄生蟲進(jìn)化特征提供了技術(shù)支持。特異性分子鑒定對于正確鑒別寄生蟲種類、遷移及進(jìn)化來說非常有效，而基因特征分析對更精確診斷寄生蟲病以及制定更合理的防控措施十分重要。

β-tubulin基因是細(xì)胞內(nèi)微管的基本結(jié)構(gòu)單位。微管蛋白對于保持細(xì)胞形狀、運(yùn)動、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸起到了不可或缺的作用。β-tubulin與毛圓科寄生線蟲的治療藥物——苯并咪唑類藥物（BZ）的藥理作用發(fā)揮有關(guān)。藥物選擇性地與蟲體細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白結(jié)合，通過干擾微管蛋白變化，影響微管和微管蛋白之間的自由集合，從而抑制蟲體內(nèi)微管的組裝而發(fā)揮作用[9-10]。

本次試驗將陽性樣品篩選后進(jìn)行測序，應(yīng)用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，將測序結(jié)果在NCBI中用BLAST進(jìn)行相似性檢索，與GenBank登錄號分別為KX246658.1（761 bp）、KX246651.1（760 bp）、KX246666.1（760 bp）、KJ410522.1（813 bp）、KJ410523.1（813 bp）、KX246667.1（767 bp）、KX246668.1（767 bp）的核苷酸相似性分別為94.13%、94.13%、95.68%、99.47%、99.74%、98.20%、97.79%。結(jié)果表明，所測捻轉(zhuǎn)血矛線蟲序列與GenBank上發(fā)表的相應(yīng)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲株序列聚為一支，置信度為100%，與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲同科、不同屬的環(huán)紋背帶線蟲蟲株序列相聚類，置信度為100%，其外群為不同科、不同屬的羊仰口線蟲，登錄號為KP792295.1，內(nèi)群與外群分別形成獨立的進(jìn)化分支。

苯丙咪唑類藥物是防治消化道線蟲的主流藥物之一，在我國使用年限長。在國外，已有較全面的報道，表明捻轉(zhuǎn)血矛線蟲已出現(xiàn)苯并咪唑類抗藥性蟲株。而國內(nèi)，相關(guān)的報道卻不多見。本次試驗對選取的博樂和塔城地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲樣品進(jìn)行多序列比對發(fā)現(xiàn)，與抗性蟲株序列相比，博樂和塔城地區(qū)樣品的第200位氨基酸均未發(fā)現(xiàn)突變，說明選取的樣品是對苯并咪唑類藥物敏感的。

本研究有助于新疆開展線蟲病的綜合防控，也為制定更合理的線蟲防控方案提供了參考，并為寄生蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析研究奠定了基礎(chǔ)。