,*

(1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院,湖北武漢 430205;2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院,湖北武漢 430205)

板栗(CastanetsMollissimaBlume)為殼斗科栗屬堅(jiān)果類植物[1],在中國(guó)有幾千年的栽培歷史,且種植分布已達(dá)26個(gè)省。板栗作為我國(guó)傳統(tǒng)的農(nóng)副產(chǎn)品,年產(chǎn)量高達(dá)數(shù)百萬(wàn)噸,占世界板栗總產(chǎn)量的3/4[2]。據(jù)資料顯示[3],板栗中富含蛋白質(zhì)、多種維生素和礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素。在板栗工業(yè)化生產(chǎn)的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的板栗殼,總量約8.9～13.5萬(wàn)噸/年,板栗殼中富含具有抗氧化活性的多酚類物質(zhì),包括原花青素和鞣花單寧。作為副產(chǎn)物的板栗殼仍主要以燃燒、廢棄等方式處理,既不利于環(huán)保,又不利于其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值的充分利用。因此,研究板栗殼原花青素的生物活性,將其高值化利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

原花青素主要是由兒茶素或者其衍生物等黃烷醇單體以C-C鍵連接而成的多酚化合物[4]。多項(xiàng)研究表明板栗殼原花青素具有抗氧化、抗自由基、抗腫瘤以及抑菌殺菌等生理活性[5-6],但這些生理活性的強(qiáng)弱與原花青素的聚合度密切相關(guān)[7]。Du等[8]發(fā)現(xiàn),原花青素單體上羥基個(gè)數(shù)會(huì)影響抗氧化活性,當(dāng)聚合度的某些連接方式占據(jù)了羥基周圍的空間會(huì)降低抗氧化活性。Torres等[9]發(fā)現(xiàn)原花青素對(duì)氧自由基的清除能力在聚合度小于5時(shí)差別不明顯,但卻顯著高于六聚體。Wu等[10]研究發(fā)現(xiàn)蓮蓬原花青素不同低聚體的抗氧化活性有顯著差異,其抗氧化機(jī)制為通過(guò)形成加合物而清除羰基自由基。目前,對(duì)板栗殼原花青素的研究主要集中在提取工藝、抗氧化、穩(wěn)定性研究等方面,但對(duì)于板栗殼原花青素聚合度與功效關(guān)系的研究還很缺乏。

本研究采用不同極性溶劑萃取法得到不同聚合度的板栗殼原花青素[11],研究板栗殼原花青素聚合度與抗氧化性和抑菌活性之間的關(guān)系,采用高效液相色譜和高分辨質(zhì)譜對(duì)其活性最高的級(jí)分進(jìn)行組分分析,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用板栗殼資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生板栗 采自山東省祁蒙山;沒(méi)食子酸、兒茶素類化合物(沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯)、維生素C等 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;過(guò)硫酸鉀、鐵氰化鉀、氯化鐵、三氟乙酸、ABTS、DPPH自由基(2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基)等 國(guó)藥集團(tuán)公司;金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25904)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 43895)、沙門氏菌(SalmonellaATCC 13076) 由本實(shí)驗(yàn)室提供,LB培養(yǎng)基(牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂) 國(guó)藥基團(tuán)公司。

UV-1800紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海美諾達(dá)儀器有限公司;Tensor 27 FT-IR光譜儀(Bruker)、Agilent 1290高效液相儀 美國(guó)安捷倫科技公司;Thermo LTQ-Orbitrap XL高分辨質(zhì)譜 美國(guó)賽默飛世爾科技公司;HD-A層析圖譜采集分析儀、HD-3紫外檢測(cè)儀、HL-2S恒流泵、BSZ-100自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 板栗殼原花青素粗提物的制備 采用本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化得到的最佳提取工藝提取板栗殼中的原花青素[11],將板栗殼粉碎后按照1∶15 g/mL的料液比,采用70%乙醇水溶液在65 ℃條件下提取90 min后得板栗殼原花青素粗提取液,對(duì)其進(jìn)行真空抽濾,并在40 ℃下真空濃縮,得到粗提液,再經(jīng)冷凍干燥得到紅棕色的板栗殼粗提物,編號(hào)為F1,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 板栗殼原花青素的純化和分級(jí) 參考Saucier等[12]的方法稍作修改,由于AB-8大孔樹(shù)脂具有弱極性,對(duì)極性較低的低聚原花青素吸附效果較好,故采用AB-8大孔樹(shù)脂純化F1,將處理好的AB-8大孔樹(shù)脂濕法裝柱并平衡靜置12 h后,將板栗殼原花青素粗提液以1.0 mL/min的流速上柱,吸附裝柱,吸附平衡后,用高極性的蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)和極性較高且聚合度高的原花青素,用50%乙醇以1.0 mL/min的流速洗脫樣品,收集洗脫液,45 ℃真空濃縮,濃縮液與原樣品體積比約為1∶3,冷凍干燥得紅棕色的原花青素初級(jí)純化樣品,編號(hào)為F2。將F2配制為濃度為8～10 mg/mL的水溶液,用等體積石油醚萃取,收集水層,加入等體積二氯甲烷,靜置后收集水層,再加入等體積乙酸乙酯,靜置分層后得水層和乙酸乙酯層,收集乙酸乙酯層樣品和水層樣品,45 ℃真空濃縮,冷凍干燥,得到乙酸乙酯層淺紅色原花青素粉末,編號(hào)為F3,水層深紅棕色原花青素粉末,編號(hào)為F4,備用。

1.2.3 板栗殼原花青素純度和聚合度的測(cè)定 采用傳統(tǒng)香草醛法測(cè)定純度,改良香草醛法測(cè)定平均聚合度[13-14]。

1.2.3.1 原花青素質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 以甲醇為溶劑,配制1.0 mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液,移取標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用硫酸-香草醛比色法[13],將標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃度為30 g/L的香草醛-甲醇溶液和體積分?jǐn)?shù)為30%的硫酸-甲醇溶液按照1∶5∶5的比例混合,于30 ℃避光反應(yīng)15 min后測(cè)定500 nm處的吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:y=1.10648x+0.01277,R2=0.9994(x表示原花青素濃度mg/mL,y表示吸光度值)。

1.2.3.2 板栗殼原花青素純度的測(cè)定 將樣品F1～F4配制成一定濃度的樣品溶液,移取1 mL樣品溶液,采用硫酸-香草醛比色法,將測(cè)得吸光度值代入原花青素質(zhì)量濃度回歸方程。

板栗殼原花青素的純度(%)=(C0·V0/m)×100

式中:C0為原花青素質(zhì)量濃度,mg/mL;V0為樣品定容體積,mL;m為樣品質(zhì)量,mg。

1.2.3.3 原花青素物質(zhì)的量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 以冰乙酸為溶劑,配制濃度為0.05 mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液,移取標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25及0.30 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用硫酸-香草醛比色法[13],得到原花青素摩爾濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程:y=2.2267c-0.0112,R2=0.9996(c表示原花青素的摩爾濃度μmol/mL,y表示吸光度)。

1.2.3.4 板栗殼原花青素平均聚合度的測(cè)定 移取1 mL F1～F4的樣品溶液,采用硫酸-香草醛比色法[13],將吸光度值分別代入1.2.3.1和1.2.3.3回歸方程中得到原花青素質(zhì)量濃度和摩爾濃度。

原花青素的平均聚合度=(C0·V0)/(290×C1·V0)

式中:C1為原花青素質(zhì)量濃度,mg/mL;V0為樣品定容體積,mL;C2為原花青素摩爾濃度,μmol/mL。

1.2.4 板栗殼原花青素抗氧化活性分析

1.2.4.1 ABTS自由基清除率測(cè)定 參考Elmastas等[15]的方法,稍作修改。將7.4×10-3mol/L ABTS與2.6×10-6mol/L過(guò)硫酸鉀按體積比1∶1混合,避光放置12～16 h,溶液由藍(lán)色變?yōu)榫G色,用95%乙醇或無(wú)水乙醇稀釋混合液,使混合液在734 nm處的吸光值在0.7±0.02范圍內(nèi);再將混合液分別與濃度為5、15、25、35、45、55、65 μg/mL的F1-F4按體積比10∶1混合放入試管中,VC作為陽(yáng)性對(duì)照,室溫下反應(yīng)7～10 min,在734 nm處測(cè)吸光度值,A1為沒(méi)有加入樣品的吸光度值,AS為加入樣品的吸光度值。

ABTS自由基清除率(%)=(A1-AS)/AS×100

1.2.4.2 羥基自由基清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)[16-17],稱量13.5 mg的1,10-鄰菲羅琳和16.35 mg的七水硫酸亞鐵于100 mL容量瓶中,再加入0.05 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖溶液至刻度線,混合均勻,標(biāo)記為A溶液。用50%乙醇水溶液稀釋F1～F4和VC濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg/mL,VC作為陽(yáng)性對(duì)照。再加入1.76 mL的A溶液、0.2 mL的不同濃度樣品和40 μL的3% H2O2溶液,在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min,在510 nm處測(cè)吸光度值。AS表示加入樣品的吸光度值,A0表示沒(méi)有加入樣品的吸光度值,A1表示沒(méi)有加入樣品和H2O2的吸光度值。

羥基自由基清除率(%)=[(AS-A0)/(A1-A0)]×100

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)[17]稍作修改。于100 mL容量瓶中加入0.11 mg維生素B2、149 mg蛋氨酸和8.17 mg氯化硝基四唑氮藍(lán),用0.05 mol/L pH7.8的磷酸鹽緩沖溶液定容混勻,標(biāo)記為B溶液。將混合B溶液分別與濃度為25、50、150、250、500、750 μg/mL的F1～F4及VC按體積比3∶1混合,VC作為陽(yáng)性對(duì)照。常溫下光照15 min,在560 nm處測(cè)吸光度值。A0表示沒(méi)有加入樣品的吸光度值;AS表示加入樣品的吸光度值。

超氧陰離子自由基清除率(%)=(A0-AS)/A0×100

1.2.4.4 總還原能力測(cè)定 參考Siddhuraju和Zhu[16-17]等的方法。將1%鐵氰化鉀和0.2 mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液分別與濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 mg/mL的F1～F4按體積比1∶1∶1混合,VC作為陽(yáng)性對(duì)照,于50 ℃水浴鍋反應(yīng)20 min,再加入等體積的10%三氟乙酸,產(chǎn)生沉淀,離心取上清液;將上清液、水以及0.1%氯化鐵按體積比5∶4∶1混合,在700 nm處測(cè)吸光度值。

1.2.5 板栗殼原花青素的抑菌活性測(cè)定

1.2.5.1 抑菌圈試驗(yàn) 以F1為測(cè)試樣品,采用抑菌圈試驗(yàn)初步分析其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌的抑菌效果。將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌分別接種至無(wú)菌生理鹽水中,制成菌種濃度為106～107的懸菌液。吸取懸菌液100 μL加入LB培養(yǎng)基中,涂布均勻。將F1分別用無(wú)菌水稀釋成3個(gè)濃度,分別為5、10、20 mg/mL。用無(wú)菌水作為空白對(duì)照,吸取樣品溶液滴于已滅菌的圓形濾紙片上(直徑為6 mm),分別固定在平板上,每個(gè)樣品三個(gè)平行,在37 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h,記錄抑菌圈直徑,取其平均值。

1.2.5.2 最小抑菌濃度(MIC)試驗(yàn) 取濃度為5 mg/mL的F1～F4溶液,采用二倍稀釋法依次得到五個(gè)不同濃度梯度的樣品溶液,吸取1 mL的樣品溶液與4 mL懸菌液于10 mL試管中,放于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h后取出觀察,肉眼可見(jiàn)溶液澄清即溶液完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC[18]。

1.2.6 板栗殼原花青素的組成分析 以甲醇溶液為溶劑,將本實(shí)驗(yàn)中抗氧化活性和抑菌活性最高的級(jí)分配制成濃度為1.0 mg/mL的溶液,對(duì)其進(jìn)行高效液相色譜和質(zhì)譜分析。高效液相色譜條件:色譜柱DIONEX C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相:甲醇(B)-體積分?jǐn)?shù)為0.05%三氟乙酸(A),梯度洗脫:0～12 min,A:87%～75%,B:13%～20%;12～23 min,A:75%～20%,B:25%～80%;23～26 min,A:87%,B:13%。流速:0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

MS分析條件:色譜柱為L(zhǎng)ichrosphers C18柱(4.6 mm×250 mm,5 pm);質(zhì)譜進(jìn)樣分流比為1∶1;負(fù)離子模式;離子化方式:ESI-;掃描范圍:m/z 50～2000;干燥氣溫度350 ℃;干燥氣流速:15 L/min;噴霧壓力:40 psi;毛細(xì)管電壓:3500 V。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.6作圖,數(shù)據(jù)采用Excel 2010,SPSS Statistics 25(IBM,Armonk,NY,USA)進(jìn)行相關(guān)性分析,采用Tukey’s HSD法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗殼原花青素不同級(jí)分的純度和平均聚合度

表1 板栗殼原花青素各級(jí)分的純度和平均聚合度Table 1 Thepurity and average polymerization degree of procyanidins from chestnut shell

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

采用1.2.2中方法,用不同極性溶劑對(duì)板栗殼原花青素粗提物進(jìn)行分級(jí),各級(jí)分的平均聚合度具有顯著差異,具體結(jié)果如表1所示。板栗殼PC粗提物的組分復(fù)雜,其純度最低(48.0%),而聚合度最高(9.42±0.41),而乙酸乙酯的極性比水和乙醇更小,其萃取物的聚合度最小(3.32±0.34),這一結(jié)果與彭芳剛等[14]研究一致。

2.2 板栗殼原花青素抗氧化活性研究

2.2.1 ABTS自由基清除率測(cè)定 在氧化劑的作用下,ABTS會(huì)被氧化成綠色的ABTS,在自由基存在時(shí)ABTS+的產(chǎn)生會(huì)被抑制,從而清除自由基[19]。由圖1可知,板栗殼提取物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力,且抗氧化活性均顯著高于VC(P<0.05),當(dāng)濃度為5 μg/mL時(shí),樣品F1～F4與VC的清除率均低于50%,在樣品濃度達(dá)到65 μg/mL時(shí),樣品F3清除率達(dá)到97.9%,而VC清除率在30%以下,與Seo等[20]的研究結(jié)果相同。樣品F1、F2、F3、F4和VC清除ABTS自由基的IC50值分別為19.83、17.00、11.24、17.79和58.62 μg/mL,清除率VC

圖1 板栗殼PC對(duì)ABTS自由基的清除活性Fig.1 ABTS radical scavenging activity ofthe procyanidins from chestnut shell

2.2.2 羥基自由基清除率測(cè)定 不同聚合度板栗殼原花青素對(duì)羥基自由基清除率如圖2所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,板栗殼原花青素和VC清除羥基自由基能力隨樣品濃度的增加而變大,當(dāng)樣品濃度為5 mg/mL時(shí),清除率基本趨于穩(wěn)定。樣品F1、F2、F3、F4及VC清除羥基自由基IC50值分別為1.62、2.15、1.18、1.49和1.80 mg/mL,清除率為F2

圖2 板栗殼PC對(duì)羥基自由基的清除活性Fig.2 Hydroxy radical scavenging activity ofthe procyanidins from chestnut shell

2.2.3 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定 不同聚合度板栗殼原花青素對(duì)超氧陰離子自由基清除率如圖3所示,原花青素和VC清除超氧陰離子自由基能力隨樣品濃度的增加而增加,當(dāng)濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí),清除率均趨于穩(wěn)定;樣品F1、F2、F3、F4及VC清除超氧陰離子IC50值分別為109.83、100.40、93.98、103.90和135.39 μg/mL,清除率為VC

圖3 板栗殼PC對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性Fig.3 Superoxide radical scavenging activity ofthe procyanidins from chestnut shell

2.2.4 總還原力測(cè)定 板栗殼原花青素的總還原力結(jié)果見(jiàn)圖4,F1～F4及VC的總還原力測(cè)定結(jié)果為F1

表2 F1對(duì)細(xì)菌的抑菌圈結(jié)果(mm)Table 2 Diameters of inhibition zones of F1(mm)

圖4 板栗殼PC的總還原力Fig.4 Total reduction ability of theprocyanidins from chestnut shell

2.3 板栗殼原花青素抑菌活性和最小抑菌濃度(MIC)

抑菌圈試驗(yàn)初篩結(jié)果顯示,F1對(duì)三種試驗(yàn)菌的抑制作用大小為金黃色葡萄球菌>沙門氏菌>大腸桿菌(表2),一定濃度的F1能有效抑制金黃色葡萄球菌,且隨濃度升高其抑制效果增強(qiáng)(圖5),但是,其對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌抑制作用不明顯。進(jìn)一步研究F1-F4對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC,結(jié)果如表3所示。由表3可以看出,聚合度最低的F3對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最佳,其MIC為0.31 mg/mL,而F2和F4對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果次之,MIC均為0.63 mg/mL,F1對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率最弱,MIC為1.25 mg/mL,這一結(jié)果表明,原花青素的抑菌濃度與原花青素純度和聚合度有關(guān),原花青素純度越高、聚合度越低,抑菌效果越好。

圖5 F1對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of F1 on Staphylococcus aureus

表3 F1-F4對(duì)金黃色葡萄球菌的MICTable 3 MIC of F1-F4 on Staphylococcus aureus

2.4 板栗殼原花青素級(jí)分F3組成分析

六種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的HPLC出峰圖見(jiàn)如圖6。圖6中的峰1～6分別代表沒(méi)食子酸、沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯及表兒茶素沒(méi)食子酸酯這6種標(biāo)準(zhǔn)品?？寡趸耙志钚宰罡呒?jí)分F3的HPLC測(cè)定結(jié)果如圖7,組分分析見(jiàn)表4。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品共的保留時(shí)間對(duì)比,確定峰1(4.201 min)為沒(méi)食子酸,峰4(13.615 min)為兒茶素/表兒茶素,可能由于級(jí)分F3中含有大量聚合體,其在高效液相色譜中發(fā)生重疊,形成大峰而無(wú)法分離開(kāi),影響單體出峰[14]。由于板栗殼原花青素組分復(fù)雜,標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量有限,不能全面分析其組成情況,因此,下一步采用高分辨質(zhì)譜進(jìn)一步對(duì)F3組成進(jìn)行分析。

圖6 不同標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of mixedsolution of different standard products注:峰:1:沒(méi)食子酸;2:沒(méi)食子兒茶素;3:表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯;4:表兒茶素5:沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯;6:表兒茶素沒(méi)食子酸酯。

圖7 F3的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of F3注:峰:1:沒(méi)食子酸;4:表兒茶素。

表4 F3的組分信息
Table 4 Composition information of F3

峰號(hào)保留時(shí)間(min)分子量名稱分子式14.201170沒(méi)食子酸C7H6O5413.615290兒茶素/表兒茶素C15H14O6

表5 F3中質(zhì)荷比分析結(jié)果Table 5 The analysis results of F3

對(duì)F3進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析,結(jié)果見(jiàn)圖8,通過(guò)將F3的高效液相圖中保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)比和不同質(zhì)荷比的分子離子峰與文獻(xiàn)[23-26]報(bào)道相比較,鑒定出板栗殼原花青素級(jí)分F3的組分,其中m/z 169.0085為沒(méi)食子酸,m/z 289.0650為兒茶素/表兒茶素及m/z 577.1201為原花青素B型二聚體,結(jié)果如表5。由于板栗殼提取物中成分復(fù)雜,并且原花青素通過(guò)黃烷醇聚合而成,原花青素的各聚合體之間的極性相近。因此,高分辨質(zhì)譜只能很好分離出單體和二聚體。故板栗殼原花青素中含有沒(méi)食子酸、兒茶素/表兒茶素和原花青素B型二聚體。

圖8 F3的ESI質(zhì)譜圖Fig.8 ESI-MS spectrum of F3注:峰:1:沒(méi)食子酸;2:兒茶素/表兒茶素;3:原花青素B型二聚體。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,板栗殼原花青素級(jí)分F3中含有沒(méi)食子酸、兒茶素/表兒茶素及原花青素B型二聚體等多酚類化合物,其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基,而酚羥基的數(shù)量是決定黃酮類化合物抗氧化活性的重要因素[27],可能是使板栗殼提取物具有較高抗氧化活性的原因。對(duì)于不同聚合度的原花青素來(lái)說(shuō),抗氧化性的差異是普遍存在的,造成抗氧化差異性的原因可能是:純化工藝除掉了一部分對(duì)自由基沒(méi)有抗氧化活性的有機(jī)物,使多酚類物質(zhì)相對(duì)含量增加,從而導(dǎo)致其自由基清除率增加[28];原花青素的聚合度影響其分子量大小,由此造成的空間結(jié)構(gòu)的變化是影響原花青素抗氧化活性的主要因素。Caillet等[29]研究證明,原花青素分子中苯環(huán)上羥基電子離域是起主要抗氧化活性作用的原因,高聚體原花青素分子間的空隙會(huì)越來(lái)越狹窄,導(dǎo)致高聚體原花青素像一個(gè)緊湊的“密封體”,不利于羥基電子離域,即抑制了羥基自由基發(fā)揮活性作用,從而降低了原花青素的抗氧化性。孫蕓等[30]研究葡萄籽原花青素不同聚合度與自由基清除能力關(guān)系中發(fā)現(xiàn),在以水為溶劑的體系中,原花青素可能存在如蛋白質(zhì)一樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu),分子中各基團(tuán)之間通過(guò)疏水鍵和氫鍵相互作用來(lái)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,原花青素分子中一部分酚羥基形成分子內(nèi)氫鍵,導(dǎo)致其與自由基反應(yīng)的活性降低。另一部分酚羥基與水作用,發(fā)揮其抗氧化作用。故隨著原花青素的聚合度增加,分子中更多的酚羥基形成分子內(nèi)氫鍵,使其清除自由基能力下降。高分辨液相質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),板栗殼原花青素中含有兒茶素/表兒茶素。有研究表明[31-32],細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂雙分子層與兒茶素類化合物相結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜被破壞,胞內(nèi)蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)發(fā)生滲漏,兒茶素分子中的酚羥基與二氫葉酸合成酶肽鍵上的氨基酸殘基結(jié)合,使細(xì)菌合成嘌呤和嘧啶的二氫葉酸還原酶失活,影響細(xì)菌核酸的合成,從而使細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖被抑制。不同細(xì)菌對(duì)多酚的耐受力不同,曾亮等[33]研究發(fā)現(xiàn),兒茶素類化合物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制率比革蘭氏陰性菌高,其細(xì)胞壁存在外膜結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞膜起到一定的保護(hù)作用。這可能是板栗殼原花青素對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用,而對(duì)沙門氏菌及大腸桿菌抑制作用不明顯的原因。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以板栗殼為原料,通過(guò)不同極性溶劑萃取得到不同聚合度的板栗殼原花青素,抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同聚合度的板栗殼原花青素均具有顯著的ABTS自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除活性及總還原能力,且抗氧化活性隨聚合度的增大而減小。聚合度最低的級(jí)分F3具有最高的抗氧化活性,同時(shí),抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,板栗殼原花青素的抑菌活性也隨聚合度增加而減小。高分辨質(zhì)譜分析結(jié)果顯示,板栗殼原花青素的乙酸乙酯萃取物層(F3)主要含有3種原花青素,分別為沒(méi)食子酸、兒茶素/表兒茶素和原花青素B型二聚體。本研究為將板栗殼原花青素開(kāi)發(fā)成天然抗氧化劑和抑菌劑提供了一定參考依據(jù)。