張長勝，來魯華

1北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，物理化學(xué)研究所，分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)國家重點實驗室，北京分子科學(xué)國家研究中心，北京 100871

2北京大學(xué)定量生物學(xué)中心，北京大學(xué)-清華大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京 100871

1 引言

2009年Hyman、Brangwynne等人用PGL-1(Guanyl specific ribonuclease 1)等分子參與的相分離的理論解釋了線蟲受精卵細(xì)胞極化和不對稱分裂機(jī)制這個困擾該領(lǐng)域至少25年的難題1,2。該理論簡單自然，實驗證據(jù)豐富，啟發(fā)了生命科學(xué)其它領(lǐng)域的研究者認(rèn)識到相分離可能是一個普遍的生物分子組織定位、功能調(diào)控的機(jī)制。隨后細(xì)胞的相分離機(jī)制在發(fā)育1,2、環(huán)境壓力應(yīng)激3、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控4,5、DNA修復(fù)6、RNA剪接加工與轉(zhuǎn)運(yùn)7,8、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)9,10、固有免疫11、神經(jīng)信號傳遞12等大量的生命活動過程中被發(fā)現(xiàn)。生命體通過生物分子相分離產(chǎn)生具有各種功能的高度動態(tài)的無膜細(xì)胞器的概念被廣泛接受13，相分離機(jī)制在生命活動中至關(guān)重要的作用開始逐漸清晰14。近幾年來對生物體系相分離的研究更是呈現(xiàn)井噴式的增長(圖1展示了PUBMED文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/收錄的關(guān)于生物體系液-液相分離文獻(xiàn)在近20年中的變化情況)。

圖1 PUBMED數(shù)據(jù)庫收錄的2000-2019年間液-液相分離文獻(xiàn)逐年快速增長情況Fig.1 Rapid growth of literatures on liquid-liquid phase separation from 2000 to 2019 in PUBMED.

多組分體系相轉(zhuǎn)變是物理化學(xué)領(lǐng)域研究的基本問題之一。由于生物分子序列與結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，研究生物分子的相分離機(jī)制對于物理化學(xué)學(xué)科來說也是一個新的重要挑戰(zhàn)。需要發(fā)展新的實驗、模擬和理論研究方法，從而深入認(rèn)識相分離的物理化學(xué)機(jī)制，包括其熱力學(xué)、動力學(xué)、聚集體微觀結(jié)構(gòu)、序列與相分離條件和聚集體性質(zhì)關(guān)系、相分離的驅(qū)動力和調(diào)控方式等。

本文將從相分離聚集體的基本性質(zhì)、相圖、微觀結(jié)構(gòu)、統(tǒng)計熱力學(xué)、實驗和分子模擬研究方法、相分離性質(zhì)與生物功能關(guān)系、調(diào)控分子設(shè)計這七個方面簡介基本認(rèn)識、闡述當(dāng)前主要的研究進(jìn)展、總結(jié)梳理主要的研究結(jié)果，為進(jìn)一步的生物分子相分離物理化學(xué)機(jī)制的研究提供借鑒。

2 液-液相分離液滴基本性質(zhì)及表征方法

2.1 形貌

生物分子在體外形成的液滴一般為微米級大小，在溶液中自由狀態(tài)下呈球形，具有液-液兩相界面張力所導(dǎo)致的光滑表面。微分干涉差顯微鏡(differential interference contrast microscopy)、寬場熒光顯微鏡(wide-field fluorescence microscopy)是觀察聚集體狀態(tài)的主要手段，軟X射線光譜15可用于研究其三維結(jié)構(gòu)。溶液中微米級的相分離液滴可以引起可見光的散射，散射的強(qiáng)度，即濁度(turbidity)主要跟液滴的尺寸和數(shù)量相關(guān)。通過濁度的測量可以很便捷的獲得體系相分離的臨界條件14,16。體外實驗中觀察到的溶液中生長的液滴一般比細(xì)胞內(nèi)的相分離液滴大10-1000倍17，Shayegan等人用凸透鏡誘導(dǎo)約束(convex lens-induced confinement)技術(shù)，模擬細(xì)胞內(nèi)的受限環(huán)境，限制體外液滴的大小，并用熒光顯微鏡觀察RNA polyU和RNA結(jié)合蛋白Dhh1形成的液滴，大小受限后液滴由布朗運(yùn)動變?yōu)樘S式運(yùn)動18。

2.2 融合與浸潤

相分離過程首先是在過飽和溶液中，聚集體分子快速成核并生長形成初始液滴(生長growth)，液滴在溶液中自由移動，小液滴之間逐漸碰撞凝聚融合成大液滴(粗化coarsening)，劇烈振動下大液滴可以分裂為小液滴，與固體表面接觸有浸潤現(xiàn)象。小液滴融合成為大液滴的速度可以用融合液滴的縱橫比的變化來粗略表征，也可以通過雙光阱光鑷(dual-trap optical tweezer)實現(xiàn)對兩個液滴的控制和融合速度的測量19,20。理論上融合速率與液滴粘度和表面張力的比值呈負(fù)相關(guān)21,22。Berry等人23研究了核仁蛋白FIB在體外相分離過程中液滴生長、粗化的動力學(xué)，實現(xiàn)結(jié)果表明粗化過程中液滴的平均半徑與時間的1/3次冪成正比，他們還發(fā)現(xiàn)含RNA的液滴粗化更快，而溶解過程速度更慢。對于成分不同，不能互溶的液滴相互碰撞，依據(jù)表面張力的不同，形成分散或分層融合狀態(tài)24；當(dāng)兩液滴之間的界面張力小于它們與溶劑的界面張力時形成分層融合結(jié)構(gòu)，例如在核仁中有從內(nèi)到外FC-DFC-GC三層液態(tài)結(jié)構(gòu)25。

2.3 液滴內(nèi)分子的運(yùn)動性

液滴內(nèi)各組分呈自由運(yùn)動狀態(tài)，液滴內(nèi)外分子可動態(tài)交換，常用熒光光漂白恢復(fù)(fluorescence recovery after photobleaching)技術(shù)定量研究液滴組分的運(yùn)動性。熒光相關(guān)光譜(Fluorescence correlation spectroscopy)技術(shù)通過定量測量液滴微區(qū)內(nèi)的熒光漲落，可獲得第二維里系數(shù)、分子擴(kuò)散系數(shù)、黏度、以及濃度等數(shù)據(jù)。Wei等人26用此技術(shù)描繪了LAF-1蛋白體系的包含高濃度分支的完整的相分離相圖，并研究了體系形成的液滴中LAF-1分子的運(yùn)動性質(zhì)，他們發(fā)現(xiàn)LAF-1與長鏈RNA分子polyrA3k共同作用產(chǎn)生的液滴中LAF-1蛋白的濃度及密度比純LAF-1液滴的值顯著降低，而液滴粘度卻顯著升高。脈沖梯度場核磁共振(Pulsed-field gradient NMR)也用于研究液滴內(nèi)分子的擴(kuò)散系數(shù)。Brady等人27應(yīng)用此技術(shù)測定的Ddx4在凝聚相中和溶液相中的擴(kuò)散系數(shù)分別為7.5 × 10-9和8.8 ×10-7cm2·s-1。他們對液滴中LAF-1分子主鏈15N的R2弛豫速率的測量結(jié)果是16.4 s-1，表明蛋白質(zhì)主鏈仍具有顯著的運(yùn)動性。Reichheld等人28應(yīng)用核磁共振技術(shù)研究了彈性蛋白ELP3液滴內(nèi)分子的運(yùn)動性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，得到類似的結(jié)果。

2.4 滲透性

非專一性滲透的分子通過液滴“孔隙”滲透到液滴內(nèi)部的能力跟分子大小有關(guān)，可用不同粒徑的葡聚糖(Dextran)研究液滴的滲透性26,29。如蛋白質(zhì)LAF-1液滴可以透過10kDa，直徑約3納米的葡聚糖分子26。專一性的滲透一般由進(jìn)入液滴的客體分子和基架分子專一性的相互作用介導(dǎo)。例如轉(zhuǎn)錄因子雌激素受體(ER)含有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBP)，只有當(dāng)雌激素配體結(jié)合于LBP之后，ER轉(zhuǎn)換至與相分離基架蛋白MED1 (LXXLL區(qū))結(jié)合狀態(tài)，ER才會被招募至MED1液滴中5。

3 影響生物大分子液液相分離發(fā)生的條件及相圖

3.1 分子濃度

一定條件下，當(dāng)生物分子濃度較稀時，生物分子均一地溶于溶劑中，當(dāng)超過臨界飽和濃度cS時，生物分子由于相互吸引作用而凝聚，體系發(fā)生相分離，從溶液中析出生成新的相，聚集相液滴具有濃度cD，當(dāng)生物分子濃度超過cD時，體系又變?yōu)閱我幌?。一般通過不同濃度下的觀察相分離是否發(fā)生，來確定體系的臨界飽和濃度cS，臨界飽和濃度越低說明體系越易于發(fā)生相分離。對于兩種生物分子相互作用產(chǎn)生的相分離，一般用二維相圖研究相分離發(fā)生的濃度條件。

3.2 溫度

溫度對相分離的影響體現(xiàn)了相分離過程的熵效應(yīng)。多數(shù)的生物分子相分離過程是體系熵減少的過程所以溫度的升高不利于相分離的進(jìn)行。在溫度-濃度二維相圖上存在最高臨界共溶溫度(upper critical solution temperature)，例如靜電區(qū)塊相互作用驅(qū)動的Ddx4蛋白27。對于相分離的溶劑熵或離子熵效應(yīng)顯著的體系，相分離使體系熵增加，溫度的升高有利于相分離的進(jìn)行，在溫度-濃度二維相圖上存在最低臨界共溶溫度(lower critical solution temperature)。例如依靠疏水作用聚集的彈性蛋白30，和依靠Lys/Gly rich區(qū)域相分離的Tau蛋白31。

3.3 離子強(qiáng)度(鹽濃度)

對于一價金屬離子(Na+，K+)，靜電作用對于多數(shù)的生物分子的相分離具有關(guān)鍵作用，提高鹽濃度減弱靜電作用，所以一般增加鹽濃度不利于相分離的發(fā)生，使臨界飽和濃度cS增加，聚集體粘度也會下降27。然而如果體系中疏水作用在蛋白分子間相互作用中起主要作用，那么增加鹽濃度將有利于該蛋白的相分離，例如RNA結(jié)合蛋白FUS的N端低復(fù)雜度(LC)結(jié)構(gòu)域32。對于二價金屬(Mg2+，Zn2+)提供多價相互作用促進(jìn)相分離的體系，其濃度超過臨界濃度時相分離才可發(fā)生11,33。

3.4 pH值

pH值影響氨基酸的質(zhì)子化狀態(tài)。增強(qiáng)分子間相互作用的pH值條件促進(jìn)相分離的發(fā)生。例如酵母細(xì)胞在受到環(huán)境壓力后細(xì)胞質(zhì)pH值下降，將促進(jìn)天然無序蛋白SUP35的相分離3。

3.5 擁擠效應(yīng)

體外實驗中常用加入PEG(聚乙二醇)分子的方法引入擁擠效應(yīng)，以模擬細(xì)胞中的擁擠環(huán)境。擁擠效應(yīng)提高了生物分子的有效濃度，會促進(jìn)相分離的發(fā)生34。

3.6 核酸分子對蛋白質(zhì)相分離的影響

核酸分子對蛋白質(zhì)相分離的影響主要取決于核酸分子是否增強(qiáng)了體系的多價相互作用。若核酸分子與蛋白質(zhì)分子有較強(qiáng)專一性的多價相互作用，那么核酸分子將促進(jìn)蛋白質(zhì)相分離的發(fā)生；若核酸分子的強(qiáng)帶電性主要起到的是類似鹽離子的靜電屏蔽作用，削弱蛋白質(zhì)之間的相互作用，那么核酸分子的加入會抑制相分離的發(fā)生；若同時存在核酸-蛋白作用和靜電屏蔽兩種效應(yīng)，但是都較弱，那么一般是在核酸濃度較低時促進(jìn)相分離，核酸濃度較高時抑制相分離，例如FUS蛋白LC結(jié)構(gòu)域32以及Banerjee等人構(gòu)建的模式體系35。Zhou實驗室36用表面帶3個或2個相互作用區(qū)塊的小球模擬蛋白質(zhì)和核酸分子的多價和靜電作用，用Gibbs系綜蒙特卡洛模擬的方法37,38研究了核酸／蛋白質(zhì)體系在不同的蛋白質(zhì)-核酸作用強(qiáng)度下的兩相平衡(即兩相共存)濃度，得到相圖。

3.7 相分離數(shù)據(jù)庫

Zhang實驗室建立的生物體系液-液相分離數(shù)據(jù)庫(LLPSDB)39較全面的收集了生物分子相分離發(fā)生條件的實驗數(shù)據(jù)，為相分離的物理化學(xué)機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。

4 驅(qū)動液-液相分離的生物分子結(jié)構(gòu)特征

相分離的主要驅(qū)動因素是多價相互作用，同時液-液相分離需要結(jié)構(gòu)上保證相互作用的動態(tài)性。本文將提供多價相互作用的結(jié)構(gòu)總結(jié)為三大類，并提供部分實例，更多的例子可以參考近期的其他綜述文章13,40,41。

4.1 由多個重復(fù)結(jié)構(gòu)域特異性作用介導(dǎo)的相分離

第一大類是利用特異性的蛋白質(zhì)相互作用，其中重復(fù)的結(jié)構(gòu)域提供多價作用，重復(fù)結(jié)構(gòu)域之間的柔性提供相互作用的動態(tài)性。主要有兩類體系：

(1)多個相同／相似結(jié)構(gòu)域的線性串聯(lián)(圖2a所示)，例如NCK等蛋白質(zhì)的SH2，SH3結(jié)構(gòu)域重復(fù)，N-WASP蛋白的PRM結(jié)構(gòu)域重復(fù)42，多泛素化43等。

圖2 相分離體系提供多價相互作用的類型示例Fig.2 Illustration of multivalent force types in biomolecular phase separation systems.

(2)蛋白質(zhì)的寡聚(圖2b所示)，如突觸后致密物PSD中的PSD-95是底物結(jié)合誘導(dǎo)的二聚體，SynGAP蛋白通過Coiled結(jié)構(gòu)域形成三聚體44，核仁蛋白NPM1通過N端結(jié)構(gòu)域形成五聚體25等。

4.2 由蛋白質(zhì)無序區(qū)域介導(dǎo)的相分離

第二大類是由蛋白質(zhì)天然無序區(qū)(intrinsically disordered proteins/domains)或稱低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域(low complicity domains)驅(qū)動形成的相分離45。大量的重復(fù)結(jié)構(gòu)片段可以提供多價作用，固有的無序結(jié)構(gòu)提供相互作用的動態(tài)性46。這類蛋白相比于第一大類可以提供更多價、更靈活多樣的相互作用方式，因此驅(qū)動生物體系大多數(shù)液態(tài)聚集體形成的基架分子為這類蛋白。有以下典型的例子：

(1)多個帶相同電荷殘基集中區(qū)域(圖2c所示)。例如在Ddx4的N端結(jié)構(gòu)域(1-236)包含多段正電荷殘基(Arg/Lys)或負(fù)電荷殘基(Glu/Asp)集中分布的區(qū)域47,48，提供多價的靜電相互作用。

(2)含多個RGG以及(G/S)Y(G/S)單元(圖2d所示)，例如FUS，LAF1等核蛋白，精氨酸的胍基與酪氨酸的芳香環(huán)有cation-π以及類似π-π的相互作用，酪氨酸之間也可以形成π-π相互作用，精氨酸的胍基與核酸的磷酸基團(tuán)有強(qiáng)靜電作用，以及與堿基有cation-π以及類似π-π的較強(qiáng)相互作用。Vernon等人49詳細(xì)研究了π-π或類似π-π相互作用在蛋白質(zhì)相分離中的重要作用。Wang等人19研究了22個FUS家族的蛋白質(zhì)的低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域相分離的臨界飽和濃度，發(fā)現(xiàn)與Arg、Tyr殘基數(shù)目的乘積成反比，將FUS中的精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，或?qū)⒗野彼嵬蛔優(yōu)楸奖彼岫紩黠@降低蛋白的相分離能力。他們的研究也發(fā)現(xiàn)Gly對于增加液滴內(nèi)蛋白的運(yùn)動性，維持聚集體的流動性很重要。

(3)富含Gln/Asn序列。這是多數(shù)朊蛋白樣結(jié)構(gòu)域的特征。天冬酰胺、谷酰胺殘基側(cè)鏈之間以及側(cè)鏈與主鏈之間氫鍵50、以及其它偶極作用是這類蛋白聚集的關(guān)鍵驅(qū)動力51。例如亨廷頓蛋白(HTT exon1)的聚集主要是其polyQ序列提供的多價作用驅(qū)動的，并且其中谷酰胺(Q)的數(shù)目決定了聚集體的形態(tài)，過長的polyQ序列會導(dǎo)致不可逆的纖維樣聚集體的形成，與疾病直接相關(guān)52。Fiumara等人分析了富含Gln/Asn以及polyQ序列的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，他們認(rèn)為卷曲螺旋結(jié)構(gòu)對于促進(jìn)這類蛋白的聚集具有重要作用53。

(4)在彈性蛋白(Elastin)中，VPG等序列重復(fù)出現(xiàn)，其疏水作用提供相分離驅(qū)動力30。

4.3 核酸分子介導(dǎo)的相分離

第三大類是核酸分子(DNA或RNA)，單鏈核酸的柔性為相互作用提供動態(tài)性。在模式體系(表1g)中的研究發(fā)現(xiàn)單鏈核酸與蛋白質(zhì)易于聚集成液滴，而雙鏈核酸較為剛性，與蛋白質(zhì)易于形成凝膠狀聚集體54。

核酸分子提供的多價作用有三種類型。(1)核酸分子的主鏈磷酸基團(tuán)可以提供多價的靜電作用(圖2e所示)。這種多價作用類型沒有序列特異性。(2)核酸序列的重復(fù)擴(kuò)展也為其依靠堿基對的多價性發(fā)生核酸分子自身的相分離(如表1a的(CAG)或(CUG) repeat RNA可發(fā)生不依賴蛋白質(zhì)的相分離55)。(3) RNA序列中存在重復(fù)多個特異結(jié)合某個蛋白質(zhì)的區(qū)塊，這些區(qū)塊為其與該蛋白質(zhì)的相分離提供較專一的多價作用(圖2f所示)。相同的蛋白質(zhì)分子與不同多價結(jié)構(gòu)的RNA分子相分離，會導(dǎo)致形成不同性質(zhì)、不同功能的聚集體。Longdon等人的研究發(fā)現(xiàn)33,56，在霉菌Ashbya gossypii細(xì)胞中，三種mRNA BNI1、SPA2與CLN3都與Whi3蛋白作用發(fā)生相分離，但是BNI1與SPA2的液滴可以共定位于細(xì)胞的尖端，而CLN3液滴具有更大的密度與前兩者不能融合，定位于細(xì)胞核周圍。他們的研究揭示發(fā)現(xiàn)這種差異性來源于BNI1/SPA2二級折疊結(jié)構(gòu)中的Whi3結(jié)合位點的分布不同。它們的序列中都含有5個Whi3結(jié)合位點，但是在CLN3中位點間隔顯著小于BNI1/SPA2，導(dǎo)致CLN3與Whi3形成的液滴相比于BNI1/SPA2液滴具有更大的粘度，更大的密度和內(nèi)部分子更差的運(yùn)動性56。另外CLN3二級折疊結(jié)構(gòu)中與BNI1或SPA2互補(bǔ)的序列被埋藏，導(dǎo)致CLN3不能進(jìn)入BNI1/SPA2液滴，不能發(fā)生CLN3與BNI1/SPA2液滴的融合。CLN3重折疊改變二級結(jié)構(gòu)，暴露互補(bǔ)序列后就可以被BNI1/SPA2液滴招募33。

表1 研究生物分子相分離物理化學(xué)機(jī)制的模式實驗體系Table 1 The model systems for experimental studying the physiochemical mechanisms of biomolecular phase separation.

5 影響生物大分子液液相分離發(fā)生的條件及相圖

5.1 Flory-Huggins理論

從熱力學(xué)角度看，相分離的發(fā)生降低了體系整體的自由能57。體系的自由能可分解為焓變和熵變的貢獻(xiàn)，焓變包含生物分子與溶劑之間、生物分子之間以及溶劑分子之間勢能的變化，熵變衡量體系自由度的變化。Flory58和Huggins59在上世紀(jì)40年代提出了高分子溶液的“似晶格”模型，用高分子的體積分?jǐn)?shù)φ作為參數(shù)，推導(dǎo)出了理想高分子溶液混合熵變的計算公式，以及用平均作用場假設(shè)，引入?yún)?shù)χ描述相互作用能的變化，得到了混合焓變的理論計算公式，混合自由能變F的計算公式即為公式(1)，

式中kB為玻爾茲曼常數(shù)，T為溫度，N為高分子鏈的長度，z為晶格的配位數(shù)，ups、upp、uss分別為高分子的一個鏈段與一單位溶劑之間、一對鏈段之間、一對溶劑之間的結(jié)合能。Flory和Huggins的理論以十分簡潔、粗略的形式解釋了包含生物大分子在內(nèi)的高分子相分離過程的熱力學(xué)機(jī)制。

Flory和Huggins的理論中體系由于混合熵變總為負(fù)，當(dāng)χ取較大的正值時，混合自由能會取到正值，也就是體系趨向于兩相，而不是混合，這時混合自由能對濃度(體積分?jǐn)?shù))的函數(shù)存在兩個谷值點，即為相分離的臨界濃度值60。

5.2 其它統(tǒng)計熱力學(xué)理論

在Flory和Huggins的焓變公示推導(dǎo)過程中只考慮了近程的相互作用，Overbeek和Voorn61在他們的工作基礎(chǔ)上考慮了長程靜電相互作用，應(yīng)用于帶Z個正電和Z個負(fù)電而整體不帶電的聚電解質(zhì)高分子溶液。他們假設(shè)這些電荷隨機(jī)的散布于溶液中，與鹽溶液類似可以用Debye-Hückel理論假設(shè)計算體系中的電荷間相互作用的能量。之后，隨機(jī)相位近似(random phase approximation，RPA)方法被應(yīng)用于的聚電解質(zhì)高分子溶液靜電作用的計算，該方法可用于任意電荷分布樣式的聚電解質(zhì)高分子溶液體系62,63。Lin等人48,64將該方法應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子相分離體系的計算，解釋了同種電荷在序列上集中分布對于相分離的驅(qū)動作用，以及離子強(qiáng)度對于靜電作用為主的相分離體系的影響。場理論模擬(Field theory simulation)方法是更細(xì)致處理聚電解質(zhì)高分子溶液體系的方法，通過對場理論中的共軛變量進(jìn)行模擬采樣，來獲得體系的相圖。McCarty等人65用離散的鏈模型表示不同Lys/Glu肽鏈，用場理論模擬方法獲得了它們的鹽濃度-蛋白濃度相圖，得到跟RPA理論相近的結(jié)果。

6 研究生物分子液-液相分離物理化學(xué)機(jī)制的手段

天然發(fā)生相分離的生物大分子序列復(fù)雜導(dǎo)致其構(gòu)象復(fù)雜，分子間相互作用多樣，從實驗上細(xì)致研究分子序列、結(jié)構(gòu)與相分離條件、聚集體性質(zhì)之間的關(guān)系比較困難。當(dāng)前的研究試圖從兩個方面解決這個問題，一是尋找并研究簡化的相分離模式實驗體系，用簡單重復(fù)序列研究電荷性質(zhì)、殘基種類、序列長度等參數(shù)對相分離的影響；另一方面是利用分子模擬的方法，利用與序列相關(guān)的力場勢能函數(shù)，研究預(yù)測體系相分離的性質(zhì)和規(guī)律。

6.1 利用模式體系實驗研究生物分子相分離

表1收集了不同類型的蛋白質(zhì)/核酸相分離的模式體系研究對象及主要結(jié)果。包括單核酸(a)、柔性連接(b、c)、天然無序蛋白質(zhì)(d)、蛋白質(zhì)+核酸(e、f、g)、蛋白質(zhì)+蛋白質(zhì)(h、i)等體系。

6.2 生物分子液-液相分離過程的分子模擬

生物分子相分離是眾多分子通過隨機(jī)的多價作用形成，因此相分離的模擬體系需要包含足夠數(shù)目的分子，參與相分離的蛋白質(zhì)或核酸又往往包含幾十到幾百的殘基，因此相分離體系的模擬難以依靠原子級精細(xì)的力場模擬完成，一般需要粗?；哪Ｐ蛠硗瓿?。最近，Dignon等人70對天然無序蛋白質(zhì)的液-液相分離模擬方法作了簡要的綜述。本文將著重介紹Mittal實驗室71開發(fā)的用于長條形盒子動力學(xué)模擬(Slab simulation)的蛋白質(zhì)粗?；椒ㄒ约癙appu實驗室72開發(fā)的格點模型下模特卡羅模擬的粗?；椒?。Chan實驗室73,74在生物分子相分離的模擬分子模擬方法方面也有較深入的研究。

6.2.1 長條形盒子動力學(xué)模擬(Slab simulation)的粗?；椒?/p>

該模擬方法將所有分子放在長條形的周期性盒子(三個方向邊長：x=y＜＜z)中，在NPT系綜的隱式溶劑分子動力學(xué)模擬中，做只沿z軸方向平衡的各向異性壓力耦合(pressure coupling)。這樣分子模擬中相分離完成后蛋白分子聚集于凝聚相，在z軸的很窄的區(qū)域分布。Mittal實驗室71開發(fā)了用于這一模擬的蛋白質(zhì)粗粒化方法。蛋白質(zhì)鏈的每個殘基看作一個粒子，相鄰粒子間用彈簧相連。不相鄰粒子間包含兩種作用勢函數(shù)：Debye-Hückel靜電屏蔽的靜電作用和短程的成對勢。短程的成對勢從Lenard-Jones勢改造而來，Mittal實驗室建議了兩種模型，即基于殘基對疏水性調(diào)整LJ勢的模型(HPS模型)和Kim-Hummer發(fā)展的原用于蛋白-蛋白相互作用研究的修正LJ勢勢阱深度參數(shù)的模型(KH模型)。這兩個模型的未定參數(shù)都通過擬合天然無序蛋白質(zhì)的回轉(zhuǎn)半徑(來自小角X射線散射實驗)來得到。隨后他們用這個粗粒化動力學(xué)模擬方法計算了FUS和LAF-1這兩個相分離體系的溫度-濃度相圖。他們的計算表明FUS的模擬磷酸化突變使最高臨界共溶溫度降低(即不利于相分離)，將FUS序列拷貝延長將增加最高臨界共溶溫度，LAF全長的最高臨界共溶溫度比只有IDR時的值高。這些結(jié)果都與實驗結(jié)果相吻合。該實驗室還用這個模型計算的臨界溫度值，同天然無序蛋白質(zhì)單分子的性質(zhì)，即天然無序線團(tuán)到蜷縮球轉(zhuǎn)變溫度(Tθ)高度相關(guān)，因此他們認(rèn)為天然無序蛋白自身的性質(zhì)可以用于預(yù)估其相分離發(fā)生的條件75。他們也與Fawzi實驗室合作，用此模擬方法研究了hnRNPA2低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域的單點突變對其相分離條件的影響。他們發(fā)現(xiàn)D290V突變體比野生型具有更低的臨界共溶溫度，相同溫度下，此突變體的臨界濃度比野生型高8。

6.2.2 格點模型下蒙特卡洛模擬

Pappu實驗室專注于該方法的研究，他們開發(fā)了LASSI (Lattice simulation of Sticker and Spcacer Interactions)具體實現(xiàn)了格點模型的聚集模擬72。格點模型是更為簡化的模型，一般將生物分子的結(jié)構(gòu)域(功能單元)整體作為一個粒子，粒子只能處于離散立方網(wǎng)格的格點中，不同粒子所在格點不能重合，一般假設(shè)只有相鄰格點粒子有相互作用并且粒子對的相互作用能參數(shù)化為一個確定值，體系用蒙特卡洛方法演化采樣。Pappu實驗室用此模擬方法研究了核仁FIB1-NPM1-RNA三元體系中結(jié)構(gòu)域相互作用模式影響形成分層液滴的機(jī)制，其中用一個分枝的結(jié)構(gòu)模擬NPM1分子五聚體的結(jié)構(gòu)25。他們也用此模擬方法做了(SH3)m+ (PRM)n體系中無序連接鏈對相分離的影響的研究76。模擬結(jié)果顯示連接鏈的有效溶劑體積影響該體系聚集態(tài)的性質(zhì)，連接鏈有效溶劑體積大、主要為較剛性的伸展構(gòu)象時體系傾向于聚集成凝膠，而相反，連接鏈以壓縮狀態(tài)為主時體系傾向于聚集成液滴。

7 液液相分離的物理化學(xué)性質(zhì)決定了其在細(xì)胞中的功能

7.1 生物分子相分離的生物學(xué)功能

生物分子相分離在生命體活動中扮演著重要而多樣的功能。表2列舉了生物分子相分離在發(fā)育(a、b)、神經(jīng)活動(c、d)、固有免疫(e)、環(huán)境壓力應(yīng)激(f、g)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控和DNA修復(fù)(h、i)、DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控(j、k、l)、RNA剪接加工與轉(zhuǎn)運(yùn)(m、n、o)、核糖體合成(p)、細(xì)胞分裂(q、r)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(s、t)、蛋白質(zhì)自噬降解(u)、細(xì)胞膜內(nèi)吞(v)等細(xì)胞活動的各方面所起的關(guān)鍵作用。相分離的這些生物功能可以總結(jié)為以下主要的五個方面，對生物分子相分離生物功能的其它分類方式可見綜述14,24,77。

(1)富集。將同種功能分子富集在一起以提高局部濃度，或是將不同種類的分子富集在一起來完成同一件任務(wù)，是生物分子相分離的首要功能。通過提高酶及其反應(yīng)底物的濃度，可以顯著提高的催化效率。Strulson等人78發(fā)現(xiàn)不依賴蛋白的RNA相分離聚集體中的核酶(Ribozyme)，HHL和HHS，催化裂解反應(yīng)的效率比溶液狀態(tài)下增加了近70倍。DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控93、RNA剪接加工7、核糖體合成(核仁中)25等過程需要眾多分子組件組裝成分子大機(jī)器才可以完成，相分離形成的液滴富集、組裝、修飾加工這些分子組件，為分子大機(jī)器提供了工作場所。另外液態(tài)聚集體提供了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中需要的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)足夠的穩(wěn)定性，使信號輸出需要的相互作用維持足夠的時間，來達(dá)到對輸入信號放大輸出的作用。在Nephrin +Nck + N-WASP相分離激發(fā)肌動蛋白組裝的研究中，發(fā)現(xiàn)變化Nck/Nephrin的比例，將改變N-WASP穩(wěn)定停留的時間，進(jìn)而影響信號輸出，即肌動蛋白的組裝79。

(2)屏蔽。在細(xì)胞受到環(huán)境壓力時，為避免細(xì)胞內(nèi)重要生物分子受到破壞損傷，這些分子通過躲避至這些臨時的聚集體中，同時一般抑制其自身活性，等到壓力解除后重新恢復(fù)3,80。mRNA通過相分離液滴載運(yùn)過程中mRNA的翻譯暫時被沉默，也是屏蔽保護(hù)的功能8。DNA損傷后，損傷部位的相分離對受損DNA也起到屏蔽保護(hù)作用6,81。HP1α相分離形成的液態(tài)聚集體專一性的招募異染色質(zhì)，屏蔽RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子等蛋白質(zhì)，沉默異染色質(zhì)的基因表達(dá)92。

(3)開關(guān)。細(xì)胞需要迅速對外界信號做出反應(yīng)，在不同狀態(tài)間進(jìn)行切換。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)10、增強(qiáng)子基因轉(zhuǎn)錄4,5、神經(jīng)細(xì)胞突觸的興奮信號傳遞12都是需要一個判斷輸入信號，達(dá)到閾值后快速高強(qiáng)度激活的過程。相分離的協(xié)同和高度動態(tài)的性質(zhì)保證了這些生物開關(guān)的實現(xiàn)。Hnisz等人82對增強(qiáng)子體系的相分離過程的模型研究表明參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白的數(shù)目決定著基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程的希爾系數(shù)，增強(qiáng)子體系通過相分離增加了希爾系數(shù)，也就是狀態(tài)轉(zhuǎn)變的協(xié)同性。

(4)定位。液滴通過招募錨定在特定細(xì)胞位置的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)液滴的定位，從而實現(xiàn)液滴成d分在細(xì)胞內(nèi)的精確定位。P granule向細(xì)胞極性一端遷移，使得生殖細(xì)胞所需的RNA和蛋白質(zhì)向極性一端富集定位2。T細(xì)胞信號通路的激活引發(fā)下游蛋白向細(xì)胞膜的胞內(nèi)一側(cè)富集定位10。

(5)生力。液滴將表面張力轉(zhuǎn)化為機(jī)械力的功能。例如由常染色質(zhì)的低密度區(qū)液滴的表面張力轉(zhuǎn)化的機(jī)械力改變了染色質(zhì)的三維組織結(jié)構(gòu)和應(yīng)力91。細(xì)胞膜胞內(nèi)一側(cè)的液滴表面張力轉(zhuǎn)化的機(jī)械力為細(xì)胞膜內(nèi)吞提供動力99。

認(rèn)識生命體中某一特定體系的相分離過程一般需要如表2所示研究三類相關(guān)的分子。首先是確定推動相分離發(fā)生的關(guān)鍵成分分子，這些分子的凝聚為招募功能分子搭起基架，稱為基架分子(scaffold)；然后是被招募的完成生物功能的功能客體分子(client)；第三是聚集體的生成和消失受哪些分子調(diào)控，一般是執(zhí)行轉(zhuǎn)錄后修飾的分子。

表2 細(xì)胞活動過程中生物分子相分離的重要作用與機(jī)制Table 2 Important cases of biomolecular phase separation in cell activities.

continued Table 2

7.2 生物分子相分離的物理化學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)功能的關(guān)系

圖3列舉了相分離生物學(xué)功能所依賴的物理化學(xué)性質(zhì)。(1)聚集體對酶/底物分子的的專一性招募富集，顯著提高了局部聚集體對酶/底物分子的濃度，提升了催化效率。(2)若已經(jīng)定位的蛋白質(zhì)可以被液滴招募，那么整個液滴由該蛋白的所在位置而定位。(3)多組分的生物分子在同一時空聚集，同時聚集體是高度動態(tài)可逆的，這保證了這些組分完成功能的協(xié)同性，起到生物開關(guān)的功能。(4)液滴對小分子量分子可以滲透，對非專一性的大分子不可滲透，達(dá)到了對液滴外分子屏蔽，對液滴內(nèi)分子保護(hù)的功能。(5)液滴提供擁擠的環(huán)境，高粘度低擴(kuò)散系數(shù)穩(wěn)定了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)相互作用。液-液相分離聚集體所提供的擁擠環(huán)境在有些體系中會對酶的構(gòu)象產(chǎn)生影響，從而影響酶的活性，在cGAS聚集體中cGAS被激活；而在進(jìn)入應(yīng)激顆粒(stress granules)中mTORC1的活性被抑制。(6)靜電作用是多數(shù)細(xì)胞內(nèi)液液相分離發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動力，因此改變帶電狀態(tài)的翻譯后修飾可以靈活高效地調(diào)控相分離的發(fā)生，這一特點將在下一節(jié)中更詳細(xì)闡述。(7)液滴表面張力驅(qū)動機(jī)械力的產(chǎn)生。

8 生物分子相分離的調(diào)控機(jī)制和調(diào)控分子設(shè)計

圖3 生物分子液液相分離的物理化學(xué)性質(zhì)決定了其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著各種重要的生物學(xué)功能Fig.3 The physicochemical properties of biomolecular liquid-liquid phase separation determine that they play various important biological functions in cells.

8.1 生物分子相分離的體內(nèi)調(diào)控機(jī)制

生命體體內(nèi)的生物分子相分離過程受到精細(xì)的調(diào)控，以適應(yīng)環(huán)境改變、生命活動周期性的變化。體內(nèi)相分離過程的調(diào)控主要包括以下幾種可能方式：

(1)通過翻譯后修飾改變參與相分離的生物分子的帶電性質(zhì)。最主要的是通過激酶催化的絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸的磷酸化，及磷酸酶催化的去磷酸化改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)，調(diào)控其聚集或溶解。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMTs)將一個或多個S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)上的甲基轉(zhuǎn)移到精氨酸的胍基上，如PRMT調(diào)控hnRNPA2或Ddx4的RGG結(jié)構(gòu)域的精氨酸甲基化，實驗表明不對稱的甲基化顯著削弱胍基與芳香環(huán)的相互作用從而影響相分離的發(fā)生8,47。乙?；?去乙酰化酶催化賴氨酸末端乙?；蛉ヒ阴；瘡亩淖兊鞍椎膸щ姞顟B(tài)，如去乙酰化酶HDAC6催化stress granule中DDX3XN端天然無序結(jié)構(gòu)域的乙?；嚢彼崛ヒ阴；?，從而促進(jìn)相分離液滴的形成100。多泛素化修飾通過形成與泛素結(jié)合蛋白的多價作用，實現(xiàn)凝聚。

(2)通過改變參與相分離的生物分子的濃度。細(xì)胞通過激活/抑制基因的表達(dá)、改變mRNA可變剪接的方式，以及調(diào)整降解速率等改變總體濃度，或是通過定向輸運(yùn)等方式改變局部濃度。

(3)通過調(diào)控蛋白質(zhì)的寡聚狀態(tài)。對于通過寡聚實現(xiàn)多價作用的體系，可以通過加強(qiáng)或干擾寡聚狀態(tài)的方式調(diào)控其相分離的能力。

(4)對于局部溶液環(huán)境敏感的相分離體系，可以通過調(diào)整這些溶液環(huán)境值影響相分離，如pH值，金屬離子濃度，ATP濃度等。例如酵母細(xì)胞在饑餓壓力下，pH值降低使stress granule生成。ATP作為細(xì)胞內(nèi)的高濃度、高電荷分子，在細(xì)胞內(nèi)充當(dāng)重要助溶作用，實驗表明ATP可以顯著地減少FUS的聚集，促進(jìn)其聚集體的溶解101。

8.2 設(shè)計小分子調(diào)控生物分子相分離

設(shè)計小分子干預(yù)調(diào)控生物分子相分離過程可以依靠以上調(diào)控方式實現(xiàn)，其中最主要的是通過設(shè)計相關(guān)翻譯后修飾酶的調(diào)控分子來實現(xiàn)對相分離過程的調(diào)控。例如，Wippich等人88通過基于成像的篩選方法得到的抑制stress granule溶解的抑制劑大都是激酶的抑制劑，它們通過調(diào)控激酶的活性，來調(diào)控相分離基架蛋白的磷酸化狀態(tài)，從而影響相分離。Aumiller和Keating設(shè)計了體外通過激酶/磷酸酶的磷酸化和去磷酸控制多肽可逆地聚集、溶解的體系，他們通過控制ATP的量控制激酶活性，通過控制Mn2+的濃度控制磷酸酶的活性102。相分離調(diào)控分子的設(shè)計的另外的思路是設(shè)計分子直接結(jié)合調(diào)控蛋白構(gòu)象、或者影響天然無序蛋白質(zhì)的構(gòu)象系綜以及多價作用的能力，干擾相分離的發(fā)生。1,6-己二醇分子是目前應(yīng)用廣泛的生物分子液-液相分離的非專一性抑制劑103，可能的機(jī)制就是影響了天然無序蛋白的構(gòu)象系綜。多聚物poly(ADP-ribose) (PAR)的性質(zhì)與核酸類似，在細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)控與核酸相關(guān)的相分離過程。Altmeyer等人發(fā)現(xiàn)在DNA損傷部位PAR水平顯著提高，并促進(jìn)FUS等含RGG結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相分離形成聚集體81。McGurk等人發(fā)現(xiàn)多聚物PAR結(jié)合于TDP-43的PAR結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后可以促進(jìn)TDP-43的相分離，在果蠅體內(nèi)促進(jìn)TDP-43富集進(jìn)入stress granule，從而保護(hù)該蛋白不發(fā)生疾病相關(guān)的磷酸化修飾104。Jin等人105揭示了天然無序蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的動態(tài)特征，Yu等人106發(fā)展了針對天然無序蛋白質(zhì)構(gòu)象系綜進(jìn)行配體分子設(shè)計的方法，為相分離調(diào)控分子的設(shè)計提供了重要參考。此外設(shè)計小分子化合物調(diào)控相分離的重要功能客體分子進(jìn)入聚集體也有重要的價值。例如Fang等人107篩選發(fā)現(xiàn)了小分子化合物可以在細(xì)胞內(nèi)阻止TDP-43進(jìn)入應(yīng)激顆粒，從而抑制肌萎縮性側(cè)索硬化與額顳部癡呆(ALS/FTD)病變中TDP-43蛋白在神經(jīng)細(xì)胞中的累積。

9 總結(jié)與展望

生物分子相分離在生命活動中扮演著富集、屏蔽、開關(guān)、定位、生力等重要功能，這些功能與生物分子相分離的協(xié)同性、液滴的動態(tài)性、專一的招募滲透性、較高密度和粘度等物理化學(xué)性質(zhì)緊密聯(lián)系的。這些物理化學(xué)性質(zhì)的微觀基礎(chǔ)是相分離各組分之間的弱而多價的相互作用，以及天然無序蛋白質(zhì)、無序連接鏈、以及單鏈核酸的構(gòu)象柔性等。序列突變、核磁共振等微觀結(jié)構(gòu)測量實驗、以及分子模擬等研究手段已經(jīng)開始揭示生物分子序列、結(jié)構(gòu)與相分離條件和聚集體性質(zhì)之間的關(guān)系，為深入理解生命體怎樣通過相分離實現(xiàn)復(fù)雜功能提供了定量或定性的數(shù)據(jù)支持。實現(xiàn)對生物分子相分離過程的精準(zhǔn)調(diào)控、干預(yù)相分離相關(guān)的疾病過程24是相分離研究的重要目的，設(shè)計翻譯后修飾酶的調(diào)控分子或是設(shè)計構(gòu)象調(diào)控分子是調(diào)控生物分子相分離的主要手段。

生物分子相分離過程所展現(xiàn)的普遍性表明當(dāng)前所發(fā)現(xiàn)的生命體內(nèi)的相分離分子可能只是冰山一角，未來需要從基因組及蛋白質(zhì)組的層次系統(tǒng)地發(fā)掘生命過程中的相分離事件和相關(guān)分子，整理出生命系統(tǒng)虛(溶液分散相)-實(聚集相)轉(zhuǎn)換的條件和調(diào)控途徑。更深入地理解生物分子序列、結(jié)構(gòu)與相分離條件和聚集體性質(zhì)之間的關(guān)系，可以從構(gòu)建新的模式體系、采用更精確定量的實驗方法、以及更準(zhǔn)確的分子模擬方法這些方面入手。以可極化力場為代表的新一代生物分子力場108,109提供了更為可靠的靜電作用、偶極作用、π-π作用110等這些在相分離體系中最關(guān)鍵的分子間相互作用力的計算方法，有可能為生物分子聚集現(xiàn)象展現(xiàn)出不同于經(jīng)典力場的圖景，比如更為顯著的分子協(xié)同性。另外利用更準(zhǔn)確的力場研究天然無序蛋白質(zhì)的構(gòu)象系綜，并設(shè)計分子改變其構(gòu)象系綜111，從而改變天然無序蛋白質(zhì)的相分離行為，可能是專一性地直接調(diào)控相分離的有效方法。