李建立 江東東 劉柳余 蔣怡穎 羅曼△※

缺血性腦卒中 (ischemic stroke,IS)的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。但大量病因?qū)W研究已經(jīng)表明，IS的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多階段的復(fù)雜過程，是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。根據(jù)當(dāng)前國際普遍使用TOAST分型[1]，IS分為大動(dòng)脈粥樣硬化（large artery atherosclerosis,LAA）型、心源性腦栓塞 （cardio embolism,CE）型、小動(dòng)脈閉塞（small artery occlusion,SAO）型、其他明確原因型和不明原因型。SAO約占所有IS的四分之一[2]，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明遺傳因素在SAO的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[3]，最近一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究 （genome wide association study,GWAS）發(fā)現(xiàn)[4]，包含CCHC結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白14（zinc finger CCHC domain-containing 14,ZCCHC14）基因單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism,SNP）rs12445022與SAO相關(guān)，該研究主要針對(duì)歐洲人群，目前尚無ZCCHC14基因與中國人群SAO相關(guān)性的研究報(bào)告。因此，本研究以中國漢族SAO患者及健康人群作為研究對(duì)象進(jìn)行病例對(duì)照研究，以確定SNP rs12445022與中國漢族人群SAO之間的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年9月至2017年12月就診于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科的SAO患者121例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):① 年齡>18歲；② 中國南方地區(qū)無親緣關(guān)系的常住漢族居民，3代及以上直系親屬內(nèi)無其他民族；③ 診斷符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》中IS診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，所有病例經(jīng)CT和/或 MRI確診；④ 臨床表現(xiàn)為腔隙綜合征，梗死面積最大直徑＜1.5 cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心源性腦栓塞；②同側(cè)顱內(nèi)、外大動(dòng)脈狹窄>50%；③其他已知病因及原因不明性IS；④其他類型的腦血管疾病，包括顱內(nèi)出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、短暫性腦缺血發(fā)作、腦血管畸形、動(dòng)脈瘤等；⑤ 既往有神經(jīng)系統(tǒng)疾病或腦外傷病史；⑥嚴(yán)重心、肝、腎功能不全，血液病，自身免疫性疾病以及腫瘤患者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡和性別匹配；②中國南方地區(qū)漢族居民。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有腦血管病及神經(jīng)系統(tǒng)疾?。虎?患有內(nèi)分泌及代謝性疾病(除外糖尿病)，嚴(yán)重心、肝、腎功能不全，血液病，自身免疫性疾病以及腫瘤患者。本研究獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者充分知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 病例組于入院當(dāng)天，對(duì)照組于體檢當(dāng)天取外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝。使用全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司)提取基因組DNA。

1.2.2 基因分型方法 ① PCR擴(kuò)增:引物使用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì),上游引物序列:5′-ACTGTCCCCCTTGGAACCTCTC-3′，下游引物序列:5′-AAGCCAATGAAAGCGGACACAT-3′,PCR 反應(yīng)體系(20 μL)包含：1×GC 緩沖液 I，3.0 mmol/L 氯化鎂，0.3 mmol/L dNTP，1UHotStarTaq 聚合酶，1 μL 樣本 DNA 和 2 μL多重 PCR 引物 (2 μmol/L)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 2 min；94℃變性 20 s，65℃退火 40 s，72℃延伸 1.5 min，11 個(gè)循環(huán)；94℃變性20 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 1.5 min，24 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物4℃保存。② SNP基因分型：取PCR產(chǎn)物 15 μL，依次加入 SAP酶5 U、外切酶2 U，37℃溫浴1 h，然后 75℃滅活15min。繼而進(jìn)行SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)延伸。延伸引物序列：5′-TTTTTTGCCAGAGCGGGGTAAGGGTT-3′，引物由上海生物工程公司合成。反應(yīng)體系包括：SNaPshot Multiplex Kit(ABI)5 μL，純化后多重 PCR 產(chǎn)物 2 μL，延伸引物 1 μL，超純水 2 μL。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性 1 min；96℃變性10 s，52℃退火 5 s，60℃延伸 30 s，28 個(gè)循環(huán)；4℃保存。在10 μL延伸產(chǎn)物中繼續(xù)加入SAP酶1 U，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min，以純化延伸產(chǎn)物。取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD、9 μL Hi-Di混勻，變性后在ABI3730XL測(cè)序儀上樣，用GeneMapper 4.1分析檢出 AA、GA、GG三種基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用（±s）表示。計(jì)量資料的組間差異比較先行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)或近似t檢驗(yàn);非正態(tài)分布采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的比較及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用檢驗(yàn)。采用單因素非條件logistic回歸計(jì)算OR和95%CI，采用多因素非條件logistic回歸分析對(duì)混雜因素進(jìn)行校正。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

表1 SAO病例組與正常對(duì)照組臨床資料的比較

2 結(jié)果

2.1 SAO組和對(duì)照組臨床資料比較 見表1。病例組與對(duì)照組相比較，年齡、性別、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、冠心病史等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而高血壓史、糖尿病史、吸煙史均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) SAO病例組及對(duì)照組rs12445022位點(diǎn)基因型觀察值與期望值檢測(cè)均符合HWE平衡法則 （SAO病例組=1.504，P=0.220；正常對(duì)照組=2.684，P=0.101），表明兩組樣本均具有群體代表性。

2.3 SAO組和對(duì)照組基因型及等位基因分布情況兩組 ZCCHC14基因 rs12445022位點(diǎn) AA、GA、GG基因型及A、G等位基因分布比較見表2。SAO組與對(duì)照組相比，AA、GA、GG基因型分布 (=2.931、P=0.223)及 A、G 等位基因分布(=3.041、P=0.081)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 不同遺傳模型下SNP rs12445022多態(tài)性與SAO發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 為調(diào)整多重因素對(duì)SAO的影響，以SAO作為因變量，以高血壓史、糖尿病史、吸煙史、LDL-C等作為混雜因素予以校正，進(jìn)行非條件logistic回歸分析。遺傳模型包括顯性(AA+GA vs.GG)、隱性(AA vs.GA+GG)和加性(AA vs.GG)模型。結(jié)果顯示：在三種遺傳模型下，ZCCHC14基因SNP rs12445022多態(tài)性與SAO均無相關(guān)性 (P>0.05)。經(jīng)過校正上述混雜因素后，在顯性模型下，SNP rs12445022多態(tài)性與SAO相關(guān)(校正 OR=2.12,95%CI:1.02～4.40,P=0.044，表3)，提示SNP rs12445022非GG基因型會(huì)增加SAO的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，非GG基因型攜帶者(AA+GA)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是GG基因型攜帶者(GG)的2.12倍。

3 討論

自2003年[6]以來，已有許多項(xiàng)獨(dú)立的GWAS對(duì)IS易感基因多態(tài)性進(jìn)行了探索，并確定了一些與IS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的SNP位點(diǎn)，進(jìn)一步病因?qū)W亞型分析發(fā)現(xiàn)，這些SNP多與LAA、CE亞型相關(guān)，鮮有SNP被發(fā)現(xiàn)與SAO相關(guān)。直至2017年，TRAYLOR等[4]對(duì)歐洲IS人群及正常對(duì)照進(jìn)行了大樣本的GWAS研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZCCHC14基因rs12445022與SAO相關(guān)。緊接著該研究又進(jìn)一步進(jìn)行了功能研究，結(jié)果顯示rs12445022 A等位基因與動(dòng)脈組織中ZCCHC14 mRNA表達(dá)下降有關(guān)，還和血液CpG島甲基化水平降低有關(guān)，因此推測(cè)危險(xiǎn)等位基因是通過降低ZCCHC14的表達(dá)進(jìn)而影響CpG島甲基化水平來介導(dǎo)SAO發(fā)生的[4]。

表2 SAO組和對(duì)照組rs12445022位點(diǎn)基因型及等位基因分布

表3 不同遺傳模型下SNP rs12445022與SAO的相關(guān)性分析

ZCCHC基因編碼一類含有CCHC結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白，后者已被證明具備DNA、RNA、蛋白質(zhì)結(jié)合活性，在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、生殖細(xì)胞形成、神經(jīng)系統(tǒng)形成等眾多過程發(fā)揮重要作用。到目前為止，針對(duì)ZCCHC基因的功能研究較少，其功能可能與轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控有關(guān)。ZCCHC14基因位于人類第16號(hào)染色體上，由約8萬多個(gè)堿基包括14個(gè)外顯子及5個(gè)轉(zhuǎn)錄本。ZCCHC14基因曾被發(fā)現(xiàn)與小頭畸形[7]、尼古丁成癮、酒精成癮[8]和食物成癮[9]相關(guān)。然而，上述研究并未能闡明ZCCHC14的功能，ZCCHC14通過何種信號(hào)通路發(fā)揮作用也不清楚。

繼2017年針對(duì)歐洲人群的GWAS研究[4]之后，2018年MALIK等[10]對(duì)多種族來源（包括歐洲、東亞、南亞、混合亞洲、非洲和拉丁美洲）的GWAS研究進(jìn)行了跨祖先薈萃分析，結(jié)果再次證實(shí)ZCCHC14基因rs12445022與SAO相關(guān)，但該研究所納入的亞洲人群的種族、國籍構(gòu)成不詳。我們以中國南方漢族SAO患者及健康人群作為研究對(duì)象進(jìn)行了病例對(duì)照研究，結(jié)果顯示SAO患者具有更高的高血壓史、糖尿病史及吸煙史，這與既往的研究[11-13]相符。關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，經(jīng)高血壓史、糖尿病史、吸煙史、LDL-C等多因素校正后，ZCCHC14基因SNP rs12445022多態(tài)性與SAO相關(guān)（顯性模型：校正OR=2.12,95%CI:1.02-4.40,P=0.044），提示非GG基因型會(huì)增加SAO的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，非GG基因型攜帶者（AA+GA）的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是GG基因型攜帶者（GG）的2.12倍。雖然SNP rs12445022位點(diǎn)基因型及等位基因分布未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但由于病例對(duì)照設(shè)計(jì)本身受混雜因素的影響，所以需要校正對(duì)結(jié)局有影響的混雜因素，結(jié)果以多因素校正后的結(jié)果為準(zhǔn)，即ZCCHC14基因SNP rs12445022與中國漢族人群SAO相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示ZCCHC14基因SNP rs12445022多態(tài)性與中國南方漢族人群SAO發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。但是，鑒于本研究的樣本量較小以及民族、地域等客觀因素的局限性，因此在今后的研究中需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并選擇中國多個(gè)地區(qū)及民族進(jìn)行研究證實(shí)。