,2,*

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,貴州遵義 563000;2.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室,貴州遵義 563000)

鳳岡鋅硒茶產(chǎn)自貴州省鳳岡縣,為典型的富鋅富硒茶。有學(xué)者測定了鳳岡縣田壩仙人嶺公司的幾個茶場中鳳岡鋅硒茶茶葉鋅的含量,鋅含量最高為82.84 mg/kg,最低為25.66 mg/kg[1]。近年來針對鳳岡鋅硒茶的生物活性開展了許多研究,研究發(fā)現(xiàn)鳳岡鋅硒茶能明顯增加衰老模型小鼠血清Trx(硫氧化還原蛋白)含量,具有延緩衰老的作用[2]。此外還有降脂、肝損傷保護、抑制腫瘤細胞生長等作用[3-5],以上研究多是從疾病模型入手,而茶作為我國的一種常用飲品,多在機體正常時候飲用,通過整體調(diào)節(jié)發(fā)揮效應(yīng),然而目前關(guān)于鳳岡鋅硒茶對正常機體的整體代謝調(diào)節(jié)作用的研究有限。

代謝組學(xué)是研究生物體在受到外源性刺激后,其內(nèi)源性代謝物種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)[6]。其整體性的優(yōu)勢和特點,為復(fù)雜物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究提供了新的手段,同時還可通過借鑒國際通行的醫(yī)藥標準研究規(guī)范來研究生命體的規(guī)律,從而去認識疾病的本質(zhì)以及闡明藥品食品等的功效、作用機理等[7]。近年來,許多學(xué)者基于代謝組學(xué)對茶做出了大量的研究。如劉建等[8]基于1H-NMR的代謝組學(xué)技術(shù)探討了普洱茶茶褐素對高脂大鼠的降血脂機制,篩選出纈氨酸等6種標志代謝物,揭示其機制可能與氨基酸代謝、能量代謝等代謝途徑有關(guān),而Xiang等[9]基于代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)藤茶可通過Akt信號通路改善2型糖尿病大鼠的葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂。

氣質(zhì)聯(lián)用(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)在化學(xué)、生物和環(huán)境分析中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用,因其具有高效、可重復(fù)性、高靈敏度和代謝物易鑒定等技術(shù)優(yōu)勢,常作為代謝組學(xué)研究的可靠平臺[10-12]。因此本研究基于GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)篩選出鳳岡鋅硒茶影響大鼠機體代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵代謝物,進一步通過通路富集分析揭示鳳岡鋅硒茶影響大鼠機體代謝調(diào)節(jié)的通路,從而初步揭示鳳岡鋅硒茶影響大鼠機體代謝調(diào)節(jié)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD大鼠 SPF級,雄性,體重180～220 g,共36只,合格證號為:SCXK(渝)2012-0005,第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心;鳳岡鋅硒茶 貴州省鳳岡縣萬壺緣鋅硒茶業(yè)有限公司;十七碳酸、甲醇、甲氧胺鹽酸鹽 阿拉丁生化科技股份有限公司;吡啶 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA) 西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;三甲基氯硅烷(TMCS) 上海晶純生化科技股份有限公司;正庚烷 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;肝素鈉 北京索萊寶科技有限公司;總超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)檢測試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所。

SG3300HE超聲儀 上海冠特超聲儀器有限公司;TGL16M臺式高速冷凍離心機 長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司;DN-36A氮吹儀 上海喬楓事業(yè)有限公司;XW-80A渦旋混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;ISQ-Trace1300氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技公司;BX43+DP2b奧林巴斯光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 給茶樣本的制備 稱取鳳岡鋅硒茶200 g,剪碎,加入10倍量水,煎煮10 min,重復(fù)三次,過濾,合并濾液,減壓濃縮至濃度為1 g/mL,2000 r/min離心10 min,0.22 μm微孔過濾后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實驗分組及給茶處理 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,隨機分成3組,每組12只,其中對照組口服灌胃一蒸水(10 mL/kg/d);高劑量組口服灌胃鳳岡鋅硒茶,劑量為(1 g/kg/d);低劑量組口服灌胃鳳岡鋅硒茶,劑量為(0.5 g/kg/d)。各組均于每天下午四點給茶,連續(xù)6周,然后停止給茶,繼續(xù)飼養(yǎng)3周。

分別在給茶前、給茶后的2、4和6周眼眶取血,于4 ℃冰箱靜置30 min,隨后低溫離心10 min(4000 r/min),取離心后的血漿上清液于-20 ℃冰箱中保存待用。大鼠停茶并繼續(xù)飼養(yǎng)3周后處死,解剖,肝臟灌注,于冰上取出肝臟,用預(yù)制冷的生理鹽水洗凈,用濾紙吸干表面水分,在電子天平上稱重,稱重后順沿著肝小葉邊緣切取兩塊肝小葉分別放入10%的甲醛固定液中,剩余的肝臟組織放到凍存管中于-80 ℃的冰箱中保存待用。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 肝臟形態(tài)學(xué)變化 取大鼠肝臟進行HE染色,觀察大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化,如有無病變、細胞核大小有無變化等。

1.2.3.2 血漿氧化酶應(yīng)激狀態(tài) 取血漿,采用試劑盒檢測大鼠血漿中SOD活性和MDA含量。

1.2.4 代謝組學(xué)分析

表1 大鼠血漿中SOD和MDA水平的變化(n=12,Mean±SD)Table 1 Change in SOD and MDA levels in plasma of rats(n=12,Mean±SD)

注：*表示P<0.05水平下差異顯著，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2.4.1 血漿樣品預(yù)處理 取給茶后4周的大鼠血漿樣品4 ℃解凍,4 ℃離心10 min(3000 r/min),取100 μL上清液,加內(nèi)標(1 mg/mL十七碳酸)10 μL,加900 μL 4 ℃預(yù)冷的混合液(甲醇∶水=8∶1，V/V),渦旋混勻1 min,冰水浴超聲10 min,4 ℃離心15 min(12000 r/min),取上清液200 μL,N2吹干,加30 μL 15 mg/mL甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液,70 ℃肟化1 h,再加入30 μL BSTFA(含1%的TMCS),70 ℃衍生化1 h。加90 μL正庚烷,渦旋混勻,4 ℃離心10 min(12000 r/min),取上清100 μL進樣分析。

1.2.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜進樣分析條件 色譜條件:Agilent DB-5ms石英毛細柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。升溫程序:初始溫度70 ℃,保持4 min,以速度為6 ℃/min增加到280 ℃,保持20 min。載氣:氦氣;載氣流速:1 mL/min;進樣量:1 μL;分流模式進樣(3∶1)。

質(zhì)譜條件:離子源溫度:230 ℃;質(zhì)量分析器溫度150 ℃;進樣口溫度:280 ℃;離子源:EI,電子能量70 eV,全掃描35～600 m/z;溶劑延遲:5 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Mean±SD進行表示,多組比較采用方差分析,兩兩比較采用t檢驗,P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采用Xcalibur軟件將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為cdf格式,進一步采用R軟件和Excel對數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)提取、峰匹配、數(shù)據(jù)對齊及數(shù)據(jù)歸一化。通過SIMCA-P14.1軟件對數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析,在經(jīng)過無監(jiān)督的PCA模型剔除異常值后,進一步構(gòu)建OPLS-DA模型篩選出VIP>1和P<0.05的差異代謝物,最后通過結(jié)合KEGG、Metaboanalyst分析出相應(yīng)的代謝通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織形態(tài)學(xué)變化觀察

圖1為大鼠肝臟組織的病理HE切片圖,可以明顯看出鳳岡鋅硒茶高、低劑量組,與對照組的肝臟組織的形態(tài)學(xué)并無明顯病理變化。

圖1 大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)(×400)Fig.1 Morphological observation ofliver pathology in rats(×400)注:A:對照組;B:鳳岡鋅硒茶低劑量組;C:鳳岡鋅硒茶高劑量組。

2.2 血漿氧化酶應(yīng)激狀態(tài)結(jié)果

給茶后4周鳳岡鋅硒茶高、低劑量組的MDA含量和對照組相比顯著下降(P<0.05),SOD活性各組間無顯著差異。

2.3 代謝組學(xué)分析

2.3.1 GC-MS代謝組學(xué)分析 將各組大鼠血漿樣品前處理后進行GC-MS分析,得到總離子流圖,如圖2所示,共鑒定出26個代謝物。

圖2 對照組血漿樣品的典型總離子流圖Fig.2 Typical TIC chromatograms ofplasma samples from control groups

2.3.2 多元統(tǒng)計分析

2.3.2.1 PCA分析 采用SIMCA-P 14.1對樣本數(shù)據(jù)進行PCA分析,如圖3所示,對照組與給茶組分離不明顯,雖然給茶后有變化,但變化不明顯。

圖3 對照組與給茶組大鼠血漿樣品的PCA得分圖Fig.3 PCA scores of plasma samples ofrats form control and tea groups 注:A空白組與給茶高劑量組比較;B表示空白組與給茶低劑量組比較。

2.3.2.2 OPLS-DA分析 為了更好的觀察飲用鳳岡鋅硒茶對血漿代謝物的影響,本研究進一步通過構(gòu)建OPLS-DA模型,如圖4所示,模型的R2均大于0.5,如表2所示,說明模型的擬合準確性好。進一步對OPLS-DA模型進行200次置換驗證,如圖5所示,置換驗證的R2與Q2均小于表2中模型的原始值,且Q2<0。說明構(gòu)建的OPLS-DA模型穩(wěn)健。在模型未過擬合的基礎(chǔ)上,可以看出對照組與高、低劑量組的代謝輪廓存在一定的差異。

圖4 對照組與給茶組大鼠血漿樣品的OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA scores of plasma samples onrats of control and tea groups 注:A空白組與給茶高劑量組比較;B表示空白組與給茶低劑量組比較。

圖5 OPLS-DA模型置換驗證Fig.5 Permutation test of the OPLS-DA model注:A表示空白組與給茶高劑量組比較的置換驗證(R2=0.805,Q2=-0.423);B表示空白組與給茶低劑量組大鼠比較的置換驗證(R2=0.906,Q2=-0.443)。

表2 OPLS-DA模型的R2Y與Q2值Table 2 R2Y and Q2 values of the OPLS-DA model

2.3.3 差異代謝物的篩選 結(jié)合NIST標準庫對總離子流圖中的離子進行代謝物鑒定,共鑒定出匹配度≥80的代謝物25種,如表3所示。進一步通過SIMCA-P14.1進行分析,以變量重要性投影(VIP)>1及P<0.05,篩選出鳳岡鋅硒茶調(diào)節(jié)大鼠血漿的五種差異代謝物,分別為丁酸、L-脯氨酸、琥珀酸、肌醇、硬脂酸。同時得到五種差異代謝物在各組中的相對含量。如圖6所示,其中給茶高劑量組中的L-脯氨酸,肌醇,琥珀酸的含量較對照組明顯下降(P<0.05),丁酸、硬脂酸的含量明顯升高(P<0.05),低劑量組僅升高了丁酸的含量(P<0.05)。

表3 大鼠血漿樣品GC-MS分析的代謝物鑒定結(jié)果Table 3 The results of metabolite identification ofGC-MS analysis of rat plasma samples

續(xù)表

圖6 大鼠血漿樣本中五種差異代謝物的相對含量Fig.6 Relative content of five differential metabolites in rat plasma samples注:*表示差異顯著P<0.05,**表示差異極顯著P<0.01,與對照組比較。A～E分別表示L-脯氨酸、丁酸、琥珀酸、肌醇和硬脂酸。

2.3.4 代謝通路分析 對篩選出的5種差異代謝物經(jīng)metaboanalyst通路富集分析,結(jié)果如圖7所示,其中磷酸肌醇代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、三羧酸循環(huán)的impact值大于0.02,提示鳳岡鋅硒茶影響大鼠機體代謝調(diào)節(jié)的作用機制與磷酸肌醇代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、三羧酸循環(huán)密切相關(guān)。

圖7 通路富集分析Fig.7 Path enrichment analysis注:A:磷酸肌醇代謝;B:精氨酸和脯氨酸代謝;C:三羧酸循環(huán)。

圖8 鳳岡鋅硒茶影響大鼠機體代謝的代謝途徑網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)Fig.8 Structure of metabolism pathway networksaffecting rat body metabolism by Fenggang Zinc-Selenium Tea

3 討論

鳳岡鋅硒茶茶葉中鋅硒含量豐富,其中硒通常以硒代替胱氨酸的形式存在于氧化酶中,參與清除由人體內(nèi)部新陳代謝產(chǎn)生的自由基。SOD是超氧化自由基的特異性清除酶,它能保護細胞免遭有氧代謝反應(yīng)中產(chǎn)生的超氧離子的損傷,從而對機體起保護作用。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和脂質(zhì)代謝產(chǎn)物之,當(dāng)機體內(nèi)MDA升高,SOD降低時,提示肝臟可能受到損傷[13-16]。本實驗得到的結(jié)果顯示給茶后4周鳳岡鋅硒茶高、低劑量組的MDA含量較對照組顯著降低,而對照組SOD活性與鳳岡鋅硒茶高、低劑量組相比無明顯變化,說明鳳岡鋅硒茶有一定的抗氧化作用,進一步表明飲茶后這種作用可能對肝臟具有一定的保護作用。這與文獻報道的紅茶對高脂飲食小鼠肝臟具有保護作用及綠茶提取物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷具有護作用一致[17-18],同時在病理形態(tài)學(xué)方面發(fā)現(xiàn),飲茶對肝臟無明顯損傷發(fā)現(xiàn),也進一步證明了其具有良好的安全性。

在給茶后4周的大鼠血漿中的MDA含量發(fā)生變化后,本研究對此時間點的血漿樣品進行代謝組學(xué)分析,經(jīng)OPLS-DA分析,發(fā)現(xiàn)給茶后,大鼠血漿代謝輪廓發(fā)生了顯著變化,并篩選出鳳岡鋅硒茶影響機體的五個差異代謝物,包括丁酸、L-脯氨酸、琥珀酸、肌醇、硬脂酸,涉及到機體的磷酸肌醇代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、三羧酸循環(huán),提示鳳岡鋅硒茶可能通過以上代謝物及途徑發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用,為了更清晰的表征本作用,本研究整合上述差異代謝物及其關(guān)聯(lián)的代謝通路,從網(wǎng)絡(luò)角度揭示鳳岡鋅硒茶對大鼠機體的綜合調(diào)節(jié)機制,如圖8所示。

肌醇是人體細胞生長的一種必需物質(zhì),具有促進組織中脂肪代謝、降低血脂、參與體內(nèi)新陳活動、促進細胞生長等[19-20]。有文獻報道的衰老模型大鼠中肌醇含量出現(xiàn)升高,在給予瓊玉膏干預(yù)后降低了衰老模型大鼠中升高的肌醇[21],本研究結(jié)果顯示在給予大鼠鳳岡鋅硒茶后體內(nèi)肌醇含量較對照組顯著下降(P<0.05),肌醇含量的下降可能是鳳岡鋅硒茶作用后使其參與了抑制過氧化產(chǎn)物MDA的增加,這與文獻報道肌醇具有抑制脂質(zhì)過氧化,降低MDA含量一致[22]。肌醇還可參與下游通路脂肪酸生物合成、丁酸代謝等,進一步分析網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),下游通路脂肪酸生物合成、丁酸代謝中硬脂酸和丁酸含量顯著升高,進一步印證了鳳岡鋅硒茶可能通過調(diào)節(jié)磷酸肌醇代謝中肌醇參與下游通路丁酸代謝,從而使大鼠機體內(nèi)丁酸含量升高,促進大鼠機體的新陳代謝。此外體內(nèi)丁酸含量升高會抑制腸腔腸上皮細胞增殖,并促進其凋亡,從而達到新陳代謝的目的[23-24],提示鳳岡鋅硒茶可能具有改善腸道菌群的作用。硬脂酸為長鏈脂肪酸,其具有一定的抗炎癥和抗氧化應(yīng)激作用,適量攝入可減輕膽汁阻塞引起的肝損傷[25-26],研究發(fā)現(xiàn)給茶后機體內(nèi)硬脂酸含量升高,揭示鳳岡鋅硒茶通過影響脂肪酸代謝使硬脂酸參與抑制過氧化物MDA的增加。脯氨酸在機體應(yīng)激狀態(tài)脅迫下會升高[27],喝茶可能使機體處于更穩(wěn)定狀態(tài),所以使得脯氨酸含量降低,從側(cè)面來講鳳岡鋅硒茶增強了機體的抗應(yīng)激能力。琥珀酸是TCA的代謝產(chǎn)物,琥珀酸脫氫酶活性降低及基因突變可引起琥珀酸含量升高,促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展[28-29],本研究發(fā)現(xiàn)鳳岡鋅硒茶可降低血漿中琥珀酸的含量,提示鳳岡鋅硒茶可能具有一定的防癌作用。

4 結(jié)論

基于GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)研究鳳岡鋅硒茶對正常大鼠的整體代謝規(guī)律,篩選出了差異代謝物丁酸、L-脯氨酸、琥珀酸、肌醇和硬脂酸,初步揭示了鳳岡鋅硒茶通過磷酸肌醇代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、三羧酸循環(huán)等代謝途徑影響大鼠機體代謝。為今后鳳岡鋅硒茶的進一步研究提供了一定的理論依據(jù),此外還對鳳岡鋅硒茶新產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。但本文屬于非靶向代謝組學(xué)研究,研究得到的差異代謝物仍需進一步驗證。