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(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128;2.慈利縣九九農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,湖南張家界 427200)

杜仲屬于單科、單屬、單種的落葉喬木,是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)植物,傳統(tǒng)以杜仲皮入藥,為我國(guó)名貴中藥材,在我國(guó)許多經(jīng)典藥學(xué)著作中均有記載,而杜仲樹剝皮后容易死亡,制約了杜仲的藥用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn),杜仲葉屬于可再生資源,并且與杜仲皮化學(xué)成分相似[1],葉中多酚類物質(zhì)的含量高于皮[2],具有補(bǔ)肝益腎、強(qiáng)筋健骨、抗氧化[3]、降血壓[4-5]、降血脂等功效[6]。

高壓脈沖電場(chǎng)提取是將液態(tài)樣品或液體浸泡的固態(tài)樣品作為電解質(zhì)置于容器內(nèi),通過放電產(chǎn)生高壓電流,破壞植物細(xì)胞,改變其通透性,使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)能夠有效流出的一種食品加工方法[7-8]。高壓脈沖電場(chǎng)在食品加工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,主要包括物料干燥[9]、食品殺菌[10]、輔助提取活性成分[11]等。Boussetta等[12]用高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取葡萄渣中的多酚,結(jié)果表明,高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取的多酚提取率比對(duì)照組高30%。Kantar等[13]等發(fā)現(xiàn)利用高壓脈沖電場(chǎng)輔助柑橘、柚子和檸檬榨汁會(huì)使果汁中多酚含量增加了大約39%、66%和135%。也有研究表明,高壓脈沖電場(chǎng)與水酶提取結(jié)合,多酚含量從0.5 mg/g提高到4.3 mg/g[14]。脈沖電場(chǎng)雖然可以提高多酚含量,但是對(duì)于提高多酚含量的影響因素方面研究不足。

多酚是杜仲葉主要活性成分[15]之一,具有抗氧化、抗衰老、殺菌、抗腫瘤癌變、抗心血管疾病等作用[16-20]。植物總多酚分為可萃取多酚與不可萃取多酚兩部分。可萃取多酚通過簡(jiǎn)單的有機(jī)相萃取即可獲得,而不可萃取多酚需要通過化學(xué)或酶法破壞細(xì)胞壁才能分離[21]。有研究表明,不可萃取多酚的含量高于可萃取多酚[22],在食品營(yíng)養(yǎng)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)于不可萃取多酚提取工藝的研究較少。

因此本實(shí)驗(yàn)利用高壓脈沖電場(chǎng)輔助水酶法提取杜仲葉中不可萃取多酚,響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝,為未來杜仲葉開發(fā)利用提供理論依據(jù)及研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

華仲8號(hào)杜仲葉 采自湖南省慈利縣九九農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,將杜仲葉清洗后于-80 ℃冰箱下預(yù)冷,然后進(jìn)行冷凍干燥,將干燥好的杜仲葉用中藥粉碎機(jī)粉碎,過60目篩,密封放-20 ℃冰箱保存待用;沒食子酸(純度≥99%) 成都瑞芬思生物科技有限公司;纖維素酶(400 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;水 為超純水;丙酮、乙酸乙酯、甲醇 分析純,國(guó)藥集團(tuán);其他試劑 均為分析純。

高壓脈沖電場(chǎng) 實(shí)驗(yàn)室自制;GO-酶標(biāo)儀 Thermo Fisher Scientific公司;DTY-A220型電子天平 美國(guó)康州HZ電子科技有限公司;TF-FD-1L型冷凍干燥機(jī) 上海拓紛機(jī)械設(shè)備有限公司;KM-300DE型中文液晶超聲波清洗器 昆山美美超聲儀器有限公司;LH-08B型中藥粉碎機(jī) 浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠;RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市中天科技儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 杜仲葉不可萃取多酚的提取 取保存于-20 ℃的杜仲葉粉末,加入85%丙酮(料液比=1∶10 g/mL)攪拌均勻,渦旋30 s,30 ℃下240 W超聲30 min,取出后抽濾分離上清液和殘?jiān)?殘?jiān)謩e用甲醇、水各洗3次,凍干后作為提取不可萃取多酚原料。取1 g凍干粉末加入8 mL的蒸餾水及一定量的纖維素酶,使用高壓脈沖電場(chǎng)進(jìn)行提取,抽濾得上清液,即為杜仲葉不可萃取多酚提取液。

1.2.2 不可萃取多酚含量的測(cè)定 參考Sun等[23]的方法并稍作修改。稱取5 mg沒食子酸于50 mL容量瓶中,再分別取0、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中,蒸餾水定容,得0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品。取50 μL不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于96孔板中,加入50 μL福林酚試劑,中速振蕩1 min,避光反應(yīng)10 min后加入125 μL 7.5%的碳酸鈉,中速振蕩1 min,避光反應(yīng)1.5 h后,置于酶標(biāo)儀板槽內(nèi),在765 nm處測(cè)量吸光度。以濃度為橫坐標(biāo),吸光度 為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線方程為:Y=16.439X+0.028,R2=0.9991。杜仲葉中不可萃取多酚含量的計(jì)算公式為:

不可萃取多酚含量(mg/g)=(C×V)/D

式中:C為標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出的濃度,mg/mL;V為提取液體積,mL;D為杜仲葉殘?jiān)|(zhì)量,g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取0.1 g左右的杜仲葉殘?jiān)?以水為提取溶劑,固定單因素水平為:酶用量為12 mg、場(chǎng)強(qiáng)為2.81 kV/cm、脈沖數(shù)為100次,考察不同的酶用量(10、12、14、16、18 mg)、場(chǎng)強(qiáng)(2.21、2.51、2.81、3.11、3.41 kV/cm)、脈數(shù)(20、40、60、80、100次)對(duì)杜仲葉不可萃取多酚提取效果的影響。場(chǎng)強(qiáng)設(shè)置在2.21～3.41 kV/cm之間是因?yàn)樵诖藚^(qū)間內(nèi)不可萃取多酚提取率變化較為明顯,繼續(xù)增大場(chǎng)強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致電壓不穩(wěn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[24],在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以酶用量(A)、場(chǎng)強(qiáng)(B)、脈沖數(shù)(C)為考察因素,杜仲葉不可萃取多酚含量為響應(yīng)值,采用三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)3次平行。通過OriginPro 8.5整理數(shù)據(jù),繪制圖片,并采用Design-Expert 10統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶用量對(duì)不可萃取多酚提取效果的影響 由圖1可知,不可萃取多酚的含量隨著酶用量的增加呈現(xiàn)出先上升、后下降的趨勢(shì),當(dāng)酶用量為16 mg時(shí)達(dá)到最大值,為31.38 mg/g。這是因?yàn)槔w維素酶的增加會(huì)破壞杜仲葉細(xì)胞壁,增強(qiáng)膜的滲透性,利于多酚類物質(zhì)溶出,但是過多的纖維素酶就會(huì)產(chǎn)生粘附性,阻塞多酚物質(zhì)溶出通道,同時(shí)酶量飽和時(shí),酶解反應(yīng)較為完全,繼續(xù)增大酶量會(huì)產(chǎn)生抑制作用[25-26]。

圖1 酶用量對(duì)不可萃取多酚含量的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on thecontent of non-extractable polyphenols

2.1.2 場(chǎng)強(qiáng)對(duì)不可萃取多酚提取效果的影響 場(chǎng)強(qiáng)與細(xì)胞膜的通透性密切相關(guān),當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)增大時(shí),使細(xì)胞膜兩側(cè)形成電位差,從而導(dǎo)致磷脂雙分子層發(fā)生位移,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,提高細(xì)胞通透性,有利于溶劑進(jìn)入細(xì)胞,同時(shí)胞內(nèi)物質(zhì)釋放能力增強(qiáng)[27]。從圖2中可以看出,隨著場(chǎng)強(qiáng)的增大,不可萃取多酚的含量逐漸上升,當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)為3.41 kV/cm時(shí),含量為29.51 mg/g,由于實(shí)驗(yàn)儀器限制,繼續(xù)增大場(chǎng)強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致電壓不穩(wěn),所以場(chǎng)強(qiáng)最大為3.41 kV/cm。

圖2 場(chǎng)強(qiáng)對(duì)不可萃取多酚含量的影響Fig.2 Effect of field strength on thecontent of non-extractable polyphenols

2.1.3 脈沖數(shù)對(duì)不可萃取多酚提取效果的影響 由圖3可知,不可萃取多酚含量隨著脈沖數(shù)的增加呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。當(dāng)脈沖數(shù)為80次時(shí),含量最高為18.49 mg/g,小于80次時(shí),脈沖數(shù)過小,對(duì)細(xì)胞的破壞的程度較低,不利于多酚物質(zhì)的溶出;增大脈沖數(shù),電場(chǎng)的作用頻率增強(qiáng),同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞的破壞程度及破壞細(xì)胞數(shù)量,但脈沖數(shù)過大,時(shí)間過長(zhǎng),會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)定因素,破壞多酚物質(zhì)結(jié)構(gòu),從而降低了不可萃取多酚的含量[28]。

圖3 脈沖數(shù)對(duì)不可萃取多酚含量的影響Fig.3 Effect of pulse number on thecontent of non-extractable polyphenols

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化不可萃取多酚的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 為優(yōu)化高壓脈沖電場(chǎng)結(jié)合水酶提取杜仲葉中不可萃取多酚的工藝條件,采用三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,精密稱取0.1 g左右的杜仲葉殘?jiān)诒壬苤?按照表1的因素水平對(duì)杜仲葉不可萃取多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。具體方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Scheme and experimental resultsof response surface design

2.2.2 模型評(píng)價(jià) 利用Design-Expert軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合,得到的數(shù)學(xué)模型為:

Y=22.2+3.44A-1.9B+2.27C-1.05AB+1.36AC+0.7BC+2.06A2+1.13B2+0.27C2

模型方差分析結(jié)果和各項(xiàng)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果列于表3。

2.2.3 響應(yīng)面分析 由圖4可知,當(dāng)酶用量和脈沖數(shù),場(chǎng)強(qiáng)和脈沖數(shù)的響應(yīng)面圖曲面走勢(shì)陡峭,響應(yīng)值的改變較為敏感,同時(shí)等高線呈橢圓形且曲線密集,這說明酶用量與脈沖數(shù),場(chǎng)強(qiáng)與脈沖數(shù)的交互作用對(duì)不可萃取多酚的含量有顯著性影響。而酶用量和場(chǎng)強(qiáng)交互作用的響應(yīng)面圖曲面較為平緩,響應(yīng)值改變不敏感,等高線不密集,這說明不可萃取多酚的含量受兩者交互作用影響的變化程度較小。通過最優(yōu)化分析,最佳的提取條件為酶用量18 mg,場(chǎng)強(qiáng)2.81 kV/cm,脈沖數(shù)100次,預(yù)測(cè)值為34.969 mg/g。

表3 回歸模型各項(xiàng)方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表4 平行試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Parallel test results

圖4 各兩因素的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of each two factors

2.2.4 試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn),測(cè)得杜仲葉不可萃取多酚的含量為(34.961±0.052) mg/g,與預(yù)測(cè)值34.969 mg/g相比,相差0.008 mg/g,說明此方程與實(shí)際情況擬合良好,建立的模型可靠。

3 結(jié)論

為了充分發(fā)揮杜仲葉的藥用價(jià)值,本文采用高壓脈沖電場(chǎng)輔助水酶法提取杜仲葉殘?jiān)胁豢奢腿《喾?對(duì)杜仲葉不可萃取多酚方面的研究進(jìn)行補(bǔ)充。研究得出,高壓脈沖電場(chǎng)輔助水酶法提取杜仲葉中不可萃取多酚的最佳提取工藝為:酶用量18 mg,場(chǎng)強(qiáng)2.81 kV/cm,脈沖數(shù)100次,在此條件下,不可萃取多酚的含量為(34.961±0.052) mg/g。目前,關(guān)于杜仲葉不可萃取多酚提取的研究較少,不可萃取多酚具有多種生物活性價(jià)值,對(duì)杜仲葉殘?jiān)M(jìn)行提取有極大地利用了杜仲葉,避免杜仲葉資源的浪費(fèi)。對(duì)于不可萃取多酚的提取,應(yīng)用較多的方法為酸水解方法和堿水解法,酸堿提取法存在耗時(shí)長(zhǎng)、酸堿污染等、資源浪費(fèi)等不足,而本文采用的高壓脈沖電場(chǎng)是一種新型提取技術(shù),具有能耗小、耗時(shí)短、效率高、無污染等優(yōu)勢(shì),最重要的是能極大地保留原料中含有的化學(xué)成分。本文對(duì)于杜仲葉不可萃取多酚的研究尚存在一些不足,包括化學(xué)成分及抗氧化、抗癌、抑菌等生物活性等,接下來將會(huì)研究補(bǔ)充。