胡金雙,黃燕燕,陳思敏,鄺嘉華,趙 珊,彭 鑫,劉冬梅

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640)

亞硝酸鹽(nitrites,NIT)作為一種含氮化合物,是氮循環(huán)中一種重要的反應物和產物,在自然界中廣泛存在,同時也是人體中硝酸鹽循環(huán)中重要的一環(huán)。通過膳食攝入的亞硝酸鹽會在人體內發(fā)生N-亞硝化作用,生成具有致癌性的N-亞硝基化合物,因此將食品中的亞硝酸鹽控制在安全限量內是國內外研究的熱點之一。有研究證實通過反硝化作用降解亞硝酸鹽是當前解決這一問題的有效方法[1]。反硝化是通過硝酸鹽還原酶(nitrate reductase)、亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase,NiR)、一氧化氮還原酶(nitric oxide reductase)和一氧化二氮還原酶(nitrous oxide reductase)等的作用將亞硝酸鹽降解。異化過程所需的亞硝酸鹽還原酶能夠將NIT還原成NO,是反硝化過程最重要的一步[2]。

表1 生物信息學分析工具及網(wǎng)址Table 1 Tools and web servers for analysis of bioinformatics

目前已被證實具有降解NIT能力的微生物包括蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusLJ01[3]、植物乳桿菌LactobacillusplantarumDMDL 9010[4]、干酪乳桿菌LactobacilluscaseiLCR 6013[5]、戊糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌[6]、鼠李糖乳桿菌[7]、乳酸糞鏈球菌、啤酒片球菌、腸膜明串球菌、短乳桿菌等[8],但其NiR含量普遍較低。并且,經天然產物純化得到NiR的工序繁雜,不可避免地造成蛋白質損失,使回收率降低。大多數(shù)研究者都無法直接從破碎天然菌體后的粗酶液中提取大量的天然NiR,如Nurizzo等[9]、Vigara等[10]、Inatomi等[11]和Preuss等[12]分別從Haloarculamarismortui、Monoraphidiumbraunii、Haloferaxdenitrificans和Rhodopseudomonaspalustris1a1粗酶液中純化得到了很少量的NiR。因此,采用基因工程手段對蛋白酶基因進行改良和克隆表達,開發(fā)高產量、高純度、高活力的蛋白酶資源成為研究的熱點[13]。

大腸桿菌是第一個用于生產重組蛋白質的宿主菌,它具有成本較低、繁殖速度快、操作和培養(yǎng)方法簡單及其分子遺傳學背景清楚等優(yōu)點,因此大腸桿菌已發(fā)展成為基因工程研究中應用最為廣泛和研究最為深入的表達系統(tǒng),幾乎所有已成功克隆的蛋白酶基因都在大腸桿菌表達系統(tǒng)中獲得表達產物[14-15]。Volkov等[16]克隆了酵母細胞色素過氧化物酶的基因,并在大腸桿菌表達系統(tǒng)實現(xiàn)了高提取率的重組酶,在1 L的大腸桿菌培養(yǎng)物獲得了30～60 mg的重組產物,純度高達96%～99%。Wang等[17]利用基因工程技術克隆了植物乳桿菌DMDL9010中編碼NiR的基因,并研究了重組NiR的性質。

本課題組的前期研究[3]發(fā)現(xiàn),蠟樣芽孢桿菌B.cereusLJ01的粗酶液經陰離子交換層析(DEAE Sepharose Fast Flow)和分子篩層析(Sephadex G-150)純化后,NiR的提取率僅為2.37%。為了更好地研究B.cereusLJ01中NiR的酶學性質,提高NiR的提取率,本研究對B.cereusLJ01中NiR基因進行生物信息學分析,并利用克隆表達技術,將B.cereusLJ01中NiR序列分別插入到載體質粒pET-28a(+)和pET-32a(+)上,將獲得的重組質粒pET-28a(+)-nir和pET-32a(+)-nir分別轉入原核表達菌株EscherichiacoliBL21(DE3)中,實現(xiàn)NiR基因的異源表達,并在不同誘導溫度下比較兩種重組菌的NiR表達水平,選擇NiR表達量高的做為基因工程菌菌株,為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟樣芽孢桿菌LJ01(BacilluscereusLJ01) 本課題組從豆瓣醬中篩選得到,已于2014年6月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,簡稱CGMCC,保藏號CGMCC NO.9360;擴增菌株EscherichiacoliTop 10、克隆菌株EscherichiacoliBL21(DE3)及質粒載體pET-28a(+)和pET-32a(+) 本實驗室保存;限制性內切酶、Taq DNA聚合酶及PCR、克隆相關試劑和試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa);Bradford染料、柱式細菌DNAout試劑盒 北京天恩澤基因科技有限公司;LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)、卡那霉素(Kanamycin,Kan)等試劑 廣州市卯林試劑有限公司和健陽生物科技有限公司。

PCR擴增儀 MJ Research公司;DYY-6C型核酸電泳儀 北京市六一儀器廠;蛋白電泳儀 Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng) SynGene公司;超高壓細胞破碎儀 廣州聚能納米生物科技股份有限公司;高速冷凍離心機 Beckman Coulter公司;QL-208多用途旋轉搖床 海門市麒麟醫(yī)用儀器廠;Bioscreen全自動生長曲線分析儀 上海謂載商貿發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)NCBI中B.cereusLJ01中NiR編碼基因序列(登錄號為MG839504[18])。設計NiR擴增的上下游引物:上游引物5′-CCAGCTAGCATGAGTTATGAAAAAGTATG-3′;下游引物5′-TGGCTCGAGAGACGCTATTACTTC-3′,由廣州艾基生物技術有限公司合成引物。

1.2.2 NiR基因的生物信息學分析 利用生物信息學在線分析軟件對NiR編碼的蛋白信息進行預測與分析,見表1。

圖1 B. cereus LJ01中NiR的蛋白序列Fig.1 The protein sequence of NiR from B. cereus LJ01

1.2.3 基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21(DE3)和pET-32a(+)-nir-BL21(DE3)的構建 以B.cereusLJ01全基因組DNA為模板進行NiR的PCR擴增。反應條件為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性45 s,60 ℃退火45 s,68 ℃延伸2 min,共30個循環(huán),72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后,進行純化和回收。將純化回收的PCR擴增產物和質粒pET-28a(+)進行NdeI和XhoI雙酶切,PCR擴增產物和質粒pET-32a(+)進行BamHI和XhoI雙酶切。16 ℃連接3 h以上。將連接產物轉化至E.coliTopl0,單菌落PCR驗證成功后送至廣州艾基生物技術有限公司進行測序。將測序成功的質粒pET-28a(+)-nir和pET-32a(+)-nir各自轉入到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中,分別涂布在含有25 μg/mL Kan和100 μg/mL Amp的固體LB培養(yǎng)基平板上進行篩選。

1.2.4 不同誘導條件及不同質粒對NiR表達的影響 將基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21的單菌落分別接種到20 mL含25 μg/mL Kan、100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后,得到種子液。按2%(V/V)的接種量分別接種到400 mL含25 μg/mL Kan、100 μg/mL Amp LB培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6左右時加入IPTG(終濃度為0.1 mmol/L)。pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21,分別在16 ℃、180 r/min下震蕩培養(yǎng)22 h,25 ℃、180 r/min下震蕩培養(yǎng)16 h,37 ℃、180 r/min下震蕩培養(yǎng)4 h。

培養(yǎng)結束后收集菌體在6000 r/min下離心15 min,收集菌體沉淀,用無菌水洗滌兩次。向菌體沉淀中加入40 mL Ni-Buffer A溶液(溶液組成為20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl和7 mmol/Lβ-巰基乙醇)重懸。用超高壓細胞破碎儀在4 ℃、150 MPa下破碎菌體細胞4次。裂解液于4 ℃、12000 r/min離心50 min,用0.22 μm的濾膜過濾上清液,獲得粗酶液。進行Ni-NTA親和層析純化[19-20]后,用25、50、75、250、500 mmol/L的咪唑緩沖液進行洗脫,對各洗脫組分進行SDS-丙烯酰胺凝膠電泳,以誘導前樣品、裂解液上清、沉淀做對照。

1.2.5 NiR編碼基因對宿主細胞生長的影響 將活化后的B.cereusLJ01、E.coliBL21(DE3)、pET-28a(+)-nir-BL21菌液加入96孔板中,用Bioscreen全自動生長曲線分析儀測定不同時間的OD600值,溫度為37 ℃,時長為24 h,每隔1 h測定,繪制三種細菌的生長曲線,比較分析外源基因對于寄主菌E.coliBL21(DE3)生長的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復三次,用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 NiR基因的生物信息學分析結果

用DNAMAN軟件將B.cereusLJ01中NiR基因序列翻譯成蛋白質序列,如圖1所示。使用NCBI的ProtParam工具對NiR進行分析,得知蛋白質的氨基酸殘基數(shù)為540個,分子量為60383.88,理論等電點pI為5.47,原子組成為C2728H4245N717O803S14,原子總數(shù)為8507,消光系數(shù)為66155,不穩(wěn)定指數(shù)為32.19,脂肪族氨基酸指數(shù)為90.50,序列的N末端是甲硫氨酸,估計在大腸桿菌體內的半衰期大于10 h,酵母細胞的體外半衰期大于20 h,哺乳動物的網(wǎng)織紅細胞的體外半衰期為30 h。

在NPS網(wǎng)絡蛋白質序列分析網(wǎng)站中輸入B.cereusLJ01中NiR序列,使用SOPM方法對該NiR蛋白的二級結構進行分析,結果如表2所示?？梢酝茰yB.cereusLJ01的NiR蛋白二級結構中最主要的組成類型為α-螺旋和無規(guī)則卷曲,延伸鏈和β-轉角則散布于整個蛋白中。

表2 B. cereus LJ01中NiR蛋白二級結構組成類型Table 2 The types of secondary structure ofNiR protein from B. cereus LJ01

使用TMHMM在線分析軟件對其跨膜螺旋和信號肽進行分析,結果表明NiR不具有明顯的信號肽或跨膜結構,N端不存在信號肽和跨膜結構。使用在線分析軟件ExPASy的ProtScale程序預測其疏水性,結果表明該蛋白質中所有氨基酸的平均親水性分值大小為-0.229,為親水性蛋白。

在SWISS-MODEL蛋白質的三級結構在線預測服務系統(tǒng)上輸入B.cereusLJ01中NiR序列,選擇Model 1,其三級結構預測結果如圖2所示。預測該蛋白可能屬于“依賴于鐵氧化還原蛋白”的亞硝酸鹽還原酶NiRA。從圖2可知B.cereusLJ01的NiR蛋白的三級結構很可能主要是由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成,這與二級結構預測分析結果一致。

圖2 B. cereus LJ01的NiR蛋白三級結構預測Fig.2 Three dimensional structures prediction ofNiR from B. cereus LJ01

2.2 重組表達載體的菌落PCR鑒定結果

分別選取pET-28a(+)-nir-E.coliTop 10和pET-32a(+)-nir-E.coliTop 10的8個單菌落進行PCR驗證。其中pET-28a(+)-nir-E.coliTop 10得到大小約為1800 bp的單一條帶(含230 bp克隆位點),pET-32a(+)-nir-E.coliTop 10得到大小約為2300 bp的單一條帶(含700 bp克隆位點),與測序結果得到的NiR序列長度相吻合,說明NiR基因已成功插入到表達載體中,見圖3。

圖4 pET-28a(+)-nir-BL21在不同誘導溫度下目的蛋白的表達情況Fig.4 Protein expression levels of pET-28a(+)-nir-BL21 under the three induction temperatures注:M:蛋白Marker;bi:誘導前的菌體裂解液;s:裂解液離心后的上清液;p:裂解液離心后的沉淀;Ft:流穿組分;A:上樣后用Ni-Buffer A溶液清洗時的洗脫組分;25、50、75、250、500:用25、50、75、250、500 mmol/L咪唑緩沖液洗脫柱子時的洗脫組分;圖5同。

圖5 pET-32a(+)-nir-BL21在不同誘導溫度下目的蛋白的表達情況Fig.5 Protein expression levels of pET-32a(+)-nir-BL21 under the three induction temperatures

圖3 兩種不同表達載體的菌落PCR鑒定Fig.3 The colony PCR identification oftwo kinds of transformant注：M：DNA分子量標準Marker;1～8：pET-32a(+)-nir-E. coli Top 10的單菌落;9～16：pET-28a(+)-nir-E. coli Top 10的單菌落。

2.3 NiR在不同溫度和不同質粒下的表達結果分析

pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21在不同溫度下NiR表達情況如圖4、圖5所示。兩基因工程菌在16、25、37 ℃[21-23]誘導下,裂解液沉淀中均含有大量目的蛋白,說明重組NiR主要以難溶于緩沖液的包涵體形式表達。當外源基因在原核細胞(特別是E.coli)中表達時,由于表達速率較快,容易形成不溶性蛋白質顆粒,即包涵體。包涵體可改變大腸桿菌的光散射性質,使其在光學顯微鏡下的形態(tài)表現(xiàn)為不定形、卵圓形或圓形等[24]。

由圖4和圖5可以看出洗脫液中咪唑濃度為25、50、75和250 mmol/L時,洗脫組分中均含有重組NiR蛋白(箭頭所指處),且在250 mmol/L咪唑的洗脫組分中含量最高,75 mmol/L咪唑的洗脫組分次之,500 mmol/L咪唑的洗脫組分幾乎不含重組NiR蛋白。

比較分析兩重組菌在三個不同誘導條件下目的蛋白的表達情況。由圖4和圖5可知,NiR蛋白的表達量隨著誘導溫度的升高而減少,誘導溫度為16 ℃時重組NiR表達量最高。降低誘導溫度不僅可以降低蛋白質的表達速度,而且也可以降低無活性聚集體的形成速率和疏水性相互作用,有利于蛋白質的折疊和可溶性表達[25]。

同一誘導條件下,重組子pET-28a(+)-nir-BL21裂解液的上清中目的蛋白含量更多,說明與pET-32a(+)相比,pET-28a(+)質粒載體更有利于重組NiR蛋白的可溶性表達,有利于后續(xù)的分離純化操作,因此選用pET-28a(+)-nir-BL21作為基因工程菌供后繼研究。

2.4 NiR的編碼基因對宿主細胞生長的影響結果分析

E.coliBL21(DE3)和pET-28a(+)-nir-BL21的生長曲線如圖6所示,兩菌株在第24 h時的OD600值比較如圖7所示。進入對數(shù)生長期后,pET-28a(+)-nir-BL21的生長速率稍快于E.coliBL21(DE3),兩者同時在第5 h到達穩(wěn)定期。最終E.coliBL21(DE3)的OD600值穩(wěn)定于0.33左右,pET-28a(+)-nir-BL21的OD600值穩(wěn)定于0.37左右,具有顯著差異(P<0.05)?？傮w來說,pET-28a(+)-nir-BL21的生長活力高于E.coliBL21(DE3),推測向宿主菌E.coliBL21(DE3)導入重組質粒載體pET-28a(+)-nir后,可能對其生長具有一定的促進作用。

圖6 E. coli BL21(DE3)和pET-28a(+)-nir-BL21的生長曲線Fig.6 Growth curve of E. coli BL21(DE3)and pET-28a(+)-nir-BL21

圖7 E. coli BL21(DE3)和pET-28a(+)-nir-BL21在24 h時的OD600值Fig.7 OD600 values of E. coli BL21(DE3)and pET-28a(+)-nir-BL21 at the 24 h

3 結論

本文對B.cereusLJ01中NiR基因進行生物信息學分析,并利用克隆表達技術構建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21,通過比較不同誘導條件下兩種重組子的NiR表達水平,確定了pET-28a(+)-nir-BL21為開展后繼工作的基因工程菌株,誘導條件為16 ℃、180 r/min下震蕩培養(yǎng)22 h。對蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusLJ01的NiR基因進行克隆和異源表達,為進一步了解該NiR的理化性質及用于食品中NIT的控制提供基礎支撐,同時為B.cereusLJ01中NiR的構效與NIT降解能力的內在關聯(lián)等深入研究奠定基礎。