(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,鄭州市大豆深加工重點(diǎn)試驗(yàn)室,河南鄭州 450000)

新鮮納豆因其獨(dú)特的氨臭味不能被大多數(shù)中國人所接受[15],所以改良其風(fēng)味、提高接受度具有重要意義。目前改良納豆的常見方法有三種,優(yōu)化發(fā)酵菌種、添加發(fā)酵底物和改變發(fā)酵菌種。Takemura等通過敲除特定基因來培育低臭的納豆菌種[16]。Koguchi等通過實(shí)驗(yàn)證明改變底物成分可達(dá)到減少不良?xì)馕兜男Ч鸞17]。吳雪嬌等[18]通過添加白糖發(fā)酵,添加酸奶后熟改良納豆風(fēng)味。付文靜[19]通過添加花生粕共同發(fā)酵來改良納豆,改善了傳統(tǒng)納豆的口感,提升了納豆的品質(zhì)。王麗娜等[20]通過添加花生發(fā)酵和調(diào)味料調(diào)制成蒜蓉口味的納豆來提高產(chǎn)品的可接受度。陳思[21]用納豆芽孢桿菌T與沼澤紅假單胞菌混合發(fā)酵對納豆風(fēng)味進(jìn)行改良,改良后納豆激酶酶活提高且氨含量減少,氨臭味有明顯改良。高沛汝[22]利用納豆芽孢桿菌和酵母菌共同發(fā)酵,氨臭味明顯降低。本實(shí)驗(yàn)擬采取分步發(fā)酵的方式改良納豆,使納豆芽孢桿菌在前期發(fā)酵時(shí)充分利用營養(yǎng)物質(zhì)生成納豆激酶,在保留其特征性營養(yǎng)物質(zhì)的前提下改良其風(fēng)味。

嗜熱鏈球菌是一種常見發(fā)酵劑,在人體內(nèi)可耐胃酸、膽鹽,抑制致病菌并產(chǎn)生維生素等生物活性物質(zhì)。嗜熱鏈球菌常應(yīng)用于乳制品發(fā)酵,大豆肽風(fēng)味改良等方面,不僅可以產(chǎn)生特殊風(fēng)味物質(zhì),且因其自身缺乏蛋白酶或酶活較弱,可與納豆菌競爭含氮蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物[23],減少納豆菌產(chǎn)出不良?xì)馕段镔|(zhì)含量。本實(shí)驗(yàn)擬通過納豆芽孢桿菌與乳酸菌嗜熱鏈球菌分步發(fā)酵來改良納豆的風(fēng)味,設(shè)置不同的嗜熱鏈球菌發(fā)酵的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量,通過分析其感官評分、納豆激酶酶活,探索最佳發(fā)酵改良納豆的條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃豆(墾豐16號) 鄭州種子市場;納豆芽孢桿菌(BNCC 185324)、嗜熱鏈球菌(BNCC 335885) 北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司;MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯、牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;瓊脂、0.01 mol/L PBS緩沖溶液、纖維蛋白原、凝血酶(1000 U)、尿激酶(1240 IU) Solarbio公司;鹽酸(優(yōu)級純) 煙臺(tái)市雙雙化工有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

Neofuge 1600R臺(tái)式高速離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司;UV2000紫外可見分光光度計(jì) 龍尼柯(上海)儀器有限公司;SX-500全自動(dòng)蒸汽滅菌鍋 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司;SW-CJ超凈工作臺(tái) 上海樹立儀器儀表有限公司;BagMixer400拍擊式均質(zhì)器 法國Interscience公司;K1301半自動(dòng)定氮儀 上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納豆芽孢桿菌發(fā)酵大豆 將黃豆清洗后在30 ℃下浸泡3 h至黃豆顆粒充分吸水膨脹,常壓蒸煮30 min進(jìn)行滅菌熟制。冷卻至30 ℃進(jìn)行納豆芽孢桿菌接種,接種量為2%(菌液濃度為106CFU/g濕基),在37 ℃下發(fā)酵24 h。

1.2.2 嗜熱鏈球菌發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn) 將納豆芽孢桿菌發(fā)酵后的大豆進(jìn)行嗜熱鏈球菌二次發(fā)酵。以嗜熱鏈球菌發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量為3個(gè)因素,以納豆激酶酶活和感官評分為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)酵時(shí)間30 h,接種量1.5%時(shí),發(fā)酵溫度分別為33、36、39、42、45 ℃時(shí)對評價(jià)指標(biāo)的影響;研究發(fā)酵溫度42 ℃,接種量1.5%時(shí),發(fā)酵時(shí)間分別為0、10、20、30、40、50 h時(shí)對評價(jià)指標(biāo)的影響;研究發(fā)酵溫度42 ℃,發(fā)酵時(shí)間20 h時(shí),接種量分別為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%時(shí)對評價(jià)指標(biāo)的影響。實(shí)驗(yàn)在無菌操作臺(tái)中操作,所有樣品接觸器材均滅菌處理。

1.2.3 嗜熱鏈球菌發(fā)酵響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,以發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、接種量(C)為優(yōu)化條件,以感官評分、納豆激酶酶活為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定最優(yōu)嗜熱鏈球菌發(fā)酵條件。因素水平見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平表Table 1 Factors and level tables ofBox-Behnken response surface test design

1.2.4 建立感官評分模糊數(shù)學(xué)模型 根據(jù)樣品色澤、氣味、滋味進(jìn)行感官評分,感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。參考文獻(xiàn)[24-25],建立模糊數(shù)學(xué)模型。將感官評分得分建立模糊矩陣Rij。

式中:i=1，2，3，…(樣品編號);j=1，2，3分別代表樣品色澤、氣味、滋味的得分。

設(shè)質(zhì)量因素權(quán)重為X,采用強(qiáng)制決定法確定各質(zhì)量因素的權(quán)重,確定權(quán)重集為X。

X=[0.3 0.4 0.3]T

即產(chǎn)品質(zhì)量特性中色澤占30%,氣味占40%,滋味占30%。樣品模糊數(shù)學(xué)感官評分集Y=R×X。第i組樣品的評價(jià)結(jié)果為Yi=Ri×X。

1.2.5 納豆激酶酶活測定和感官評價(jià) 納豆激酶酶活的測定:參考付文靜[19]改良的分光光度計(jì)法;感官評價(jià):選取河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院10名研究生根據(jù)樣品色澤、氣味、滋味進(jìn)行感官評分,感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。結(jié)果由1.2.4中所建模型進(jìn)行計(jì)算,得到綜合評分。

1.2.6 改良前后納豆?fàn)I養(yǎng)成分變化 通過測定納豆水分含量(采用李君[26]的干燥箱測定法)、粗脂肪(采用GB 5009.6-2016第一法測定)、粗蛋白(采用GB 5009.5-2016第一法測定)、氨基酸態(tài)氮含量(采用甲醛滴定法)、納豆激酶酶活(參考付文靜[19]改良的分光光度計(jì)法)和異黃酮含量(采用紫外分光光度計(jì)法[27])來評價(jià)改良前后納豆的營養(yǎng)變化。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有測定重復(fù)3次取平均值;實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0、Origin 8.0和Design Expert 10.0軟件處理分析。

表2 納豆感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of natto

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活和納豆感官評分的影響

由圖1可知,納豆激酶酶活隨著溫度的增加呈先增加后降低的趨勢,在42 ℃時(shí)達(dá)到最大值,納豆激酶酶活為(1248±91) U/g。發(fā)酵溫度為45 ℃時(shí),由于溫度過高抑制菌種的生長及代謝,所以納豆激酶酶活下降;隨著溫度的增加,感官評分先增加后降低,39與42 ℃的感官評分沒有顯著差異,但在42 ℃時(shí)感官評分最高,為(8.1±0.6) 分。綜上,選42 ℃為后續(xù)研究參數(shù)。

圖1 發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活和納豆感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation temperatureon nattokinase enzyme activity and sensory scores注:圖中不同小寫字母表示具有顯著性差異P<0.05;相同字母表示不具有顯著性差異P>0.05;圖2、圖3同。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對納豆感官評分和納豆激酶酶活的影響

由圖2可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的增長,納豆激酶酶活先增加后降低。在20 h時(shí)達(dá)到最高值,納豆激酶酶活為(1790±128) U/g。在20 h之后,納豆激酶酶活整體呈降低趨勢,這是由于嗜熱鏈球菌與納豆芽孢桿菌競爭發(fā)酵底物,且納豆芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間過長,進(jìn)入衰亡期;隨著發(fā)酵時(shí)間的增長,感官評分先增加后降低。在10～30 h范圍內(nèi),感官評分無顯著性差異,但在20 h時(shí)達(dá)到最高分,感官評分為(7.6±0.2) 分。綜上,選20 h為后續(xù)研究參數(shù)。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對納豆激酶酶活和感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation timeon nattokinase enzyme activity and sensory scores

2.3 接種量對納豆感官評分和納豆激酶酶活的影響

圖3 接種量對納豆激酶酶活的影響Fig.3 Effect of inoculation on nattokinaseenzyme activity and sensory scores

由圖3可知,隨著接種量的增加,納豆激酶酶活先增加后降低。在1.5%時(shí)達(dá)到最大值,納豆激酶酶活為(1914±69) U/g。而接種量大于1.5%時(shí),納豆激酶酶活會(huì)下降,且接種量為2.5%時(shí)的納豆激酶酶活低于改良前的,這是因?yàn)槭葻徭溓蚓臃N量過高,產(chǎn)酸增加,pH降低,影響納豆芽孢桿菌的發(fā)酵,并且降低納豆激酶的活力,造成納豆激酶酶活下降;隨著接種量的增加,感官評分整體呈增加趨勢,在1.5%時(shí)感官評分最高,為(7.8±0.4) 分。綜上,選擇1.5%為后續(xù)研究參數(shù)。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance

注：“*”表示差異顯著(P<0.05);“**”表示差異極顯著(P<0.01);表5同。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response variable Box-Behnken design

2.4.2 以感官評分為響應(yīng)指標(biāo)的響應(yīng)面結(jié)果分析 利用Design-Expert 10.0對感官評分(Y)與各因素進(jìn)行多元回歸分析,同時(shí)擬合得二次回歸方程:

Y=-162.83+7.61A+1.45B-0.90C-0.02AB-0.01BC-0.09A2-0.01B2+0.30C2

以感官評分為響應(yīng)值的響應(yīng)面二次回歸模型方差分析結(jié)果見表4。

3D響應(yīng)面圖可直觀反映出因素之間的交互作用。由圖4可知,等高線呈橢圓形且曲線密集,表明發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對感官評分的影響顯著。

2.4.3 以納豆激酶酶活為響應(yīng)指標(biāo)的響應(yīng)面結(jié)果分析 利用Design-Expert 10.0納豆激酶酶活(Z)與各因素進(jìn)行多元回歸分析,同時(shí)擬合得二次回歸方程:

Z=-93437.53+4185.99A+500.58B+3439.15C-4.21AB-2.67AC-18.95BC-48.72A2-7.9B2-967.8C2

以納豆激酶酶活為響應(yīng)值的響應(yīng)面二次回歸模型方差分析結(jié)果見表5。

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance

圖4 發(fā)酵參數(shù)交互作用對感官評分的影響Fig.4 Effect of interaction of fermentationparameters on sensory scores

圖5 發(fā)酵參數(shù)交互作用對納豆激酶酶活的影響Fig.5 Effect of interaction of fermentationparameters on nattokinase activity

由圖5可知,接種量、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用均不顯著。

2.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析,嗜熱鏈球菌發(fā)酵最佳參數(shù)為:發(fā)酵溫度42 ℃,發(fā)酵時(shí)間18.6 h,接種量1.5%。預(yù)測結(jié)果感官評分8.1分,納豆激酶酶活2014 U/g。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,改良后的納豆呈鮮黃色,飽滿有光澤,有豆香味及些許氨臭味,無明顯后苦味。感官評分(8.0±0.037) 分,納豆激酶酶活(1964±83) U/g,均與預(yù)測值無顯著性差異(P>0.05),從而也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝的有效性。

2.5 改良前后營養(yǎng)成分變化結(jié)果

由表6知,與普通納豆相比,改良后納豆水分含量沒有明顯變化;粗脂肪、粗蛋白和氨基酸態(tài)氮含量降低,這由于嗜熱鏈球菌的代謝作用使得脂肪、蛋白質(zhì)和氨基酸被進(jìn)一步分解。

表6 納豆改良前后營養(yǎng)成分變化結(jié)果Table 6 Changes in nutrient compositionbefore and after natto improvement

注：同列均值無不同上標(biāo)字母者表示不存在差異顯著(P>0.05);同列均值有不同上標(biāo)字母者表示差異顯著(P<0.05)。

改良后納豆激酶酶活增加,異黃酮含量明顯升高,這可能是由于嗜熱鏈球菌二次發(fā)酵過程中,分解了更多可利用作用底物供納豆菌生物反應(yīng)。改良后的納豆不僅風(fēng)味上更易被人們所接受,且主要活性物質(zhì)納豆激酶酶活也提升了87.0%。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證明,嗜熱鏈球菌發(fā)酵改良納豆的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度42 ℃,發(fā)酵時(shí)間18.6 h,接種量1.5%,此條件下納豆感官評分為8.0,納豆激酶酶活為1964 U/g。改良后納豆粗脂肪、粗蛋白、氨基酸態(tài)氮含量下降,生物活性物質(zhì)納豆激酶酶活增加87.0%,異黃酮含量增加92.0%為(1.40±0.016) mg/g。改良后納豆感官上更易為人們所接受,生物活性物質(zhì)也有所提高,改良效果較好。