,2,*

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150040)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科沙棘屬多年生落葉灌木或小喬木,別名醋柳、黑刺,主要分布在歐亞大陸地區(qū),我國(guó)是世界上沙棘資源蘊(yùn)藏量最豐富的的國(guó)家,占世界總面積的95%以上,素有“沙棘王國(guó)”之稱[1]。沙棘果含有豐富的多糖、黃酮、酚類化合物、脂肪酸等生物活性成分[2-5],具有抗氧化、抗菌、抗炎、護(hù)肝等功效[6-9]。多酚是一類多羥基酚及其衍生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物,對(duì)人體健康有保護(hù)作用,其鄰位酚羥基極易被氧化,具有良好的抗氧化活性。隨著天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用的興起,多酚由于其獨(dú)特的功能結(jié)構(gòu)和生理活性被廣泛關(guān)注[10]。

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是一種慢性神經(jīng)中樞系統(tǒng)退行性疾病,主要特征表現(xiàn)為癡呆和大腦中神經(jīng)元細(xì)胞的損傷,嚴(yán)重威脅老年人身體健康和生活質(zhì)量,隨著世界人口老齡化的發(fā)展,已經(jīng)成為當(dāng)今世界亟需解決的重大難題[11]。AD病因和病程尚未明確,臨床上的治療手段只能改善AD患者癥狀,并不能達(dá)到治療的效果,目前仍缺乏有效預(yù)防和治療的藥物及方法[12]。而整體綜合調(diào)治,多環(huán)節(jié)、多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用正是中醫(yī)藥的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)[13]。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于SBP的研究主要集中在成分鑒定和心臟保護(hù)等方面,關(guān)于抗AD的活性研究鮮見(jiàn)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取,通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)SBP提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)探索SBP的抗AD活性,為天然植物抗AD成分研究及研制新型高效低毒抗AD藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR小鼠 雄性,8周齡,(20±2) g,60只,由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(黑)2013-001;沙棘果 佳木斯民生藥行提供;奧拉西坦膠囊 石藥建團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司;乙酰膽堿酯酶測(cè)定試劑盒、乙酰膽堿測(cè)定試劑盒、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;酒石酸亞鐵 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氯化鋁 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;D-半乳糖 北京化學(xué)試劑公司;以上試劑均為分析純。

FA2004型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;DL-5-B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;765紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FC型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾儀器有限公司;Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng) 成都泰盟科技有限公司;XSP-13C-LP顯微鏡 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘果多酚的提取 準(zhǔn)確稱取1.0 g沙棘果粉于50 mL具塞錐形瓶中,加入10 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇,超聲提取20 min,以4000 r/min離心10 min,收集上清液,得沙棘果多酚粗提液。

1.2.2 多酚提取量的測(cè)定 以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,選用酒石酸亞鐵法測(cè)定多酚含量[14],在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度,重復(fù)3次,以吸光度A為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照回歸方程計(jì)算得提取液中多酚含量。計(jì)算多酚提取量。計(jì)算公式如下:

式中:C表示總酚質(zhì)量濃度,mg/mL;N表示稀釋倍數(shù);V表示提取液體積,mL;M表示沙棘粉質(zhì)量,g/DW。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 固定超聲功率200 W和提取溫度50 ℃,分別采用體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液,超聲時(shí)間30 min,液料比20∶1 mL/g,提取3次,考察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)沙棘果乙醇提取物提取量的影響;采用最佳體積分?jǐn)?shù)乙醇,超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min,液料比20∶1 mL/g,提取3次,考察不同超聲時(shí)間對(duì)沙棘果乙醇提取物提取量的影響;采用最佳體積分?jǐn)?shù)乙醇,最佳超聲時(shí)間,液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g,提取3次,考察不同液料比對(duì)對(duì)沙棘果乙醇提取物提取量的影響。

1.2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)篩選,本實(shí)驗(yàn)主要考察乙醇濃度(%)、超聲時(shí)間(min)、液料比三個(gè)因素對(duì)多酚提取量的影響,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。使用Design-Expert 8.0.6軟件,采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)分析方法進(jìn)行工藝優(yōu)化,水平取值用0、±1、±α代碼表示,實(shí)驗(yàn)時(shí)再轉(zhuǎn)化為實(shí)際操作值。三因素的星點(diǎn)設(shè)計(jì)α=1.732,因素水平見(jiàn)表1,綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)和液料比(C)為自變量,多酚提取量為因變量,進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels used in CCD-RSM

1.2.5 沙棘果多酚抗AD作用考察

1.2.5.1 沙棘果多酚純化 按照前文優(yōu)化的最佳條件制備粗提液,取層析柱,加入400 g經(jīng)乙醇活化的AB-8大孔吸附樹(shù)脂,保證柱內(nèi)無(wú)氣泡并用蒸餾水水沖至柱內(nèi)無(wú)乙醇,取25 mL粗提液,緩慢倒入層析柱中,蒸餾水洗脫后,以60%的乙醇洗脫,分別收集洗脫液,減壓(0.95 MPa)濃縮至約為原體積的五分之一,經(jīng)冷凍干燥得多酚提取物[15]。

1.2.5.2 動(dòng)物分組及給藥 小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)條件下(室溫23±1 ℃),濕度40%～60%,光照/暗循環(huán)12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性組、SBP高、中、低劑量組,每組10只。常規(guī)飼養(yǎng),進(jìn)食前除空白組小鼠外各組腹腔注射D-半乳糖120 mg·kg-1·d-1(生理鹽水配制)和灌胃AlCl320 mg·kg-1·d-1(雙蒸水配制)造模[16],空白組注射等量生理鹽水和灌胃等量雙蒸水,連續(xù)60 d。造模同時(shí)給藥,陽(yáng)性組灌胃給予奧拉西坦260 mg·kg-1·d-1[17]，模型組和空白組灌胃給予等量雙蒸水[18]按生藥材劑量灌胃給藥,高劑量組1.214 g·kg-1·d-1,中劑量組0.607 g·kg-1·d-1,低劑量組0.303 g·kg-1·d-1,每天1次。

1.2.5.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行試驗(yàn)和對(duì)位空間探索實(shí)驗(yàn)[19]。定位航行試驗(yàn):主要評(píng)價(jià)小鼠的學(xué)習(xí)能力,給藥后第55 d開(kāi)始進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn),在第一象限放置隱蔽平臺(tái),選任一位置將小鼠面向池壁放入水池,記錄小鼠從入水至爬上隱蔽平臺(tái)所需的時(shí)間,即為逃避潛伏期。如1 min內(nèi)小鼠未找到隱蔽平臺(tái),則將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)并停留10 s,并將逃避潛伏期記錄為1 min。每天訓(xùn)練4次,連續(xù)訓(xùn)練5 d,每天固定時(shí)間段訓(xùn)練。對(duì)位空間探索實(shí)驗(yàn):主要評(píng)價(jià)小鼠的記憶能力。給藥60 d后進(jìn)行對(duì)位空間探索實(shí)驗(yàn),即將隱蔽平臺(tái)撤掉,在原放置平臺(tái)的對(duì)位象限處放入小鼠,記錄小鼠首次進(jìn)入原平臺(tái)位置的時(shí)間,即探索潛伏期,并記錄1 min內(nèi)大鼠進(jìn)入原平臺(tái)區(qū)的次數(shù),即探索次數(shù)[20]。

1.2.5.4 小鼠大腦生化指標(biāo)測(cè)定 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,禁食24 h,脫頸處死,取小鼠大腦,加入9倍預(yù)冷的生理鹽水勻漿,4 ℃下12000 r/min離心20 min,取上清液,嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定各組動(dòng)物大腦中乙酰膽堿(Ach)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)及乙酰膽堿酯酶(AchE)含量。

1.2.5.5 組織病理切片 取小鼠全腦,用10%甲醛PBS緩沖溶液(0.1 mol/mL)浸泡48 h固定,石蠟包埋,HE染色,使用二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。100倍顯微鏡鏡檢,圖像采集分析,觀察海馬結(jié)構(gòu)病理變化[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)“1.2.2”項(xiàng)下方法,以質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo),以吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為Y=0.2133X-0.0513(R2=0.9967),表明沒(méi)食子酸在0.5～2.5 mg/mL呈良好線性關(guān)系,可用于多酚含量計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 乙醇濃度對(duì)沙棘果多酚提取量的影響Fig.2 Effects of ethanol concentrationon the contents of SBP

乙醇濃度對(duì)沙棘果多酚提取量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2,由圖2可知,多酚提取量隨乙醇濃度增加呈先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)提取量最高?？赡芤?yàn)镾BP結(jié)構(gòu)復(fù)雜,極性跨度較大,溶劑的極性對(duì)多酚提取量有較大影響[22]。超聲時(shí)間對(duì)沙棘果多酚提取量的影響如圖3所示,當(dāng)超聲時(shí)間為10～50 min時(shí),多酚提取量隨超聲時(shí)間增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí),多酚提取量最高,這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致多酚類物質(zhì)發(fā)生分解,聚合等副反應(yīng)[23]。液料比對(duì)沙棘果多酚提取量的影響如圖4所示,隨液料比增加多酚提取量先增加后減少,當(dāng)液料比為20∶1時(shí)提取量最高,可能是液料比達(dá)到20∶1 mL/g時(shí),溶劑對(duì)多酚的溶解基本達(dá)到飽和。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)沙棘果多酚提取量的影響Fig.3 Effects of extraction time on the contents of SBP

圖4 料液比對(duì)沙棘果多酚提取量的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratioon the contents of SBP

2.3 多元二次回歸模型的建立

表2 CCD-RSM設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of CCD-RSM

表3 回歸方程的方差分析表Table 3 Variance analysis of binomial fitting

注：**表示極顯著差異(P<0.001),*表示顯著性差異(P<0.05)。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè)

效應(yīng)面圖是在各因素交互作用下得到的結(jié)果,根據(jù)二次多項(xiàng)式模型固定三個(gè)變量中的任意變量,其值取中值,繪制歸一值與令兩個(gè)變量之間的3D效應(yīng)曲面圖，結(jié)果見(jiàn)圖5,從效應(yīng)面圖可以判斷最佳點(diǎn)均落在試驗(yàn)考察區(qū)域內(nèi),根據(jù)曲面的傾斜度以及顏色變化可知超聲時(shí)間與乙醇濃度兩因素對(duì)響應(yīng)值影響最大,根據(jù)等高線的疏密程度以及形狀可知超聲時(shí)間和乙醇濃度兩因素交互作用最大,根據(jù)所得模型確定最佳工藝條件為乙醇濃度71.23%,超聲時(shí)間31.54 min,液料比20.26∶1 mL/g,在此優(yōu)化條件下多酚提取量為3.1047 mg/g。

圖5 各因素交互作用對(duì)多酚提取量影響的效應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on polyphenal yield

表4 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Positioning navigation test results

注：與模型組比較,*差異顯著P<0.05,**差異極顯著P<0.01;與空白組比較,#差異顯著P<0.05,##差異極顯著P<0.01;表6～表7同。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)合優(yōu)化結(jié)果和實(shí)際操作,選擇乙醇濃度71%、液料比20∶1 mL/g、提取時(shí)間32 min為最佳條件,按上述條件進(jìn)行3組平行試驗(yàn),提取量均值為3.0813 mg/g,RSD=1.65%,表明該提取工藝穩(wěn)定重現(xiàn)性好。

2.6 沙棘果多酚抗AD活性

2.6.1 沙棘果多酚的純化 取純化后所得多酚提取物,按“1.2.2”項(xiàng)下進(jìn)行多酚含量測(cè)定,多酚含量可達(dá)58.3%。

2.6.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.6.2.1 定位航行試驗(yàn) 如表4所示,與空白組比較,第54、57～60 d模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05),說(shuō)明模型組小鼠學(xué)習(xí)能力減弱,表明造模成功;與模型組相比,第57 d,陽(yáng)性組和SBP高劑量組小鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05);第59 d,陽(yáng)性組和SBP高劑量組小鼠逃避潛伏期極顯著縮短(P<0.01),SBP中劑量組和SBP低劑量組逃避潛伏期有所縮短,無(wú)顯著性差異,SBP對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)能力有改善作用,高劑量組活性最好。

2.6.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 如表5所示,與空白組比較,模型組小鼠探索潛伏期顯著縮短,探索次數(shù)顯著減少(P<0.05);說(shuō)明模型組小鼠記憶能力減弱出現(xiàn)記憶障礙,表明造模成功,與模型組相比,陽(yáng)性藥組、SBP高劑量組和SBP中劑量組小鼠探索潛伏期顯著延長(zhǎng),探索次數(shù)顯著增加(P<0.05);SBP低劑量組小鼠探索潛伏期有所延長(zhǎng),探索次數(shù)有所增加,無(wú)顯著性差異,SBP對(duì)小鼠記憶能力有很好的改善作用,其中高劑量和中劑量組活性較好。

表6 各組小鼠腦內(nèi)Ach、AchE和ChAT含量Table 6 Contents of Ach,AchE and ChAT in brain of rats in each group

表5 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Space exploration experiment results

2.6.3 小鼠腦內(nèi)Ach、AchE和ChAT含量的測(cè)定 如表6所示,與空白組比較,模型組小鼠腦中Ach和ChAT含量極顯著降低,AchE含量極顯著升高(P<0.01),說(shuō)明小鼠膽堿能系統(tǒng)功能紊亂,表明造模成功;與模型組比較,陽(yáng)性組小鼠腦內(nèi)Ach和ChAT含量極顯著性升高,AchE含量極顯著性降低(P<0.01);SBP高劑量組Ach含量極顯著升高,AchE含量極顯著降低(P<0.01),ChAT含量顯著升高(P<0.05);SBP中劑量組小鼠腦內(nèi)AchE含量顯著性降低,ChAT含量顯著性升高(P<0.05);SBP低劑量組Ach和ChAT含量有所升高、AchE含量有所降低,無(wú)顯著性差異,SBP對(duì)膽堿能系統(tǒng)具有很好的調(diào)節(jié)作用,高劑量組活性較好。

2.7 病理觀察

由圖6可知,空白組和陽(yáng)性藥物組海馬神經(jīng)元排列緊密,數(shù)量較多,形態(tài)完整,染色正常,未出現(xiàn)壞死;模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞明顯稀疏,出現(xiàn)大面積壞死,著色較深;SBP高劑量組海馬神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則,無(wú)明顯病變;SBP中劑量組海馬細(xì)胞少量損傷和凋亡,細(xì)胞排列較整齊,著色較深;SBP低劑量組海馬細(xì)胞出現(xiàn)一定程度的損傷或凋亡,結(jié)果表明SBP能抑制小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡,其中高劑量組活性最佳。

圖6 小鼠海馬HE病理變化情況Fig.6 HE staining pathologic changes of mice hippocampus

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化得到SBP最佳提取工藝為乙醇濃度71%,超聲時(shí)間32 min,液料比20∶1 mL/g,多酚提取量為3.0813 mg/g,高于已報(bào)到SBP提取量1.8%[24]。Ach是主要的神經(jīng)遞質(zhì),在周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有重要作用,其能刺激膽堿能功能已被證明[25],ChAT參與Ach的合成過(guò)程,AchE參與Ach的水解過(guò)程。當(dāng)腦內(nèi)Ach含量不足時(shí)會(huì)導(dǎo)致膽堿能系統(tǒng)障礙造成學(xué)習(xí)記憶障礙[26]。本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁誘發(fā)AD動(dòng)物模型,探究SBP對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用,水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SBP能夠改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,可能與其對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及對(duì)膽堿能系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用有關(guān)[27-28]。長(zhǎng)期大量的D-半乳糖和三氯化鋁的攝入會(huì)導(dǎo)致膽堿能系統(tǒng)紊亂和海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷[29],SBP對(duì)AD動(dòng)物模型引起的Ach和ChAT含量降低及AchE含量上升有良好的調(diào)節(jié)作用,SBP能通過(guò)調(diào)節(jié)ChAT和AchE水平影響Ach的合成與水解,恢復(fù)膽堿能系統(tǒng)生理功能;病理觀察結(jié)果表明SBP能抑制小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡;SBP可通過(guò)調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)和保護(hù)海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮抗AD活性,其具體機(jī)制尚不明確,可以繼續(xù)通過(guò)深入的結(jié)構(gòu)特征、藥理機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系等研究加以證實(shí)。