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(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所,貴州貴陽 550006;2.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院,貴州貴陽 550003;3.貴州省威寧縣東方神谷有限責(zé)任公司,貴州威寧 553100;4.貴州省威寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,貴州威寧 553100)

貴州作為全國苦蕎主產(chǎn)區(qū)之一,種植面積常年位居全國前三,苦蕎加工產(chǎn)業(yè)發(fā)達,加工制品多樣,有苦蕎飯、苦蕎酥、苦蕎茶等一系列產(chǎn)品,其中苦蕎飯作為當(dāng)?shù)靥厣朗?已經(jīng)逐漸走向全國市場?？嗍w主要生長于高寒山區(qū),氣候相對潮濕,苦蕎籽粒在溫潮濕的環(huán)境中,極易受到害蟲危害、易霉變、易陳化、易黃變、易發(fā)芽[1]。常見的危害主要為霉菌產(chǎn)生的有毒物質(zhì),其中危害最高的是黃曲霉毒素B1(AFB1),國際癌癥研究機構(gòu)已經(jīng)將AFB1列為一類致癌物[2]。很多國家都對食品中AFB1含量作出嚴格的限量規(guī)定。中國食品安全標準中規(guī)定了幾種易受污染的食物中AFB1的限量標準,玉米、花生、花生油中AFB1允許量為≤20 μg/kg;食用油為≤10 μg/kg;糧食、豆類、發(fā)酵食品為≤5 μg/kg。歐盟等國家規(guī)定稻谷中AFB1含量不能超過5 μg/kg[3]。王艷等[4]采用高效液相色譜法對沿海、西南、華中、華北、東北、西北等6個地區(qū)的蕎麥種子、米、粉、茶、面、飯等不同類型的蕎麥食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量進行測定,發(fā)現(xiàn)6個地區(qū)蕎麥食品中總的黃曲霉毒素的檢出率為34.92%,最高為26.8 μg/kg。因此,苦蕎制品存在較大的安全風(fēng)險,研究有效的黃曲霉毒素降解技術(shù)可降低其安全風(fēng)險,減少損失。

傳統(tǒng)的黃曲霉毒素降解方式有化學(xué)、生物和物理方法。化學(xué)法主要包括堿處理法和氧化法,但化學(xué)法本身存在不穩(wěn)定性,且安全性有待于評估,對產(chǎn)品的其他成分也有一定程度的破壞,因而其應(yīng)用也受到限制[5-6],生物方法會破壞產(chǎn)品性質(zhì),所以適用范圍有限[7]。物理方法主要包括高溫法、輻射法和物理吸附法[8-9]。其中,采用高溫法要加熱至300 ℃才能使AFB1有明顯的分解,顯然成本太高且并不適用與大部分類型的產(chǎn)品。Jubeen等[10]研究了紫外光照射對胡桃、杏仁、開心果和花生中黃曲霉毒素降解效果,發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素G2在照射15 min后被完全降解,黃曲霉毒素G1只有在杏仁和開心果中的降解率能達到100%,AFB1在照射45 min后降解率達到96.5%。Tripathi等[11]研究了長波紫外光(365 nm)對紅辣椒中AFB1的降解效果,30 min后降解率達到59.62%。Ghanem等[12]采用10 kGy劑量的γ射線照射被AFB1污染的花生、玉米和水稻后,發(fā)現(xiàn)其降解率分別達到58.6%、81.1%和87.8%。綜合對比,只有物理降解方法可以最大程度減少對產(chǎn)品的破壞。

本研究通過對比微波、紫外線、γ射線輻照三種物理降解技術(shù),篩選出較適宜的物理降解技術(shù),實現(xiàn)對苦蕎飯中AFB1的無損降解,為保障食品安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎飯 貴州威寧東方神谷食品有限公司提供;99% AFB1標準品 北京索萊寶科技有限公司;甲醇 液相色譜級,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;所用水為超純水。

1260型高效液相色譜儀 配紫外檢測器,色譜柱為Shiseido C18(4.6 mm×250 mm×5 μm),美國Agilent公司;EM-L520P型微波爐 合肥榮事達三洋電器股份有限公司;GHS型紫外燈 深圳市光華士科技有限公司;RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜法測定苦蕎飯中AFB1采用高效液相色譜法檢測苦蕎飯中的AFB1,參照田爾諾等[13]的試驗方法并做簡單修改。稱取30 g苦蕎飯放入250 mL燒瓶中,加入100 mL甲醇,150 r/min震蕩30 min,10000 r/min離心5 min,取離心管中有機溶劑,重復(fù)上述萃取步驟2次,將萃取收集的溶液置于旋蒸儀上50 ℃旋蒸,濃縮并用甲醇定容至10 mL,-20 ℃保存待檢測。色譜條件:檢測波長:365 nm;流動相:水∶甲醇(65∶35,V/V);進樣體積:10 μL;流動相流速:1.0 mL/min;色譜柱柱溫:30 ℃。以AFB1標品濃度為橫坐標X,峰面積為縱坐標Y,繪制標準曲線方程為:Y=13061X+40.559,R2=0.9993,RSD=4.6%(n=6),加標回收率為92.6%。樣品中AFB1降解率參照公式(1)進行計算:

式(1)

其中:C0代表樣品中AFB1初始含量;C1代表樣品經(jīng)過降解處理后的AFB1含量。

1.2.2 樣品加標試驗 分別取7.5、30、60 μg/mL AFB1標準溶液1 mL,加入500 mL超純水中,混勻,分別加入成品苦蕎飯各1 kg,攪拌均勻,放置12 h,中間不斷攪拌,使水分均勻吸收[14]。然后置于80 ℃熱風(fēng)干燥箱中干燥5 h,控制樣品含水量為13%左右,使得樣品重量恢復(fù)至1 kg。

1.2.3 微波降解試驗 為了考察微波降解效果,分別采用“低功率長時間”和“高功率短時間”降解的方式進行試驗。分別稱取加標樣品(7.5、30、60 μg/kg)50 g,設(shè)定微波功率分別為150、200、250、300、350、400 W,時間30 min,采用高效液相色譜法測定AFB1的含量,并計算降解率。稱取各加標樣品50 g,設(shè)定微波功率分別為500、600、700、800、900 W,時間30 s,采用高效液相色譜法測定AFB1的含量,并計算降解率。

稱取各加標樣品50 g,設(shè)定微波功率分別為250 W,時間分別為0、10、20、30、40、50、60 min,采用高效液相色譜法測定AFB1的含量,計算降解率。稱取各加標樣品50 g,設(shè)定微波功率分別為600 W,時間分別為0、15、30、45、60、75、90、120、150、180 s,采用高效液相色譜法測定AFB1的含量,計算降解率。

1.2.4 紫外降解試驗 分別稱取加標樣品(7.5、30、60 μg/kg)50 g,在波長為365 nm,功率為100 W的紫外燈下照射,照射高度為20 cm,設(shè)定照射時間分別為0、10、20、30、40、50、60 min,采用高效液相色譜法測定AFB1的含量,計算降解率。稱取加標樣品50 g,在波長為365 nm,功率為100 W的紫外燈下照射,照射時間為30 min,設(shè)定照射高度分別為10、20、30、40、50、60、70、80 cm,采用高效液相色譜法測定AFB1的含量,計算降解率。

1.2.5γ射線輻照試驗 苦蕎飯輻照委托貴州省農(nóng)科院金農(nóng)輻照有限公司進行處理,稱取50 g待輻照苦蕎飯4份,用自封袋密封后,在選定輻照劑量下(0、5、10、15、20 kGy)進行60Coγ射線輻照處理。

1.2.6 幾種物理降解技術(shù)聯(lián)用 分別稱取加標樣品(7.5、30、60 μg/kg)50 g,在單因素實驗得到的較優(yōu)微波條件、紫外條件及γ射線輻照條件下進行2種或3種物理降解技術(shù)的聯(lián)用,即樣品依次通過微波處理、紫外照射、γ射線輻照,對比幾種物理降解技術(shù)交互作用效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用高效液相色譜法測定AFB1含量時進行3次平行測定并取平均值。采用Excel(Microsoft Office 2003)進行數(shù)據(jù)處理,Origin(Version 8.6)進行作圖,采用SPSS(Version 17.0)進行統(tǒng)計學(xué)分析,P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異,P<0.01認為有統(tǒng)計學(xué)極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波降解技術(shù)的研究

2.1.1 微波功率對黃曲霉毒素降解的影響 由圖1A可知,在低功率條件下,隨著微波功率增加,苦蕎飯中AFB1在不同加標條件下的最大降解率分別為3.6%±0.5%(7.5 μg/kg)、5.2%±0.4%(30 μg/kg)、5.7%±0.5%(60 μg/kg),較優(yōu)輻照功率為300 W。由圖1B可知,在高功率條件下,隨著微波功率增加,苦蕎飯中AFB1在不同加標條件下的最大降解率分別為3.1%±0.2%(7.5 μg/kg)、4.3%±0.4%(30 μg/kg)、4.8%±0.3%(60 μg/kg),較優(yōu)輻照功率為800 W。兩種條件下,隨著微波功率增加,苦蕎飯中AFB1降解率并沒有大幅升高,降解效果較差。實驗結(jié)果顯示高功率降解率沒有低功率好,推測高功率可能會引起樣品性狀發(fā)生變化。

圖1 微波功率對苦蕎飯中AFB1降解的影響Fig.1 Effects of microwave power on AFB1degradation in tartary buckwheat rice

Farag等[15]研究發(fā)現(xiàn),隨著微波強度(100～800 W)的增加和微波時間的延長,黃曲霉毒素的降解率也不斷提高。王周利等[16]采用微波技術(shù)降解玉米粉中AFB1,發(fā)現(xiàn)微波主要利用非熱效應(yīng)對AFB1進行降解,當(dāng)功率為250 W、時間為30 min時,AFB1降解率大于90%,殘留量在國標和歐盟安全限量范圍之內(nèi)。與上述報道相比,苦蕎飯中AFB1的降解率較低,可能原因如下:與玉米粉等原料相比,苦蕎飯為圓粒狀,結(jié)構(gòu)相對緊密,阻礙了微波對苦蕎飯中AFB1的降解;微波降解過程是利用其熱效應(yīng),即指微波能轉(zhuǎn)化為熱能而被材料吸收的效應(yīng),表現(xiàn)為產(chǎn)品的溫度升高,但AFB1性狀較為穩(wěn)定,可能產(chǎn)品升高溫度不足以使AFB1大量降解[17]。

2.1.2 微波時間對黃曲霉毒素降解的影響 由圖2A可知,低功率250 W條件下,隨著微波時間增加,苦蕎飯中AFB1在不同加標條件下的最大降解率為2.7%±0.6%(7.5 μg/kg)、5.2%±0.9%(30 μg/kg)、5.5%±0.3%(60 μg/kg),較優(yōu)微波時間為40 min。由圖2B可知,高功率600 W條件下,隨著微波時間增加,苦蕎飯中AFB1在不同加標條件下的最大降解率為2.9%±0.4%(7.5 μg/kg)、3.7%±0.2%(30 μg/kg)、4.3%±0.5%(60 μg/kg),較優(yōu)微波時間為120 s。兩種條件下,隨著微波時間增加,苦蕎飯中AFB1降解率并沒有大幅升高,降解效果較差。Mobeen等[18]將污染了AFB1和AFB2的花生及花生制品置于微波爐中處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)品中AFB1的降解率為51.1%～100%,而AFB2則被完全降解。綜上,微波對苦蕎飯中AFB1降解效果較差,且微波加熱過程中會造成苦蕎飯失水,影響產(chǎn)品品質(zhì),不適宜用于苦蕎飯中AFB1降解。

圖2 微波時間對AFB1降解的影響Fig.2 Effects of microwave time on AFB1degradation in tartary buckwheat rice注：圖2A微波功率為250 W；圖2B微波功率為600 W。

2.2 紫外降解技術(shù)研究

由圖3A可知,隨著紫外照射時間增加,三種加標條件下苦蕎飯中AFB1降解率均呈升高趨勢,在紫外照射時間為50 min時,AFB1的降解率分別達到8.3%±1.5%(7.5 μg/kg)、29.2%±1.9%(30 μg/kg)、31.9%±1.8%(60 μg/kg),之后隨紫外照射時間繼續(xù)增加,降解率基本保持不變,所以選擇50 min為較優(yōu)的紫外照射時間。由圖3B可知,隨著紫外輻照高度增加,AFB1降解率先升高后降低,在紫外照射高度為30 cm時,AFB1的降解率最大,分別達到9.8%±1.6%(7.5 μg/kg)、31.4%±1.7%(30 μg/kg)、29.0%±0.9%(60 μg/kg),所以選擇30 cm為較優(yōu)的紫外輻照高度。

圖3 紫外線照射對AFB1降解的影響Fig.3 Effects of ultraviolet irradiationon degradation of AFB1

賀冰[19]利用波長365 nm,功率100 W的紫外燈設(shè)備對含AFB1的花生油樣品進行了照射處理,實驗結(jié)果表明,隨著照射時間的延長,花生油樣品中AFB1的含量逐漸降低,在30 min內(nèi)降解率基本可以達到95%。Liu等[20]用強度為800 μW/cm2的紫外光對花生油中AFB1的降解進行研究,結(jié)果顯示,經(jīng)紫外光照射10 min,花生油中的AFB1(2 mg/kg)可以降解約80%。與已有研究相比,本實驗中AFB1的降解率較低,這可能是由于:紫外光的穿透能力不夠強,與花生油相比苦蕎飯致密的組織結(jié)構(gòu)阻礙了紫外光對苦蕎飯內(nèi)部AFB1的降解;紫外殺菌波長與DNA吸收峰相近,微生物受紫外線照射時會使DNA鍵斷裂,導(dǎo)致霉菌死亡,但本實驗屬于加標試驗,AFB1性質(zhì)相對穩(wěn)定,紫外輻照對AFB1的降解效果有待進一步驗證[21]。

2.3 γ射線輻照降解技術(shù)的研究

試驗過程中并不清楚多大劑量會使AFB1降解,所以設(shè)定從高到低4個劑量值進行驗證摸索,圖4所示的是不同60Coγ射線輻照劑量對AFB1降解率的影響。從圖4中可以看出,在輻照劑量為20 kGy時,苦蕎飯中AFB1在不同加標條件下的降解率分別為33.6%±1.5%(7.5 μg/kg)、35.1%±1.7%(30 μg/kg)、45.7%±1.3%(60 μg/kg)。在所考察的輻照劑量范圍內(nèi)相同條件下(含水量13%),苦蕎飯中AFB1的降解率隨輻照劑量的增加而顯著增加(P<0.05)。試驗結(jié)果與Hooshmand等[22]關(guān)于γ射線對玉米、小麥和大豆中AFB1輻照降解的研究結(jié)果相似。朱佳廷等[23]研究了輻照對稻米中AFB1的降解,發(fā)現(xiàn)在4 kGy的輻照劑量下,降解率達到42%,在6 kGy時,降解率可達到84%,當(dāng)輻照劑量增至10 kGy 時,降解率達到98%。王鋒[24]測定了水、甲醇-水兩個體系中AFB1的降解率分別達到94.3%和58.8%,同時測定花生粕和純品固體中同劑量下AFB1的降解率為13.5%和10.3%,研究發(fā)現(xiàn)水在AFB1的輻射降解過程中發(fā)揮著重要作用?？嗍w飯中含水量較低,且結(jié)構(gòu)致密,所以導(dǎo)致γ射線輻照降解效果較差。在20 kGy輻照劑量下不會造成殘留等安全問題,但對于苦蕎飯品質(zhì)的影響需要進一步深入研究。

圖4 γ射線輻照劑量對AFB1降解的影響Fig.4 Effects of γ radiation doseon degradation of AFB1

2.4 不同降解技術(shù)的對比

由表1可知,在三種加標條件下,隨著加標劑量的增加,微波、紫外線、γ射線輻照三種降解技術(shù)對苦蕎飯中AFB1最大降解率均呈升高趨勢,γ射線輻照降解技術(shù)在7.5和60 μg/kg加標劑量下最大降解率均顯著高于微波和紫外線降解(P<0.05)。綜合對比,苦蕎飯中AFB1降解率為:γ射線輻照>紫外線降解>微波降解,但鑒于苦蕎飯?zhí)厥獾漠a(chǎn)品性質(zhì)和AFB1本身性質(zhì)穩(wěn)定,通過本實驗的3種物理降解技術(shù),在不破壞產(chǎn)品外觀性狀的前提下,降解效果并不好,而且實驗過程中存在低劑量降解率低于高劑量降解率的現(xiàn)象,可能是污染量少的時候降解量也相對較少,所以降解率偏低。3種降解技術(shù)降解效果都欠佳,在低劑量污染時有一定的應(yīng)用價值,高劑量污染時需要采取更為有效的降解措施。

表1 不同降解技術(shù)對苦蕎飯中AFB1降解率對比Table 1 Comparison of degradation rates of AFB1 in tartary buckwheat rice by different degradation technologies

注：不同小寫字母代表同種加標劑量下降解率差異顯著,P<0.05。

通過將不同降解技術(shù)進行聯(lián)合,考察3種降解技術(shù)協(xié)同降解效果,發(fā)現(xiàn)將任意2種或者3種降解技術(shù)聯(lián)合后,其降解率均顯著增加(P<0.05)。3種降解技術(shù)聯(lián)合降解效果色譜圖見圖5。三種技術(shù)聯(lián)合降解率可達51.9%±0.9%(7.5 μg/kg)、66.5%±0.7%(30 μg/kg)、71.5%±0.9%(60 μg/kg)?？偟膩碚f,低劑量污染時,3種物理降解技術(shù)可以將污染劑量降解至國家安全標準(GB 2761-2017)以內(nèi),高劑量污染時無法將污染劑量降解至安全范圍以內(nèi),所以3種物理降解技術(shù)對于苦蕎飯中低劑量的黃曲霉毒素污染有一定的利用價值。

圖5 微波+紫外線+γ射線輻照聯(lián)合降解效果色譜圖Fig.5 Chromatographic diagram of the combineddegradation effect of the three technologies ofmicrowave,ultraviolet and γ ray irradiation注:A代表加標量7.5 μg/kg;B代表加標量30 μg/kg;C代表加標量60 μg/kg。

3 結(jié)論

對比了微波、紫外線、γ射線三種物理方法對貴州苦蕎飯中AFB1的降解效果,結(jié)果顯示,在不同加標條件下,微波降解率最低,γ射線在輻照劑量為20 kGy時,降解率分別為33.6%±1.5%(7.5 μg/kg)、35.1%±1.7%(30 μg/kg)、45.7%±1.3%(60 μg/kg)。同時對3種技術(shù)協(xié)同作用進行研究,發(fā)現(xiàn)將任意2種或者3種降解技術(shù)聯(lián)合后,其降解率均顯著增加(P<0.05),3種技術(shù)聯(lián)合降解率可達51.9%±0.9%(7.5 μg/kg)、66.5%±0.7%(30 μg/kg)、71.5%±0.9%(60 μg/kg)?？偟膩碚f,物理降解技術(shù)達到的效果有限,且γ射線輻照能量大,容易破壞物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu),并可能會發(fā)生較為復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng),對產(chǎn)品品質(zhì)的影響還有待評估。下一步應(yīng)綜合考察物理降解技術(shù)對產(chǎn)品內(nèi)在營養(yǎng)品質(zhì)和外在感官品質(zhì)的影響,為苦蕎飯中黃曲霉毒素污染問題提供全面的解決方案。