鐘燁冰，肖 楠，胡 晴，黃 妤，趙 燕，張學(xué)文

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128）

黃花蒿（Artemisia annua）是菊科蒿屬的草本植物，植株含有揮發(fā)油、黃酮類化合物、香豆素、倍半萜類等物質(zhì)［1］。其中倍半萜類的青蒿素類物質(zhì)是一種新型特效治療瘧疾的藥物，黃花蒿是青蒿素藥物的主要來源［2］。黃花蒿作為抗瘧藥青蒿素的原料，在湖南、貴州、重慶、云南等省大面積種植，青蒿素類物質(zhì)主要在其腺毛中合成和貯存，因此腺毛直接關(guān)系到黃花蒿中有效成分青蒿素的含量。近年來，經(jīng)過對黃花蒿的品種改良，黃花蒿中青蒿素的含量得以不斷提高。野生黃花蒿青蒿素含量在1～2 mg／g，當(dāng)前栽培黃花蒿品種如新南方、A品系等的青蒿素含量已提高至10～20 mg／g，提高了10倍左右。但進(jìn)一步提高黃花蒿中青蒿素含量，常規(guī)育種難有突破。采用現(xiàn)代生物技術(shù)對黃花蒿進(jìn)行改良，則有望突破常規(guī)育種的局限。

來源于土壤根癌農(nóng)桿菌的iaaM基因在植物中表達(dá)吲哚乙酸甲基化酶，能通過色氨酸途徑合成生長素。利用iaaM基因開展植物遺傳轉(zhuǎn)化，可以調(diào)控其生長素合成并產(chǎn)生生長素相關(guān)的性狀變異。尤其將該基因與植物特異啟動子結(jié)合后在植物的特定組織器官表達(dá)，可研究生長素對植物器官形態(tài)發(fā)育的影響或改良作物農(nóng)藝性狀。王士杰等［3］將iaaM基因與棉花種皮特異表達(dá)基因在FBP7啟動子調(diào)控下轉(zhuǎn)化到棉花品系，略提高了纖維長度和比強度，且顯著改良其纖維的馬克隆值（p＝0.0449*）而對其他性狀沒有產(chǎn)生不良影響。Zhao等［4］、彭彥等［5］將iaaM在擬南芥表皮毛特異表達(dá)Gl2基因啟動子調(diào)控下轉(zhuǎn)化煙草，能顯著提高煙草表皮毛密度。龍炎杏［6］將iaaM基因在黃花蒿腺毛特異表達(dá)基因GTpro啟動子調(diào)控下轉(zhuǎn)化黃花蒿，也顯著提高了黃花蒿腺毛的密度。說明特異表達(dá)iaaM基因能促進(jìn)黃花蒿、煙草等植物的表皮毛和腺毛發(fā)育。但iaaM基因轉(zhuǎn)化黃花蒿后基因的表達(dá)量與其腺毛細(xì)胞密度的相關(guān)性還缺乏系統(tǒng)性研究。筆者利用13個黃花蒿A品系獨立轉(zhuǎn)基因單株，開展了轉(zhuǎn)基因定量表達(dá)與其腺毛密度及生長狀況的分析。

1 材料與方法

1.1 材料

黃花蒿A品系由朱衛(wèi)平提供，轉(zhuǎn)iaaM基因的植株為龍炎杏等開展的根癌農(nóng)桿菌葉盤共培法轉(zhuǎn)化的再生苗，共13株，都為同一批次獨立的轉(zhuǎn)基因個體。轉(zhuǎn)基因植株的基因表達(dá)水平會因葉片成熟度不同而有所差異，為減少這種誤差，取材時，取每株材料從頂端分生組織起往下數(shù)不同成熟度的第2、12、22片葉片3片，鮮重50～100 mg。將以上3片葉片混合作為1個樣本組提取其總RNA。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因表達(dá)的半定量

利用TransGen Biotech的試劑盒方法分別提取轉(zhuǎn)基因單株、對照黃花蒿植株的總RNA。經(jīng)紫外分光光譜檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。

RNA反轉(zhuǎn)錄用Takara公司的PrimerScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA的第一鏈。反應(yīng)體系為20μL：RNA 16μL和All MIX 4μL。將體系輕輕混勻，42℃孵育30 min，85℃加熱5 s后終止反應(yīng)。

基因表達(dá)定量以Actin作為內(nèi)參基因，上游引物為：5′-ATGACATGGAGAAGATCTGG-3′、下游引物為：5′-CGCTCGGTAAGGATCTTCATC-3′，并根據(jù)iaaM基因的核苷酸序列設(shè)計特異性引物，上游引物為：5′-TCAGCGATAGAGAGGATCTTTCTGG-3′、下游引物為：5′-CGCCAATAGCTTGTGGGAGTC-3′，以cDNA為模板用特異引物進(jìn)行PCR擴增，引物和金牌mix酶皆由湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成和提供。內(nèi)參進(jìn)行半定量RT-PCR總體系25μL：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，金牌mix酶23.5μL，模板cDNA 0.5μL。調(diào)整轉(zhuǎn)基因單株與對照的模板cDNA量，使內(nèi)參基因Actin瓊脂糖凝膠電泳的亮度一致，然后以該模板量擴增iaaM 基因。Actin反應(yīng)程序條件：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s為一個循環(huán)，循環(huán)25次，72℃最后延伸5 min。擴增目的基因的條件與上述的不同之處僅有退火為59℃，延伸45 s。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因黃花蒿腺毛數(shù)量統(tǒng)計

13個轉(zhuǎn)基因單株和對照黃花蒿在營養(yǎng)土缽種植，生長至30 cm高時開始取樣，單株共取不同發(fā)育時期的代表性葉片6片，每株材料從頂端往下數(shù)的第2、6、10、14、18、22片葉片，在奧林巴斯熒光顯微鏡下熒光觀察并拍照，拍照軟件為Motic Images Plus 2.0和Scion VisiCapture。在目鏡10×、物鏡4×下觀察腺毛細(xì)胞，并拍攝成數(shù)碼熒光顯微照片。在數(shù)碼照片上以6個0.09 mm2為單位的正方形隨機排布，統(tǒng)計出不同轉(zhuǎn)基因黃花蒿單位面積腺毛數(shù)量，并得出其平均密度。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計，GraphPad Prism 7進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 iaaM 基因的表達(dá)定量

以總RNA反轉(zhuǎn)錄后cDNA作為模板，擴增內(nèi)參基因Actin，并根據(jù)Actin基因擴增情況進(jìn)行模板量調(diào)整，對iaaM基因表達(dá)進(jìn)行半定量分析，得到圖1的結(jié)果。

圖1 iaaM 基因的半定量RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 The agarose gel of semi-quantitative RT-PCR of iaaM

由圖2可以看出，13個轉(zhuǎn)基因單株中以iaaM-2、iaaM-3和iaaM-5基因表達(dá)量最高，iaaM-6和iaaM-4次之，iaaM-9、iaaM-7、iaaM-8、iaaM-11、iaaM-12號表達(dá)量接近，都比較低，iaaM-1、iaaM-10號和iaaM-13號表達(dá)量最低。

圖2 iaaM 基因的半定量RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳灰度分析Fig.2 The Gray-scale analysis of semi-quantitative RT-PCR of iaaM by agarose gel

2.2 不同轉(zhuǎn)基因個體腺毛細(xì)胞的密度觀察

在植株同一生長期，每株材料從頂端分生組織起往下數(shù)取第2、6、10、14、18、22片葉片，共6片，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因黃花蒿與野生型黃花蒿腺毛細(xì)胞的分布情況，如圖3。

按照設(shè)計的統(tǒng)計方法，選取6個同部位的單位面積，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因個體的腺毛密度，結(jié)果如表1。

表1 轉(zhuǎn)iaaM 基因黃花蒿與野生型個體腺毛密度統(tǒng)計Table 1 Statistical of glandular density in transgenic individuals compare with the control plantlet 枚／mm2

根據(jù)表1的統(tǒng)計結(jié)果，iaaM-2腺毛密度最高，相對野生型對照構(gòu)成極顯著差異；iaaM-3～iaaM-9、iaaM-11、iaaM-12對比野生型也達(dá)到極顯著差異；iaaM-13對比野生型存在顯著差異；iaaM-1和iaaM-10則無顯著差異。對照轉(zhuǎn)基因的表達(dá)定量分析結(jié)果，轉(zhuǎn)基因植株腺毛密度與基因的表達(dá)量顯然存在一致性；轉(zhuǎn)基因黃花蒿腺毛密度都高于野生型黃花蒿；基因表達(dá)量越高的個體，腺毛密度也越高。野生型腺毛的平均密度為25.6枚／mm2，而轉(zhuǎn)基因材料最高密度可達(dá)59.9枚／mm2。

3 討論

外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量，直接影響著轉(zhuǎn)基因性狀的表現(xiàn)，也決定了其生產(chǎn)應(yīng)用價值。在轉(zhuǎn)基因?qū)嵺`中，基因重組構(gòu)建的設(shè)計，包括啟動子的強弱、閱讀框架與密碼子選擇、順式作用元件、翻譯過程、表達(dá)系統(tǒng)等都影響外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)［7～11］。本實驗所使用的材料為青蒿腺毛特異表達(dá)GTpro啟動子，與iaaM重組后轉(zhuǎn)化黃花蒿，使基因在腺毛中表達(dá)?；蛑亟M時整合位點不同是轉(zhuǎn)基因個體間差異表達(dá)的重要原因之一。

根據(jù)謝德雄等在煙草中的研究，iaaM基因在表皮毛特異啟動子調(diào)控下的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了煙草表皮毛發(fā)育，是由于葉片表皮細(xì)胞的早期分化調(diào)控存在的反饋調(diào)節(jié)［12］。生長素促使葉片表面的細(xì)胞有更多向表皮毛發(fā)育的傾向，因而提高了表皮毛的密度。黃花蒿的轉(zhuǎn)化也驗證了利用iaaM基因的效果。利用腺毛特異表達(dá)啟動子調(diào)控生長素合成，也能促進(jìn)黃花蒿腺毛的發(fā)育，提高腺毛的密度。

本實驗采用半定量的方法對基因表達(dá)量進(jìn)行分析，這種方法對其定量有一定的局限性，但也能很直觀地通過凝膠中分子熒光亮度判斷出相對量大小。腺毛密度的觀察，轉(zhuǎn)基因黃花蒿腺毛密度與基因表達(dá)量成明顯的正相關(guān)性，說明腺毛細(xì)胞的發(fā)育啟動也存在著生長素與該特異啟動子的反饋作用。不同的轉(zhuǎn)基因個體因為轉(zhuǎn)基因整合位點的不同，使GTpro調(diào)控的iaaM有了差異化的表達(dá)水平。

啟動子特異性是決定iaaM基因表達(dá)對植物發(fā)育影響的關(guān)鍵。彭彥［13］利用韌皮部特異表達(dá)啟動子在擬南芥中過量表達(dá)iaaM，觀察到植株出現(xiàn)下胚軸及葉柄變細(xì)增長、成熟植株相對矮小、葉片窄小向下卷曲等現(xiàn)象。在轉(zhuǎn)基因煙草中同樣出現(xiàn)這種異常表型，如莖上出現(xiàn)大量不定根、植株矮小、葉窄小卷曲且厚度增加等。文紅秀［14］利用組成型表達(dá)啟動子在油菜中過表達(dá)iaaM，出現(xiàn)了植株較野生型矮、每株角果數(shù)、每果粒數(shù)、千粒重等增加的現(xiàn)象。

因此，要利用生長素合成基因來改良植物性狀，關(guān)鍵在于對該基因的表達(dá)調(diào)控，用特定的啟動子在特定的組織細(xì)胞中提高生長素的含量，才能有效改進(jìn)其農(nóng)藝性狀。本實驗通過轉(zhuǎn)iaaM基因表達(dá)量與黃花蒿腺毛密度的相關(guān)性分析，證明轉(zhuǎn)基因在植株個體中表達(dá)量各有差異，而且其表達(dá)量與腺毛密度存在著正向關(guān)聯(lián)，可為選育高青蒿素含量的黃花蒿新品系提供參考。