★ 夏漢庭 曹端廣 楊佛 李威 王書豪 劉璞 楊文龍 楊鳳云**（.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是多種因素共同作用下導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨纖維化、皸裂、潰瘍、脫失，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、畸形、功能障礙等一系列臨床癥狀的關(guān)節(jié)退行性疾病［1-2］。65 歲以上人群中OA 發(fā)生率50%，其中，8.1%為癥狀性KOA，且呈上升趨勢［3-4］。目前西醫(yī)除手術(shù)治療外無特效治療［5］，非甾體抗炎藥僅可對癥治療且副作用大。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）降解所致軟骨退變是KOA病理過程的核心。臨床研究顯示，加味陽和湯能夠改善KOA 癥狀并延緩軟骨退變［6-7］。為進(jìn)一步探究加味陽和湯的軟骨保護(hù)機(jī)制，本研究擬觀察加味陽和湯對碘乙酸（mono-iodoacetic acid，MIA）誘導(dǎo)KOA 大鼠模型中軟骨保護(hù)作用及對IL-1β途徑的誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）與II 型膠原酶（collagen II，Col2a）的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 SPF 級雌性SD 大鼠12 只，體重（200±20）g，5 周齡，江西中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)動物實驗科技中心，許可證號：SCXK（贛）2018-003。隨機(jī)分組為空白組、模型組、加味陽和湯給藥組。本動物實驗步驟經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，并符合國家科學(xué)技術(shù)委員會《實驗動物管理條例》之相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物及儀器

1.2.1 藥物與試劑 熟地15g、肉桂10g、麻黃10g、鹿角膠10g、木瓜8g、炮姜6g、白芥子10g、雞血藤20g、漢防己10g、甘草3g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，鑒定符合2010 年《中華人民共和國藥典》規(guī)定。由江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心進(jìn)行藥品制備。生藥經(jīng)水煎、超濾濃縮、冷卻、蒸干制為藥粉，每100g生藥得26g 藥粉。分別按100，200，400，800，1000μg/mL 加入含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基用于后續(xù)實驗。

碘乙酸（麥克林，I811707）、戊巴比妥鈉（Sigma，57-33-0）、RIPA 試劑（Solarbio，R0020），PMSF（Sigma，93482-50ML-F），β-actin 小 鼠 單克 隆 抗 體（abcam，ab8226）、MMP-3 兔 單 克 隆抗體（abcam，ab52915）、MMP-9 兔單克隆抗體（abcam，ab76003），MMP-13 兔多克隆抗體（abcam，ab39012）一抗抗體，Col2a 兔單克隆抗體（abcam，ab188570），HRP 標(biāo)記兔抗（Proteintech，SA00001-4）及HRP 標(biāo)記小鼠抗（Proteintech，SA00001-1）二抗抗體，超敏ECL 發(fā)光液（Proteintech，B500024），DMEM 低 糖 培 養(yǎng) 基（Solarbio，31600），胎 牛 血清（Gibco，10099-141），0.25%胰 酶-EDTA 溶 液（Solarbio，T1320），II 型膠原酶（Solarbio，C8150），MTT（Solarbio，M8180），蘇 木 素 染 液（Solarbio，G4441），伊紅染液（Solarbio，G1108），番紅O 染液（Solarbio，G2540），固綠染液（Solarbio，G1663）。

1.2.2 儀器 垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-rad，1658033），凝膠顯像儀（Biorad，ChemiDoc MP），水平搖床（北京市六一儀器廠，WD-9405D），倒置顯微鏡（奧林巴斯，CX31），酶標(biāo)儀（Tecan，SPARK），離心機(jī)（貝克曼，Optima）。

1.3 動物實驗 結(jié)合Udo 等［8］已報道的方法，大鼠常規(guī)腹腔注射2% 戊巴比妥鈉麻醉，右膝關(guān)節(jié)備皮，屈曲膝關(guān)節(jié)，消毒，關(guān)節(jié)腔注射含有1mg MIA的50μL 生理鹽水溶液，空白組為50μL 生理鹽水，1周1 次，連續(xù)4 周。見軟組織明顯腫脹且體表骨性標(biāo)志不明顯，即造模成功。飼養(yǎng)環(huán)境12h 晝夜循環(huán)，自由飲食及活動。第5 周起予以藥物干預(yù)。加味陽和湯組予以5.32g/kg 加味陽和湯藥粉溶解于3mL 10%DMSO 溶液灌胃，一日一次，連續(xù)8 周?？瞻捉M及模型組予以同等劑量10%DMSO 溶液。第12 周后，脫頸處死所有大鼠，取右下肢膝關(guān)節(jié)用于后續(xù)實驗。

1.4 細(xì)胞實驗

1.4.1 細(xì)胞提取及培養(yǎng) 取SPF 級3 周齡SD 大鼠，常規(guī)腹腔麻醉后脫頸處死，乙醇浸泡消毒后于超凈臺內(nèi)取雙膝關(guān)節(jié)軟骨，PBS 洗3 次，剪碎，加入0.25%胰酶于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化1h 后終止消化。加入0.2%膠原酶置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化4h。鏡下見單個游離細(xì)胞后終止消化，150 目濾篩濾后移入25cm3培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。匯合度達(dá)到80%時傳代。結(jié)合文獻(xiàn)方法［9］對第三代軟骨細(xì)胞行甲苯胺藍(lán)染色法鑒定并進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4.2 MTT 比色法篩選最佳干預(yù)條件 第三代軟骨細(xì)胞以5×103/孔種植于96 孔板，貼壁后血清饑餓24h，梯度濃度加味陽和湯（100，200，400，800，1000μg/mL）加入血清培養(yǎng)基內(nèi)分別干預(yù)24h，48h 及72h。另設(shè)不含細(xì)胞的調(diào)零孔及不含中藥的對照孔。干預(yù)后加入10μL 0.5%MTT 溶液并置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO 溶液，中速搖晃15min。使用酶標(biāo)儀在570nm 測定吸光度后依據(jù)下列公式計算細(xì)胞增殖度：（平均觀察孔OD 值-平均調(diào)零孔OD 值）/（平均對照孔OD 值-平均調(diào)零孔OD 值）×100%。

1.4.3 細(xì)胞干預(yù) 第三代軟骨細(xì)胞按5×106/孔種植于六孔板中，貼壁后即饑餓24h。分為溶媒組，IL-1β 組及梯度濃度加味陽和湯給藥組。給藥組予以梯度濃度加味陽和湯（100，200，400μg/mL）干預(yù)24h 后，給藥組及IL-1β 組加入10ng/ml IL-1β誘導(dǎo)12h，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.5 Western Blot 檢測MMP-3、MMP-9、MMP-13

及Col2a 按150μL/孔加入RIPA 溶液，刮取細(xì)胞后，超聲3 次，5s/次，孵育30min，4℃ 14000RPM 離心離心20min，取上清。BCA 定量后加入Loading Buffer 煮沸變性，-20℃保存。上樣前4℃離心，取上清上樣至SDS-PAGE 凝膠，電泳，恒流轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜后，5% 脫脂奶粉溶液封閉1h，4℃孵育一抗，室溫孵育二抗，TBST 洗膜4 次后滴加ECL顯影液，顯像。以內(nèi)參條帶灰度值為標(biāo)準(zhǔn)將目的蛋白灰度值歸一化處理后比較相對趨勢。

1.6 病理切片觀察 大鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定72h，流水沖洗過夜，20%EDTA 脫鈣21d 至針刺無阻力，梯度乙醇脫水后二甲苯透明，石蠟包埋，按5μm 切片。常規(guī)脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，水洗。蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosin staining，HE）染色切片浸于蘇木精染色液中5min，水洗后浸于伊紅染色液中5min，水洗，透明樹膠封片。番紅O-固綠（safranning O-Fast green）染色切片浸于固綠染液中5min，1%冰醋酸洗15s，番紅O 染液5min，無水乙醇脫水，透明樹膠封片。置于正置顯微鏡下觀察并依據(jù)Lee 等［10］報道進(jìn)行改良Mankin 法評分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行t檢驗及ANOVA分析，P＜0.05 有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 動物實驗過程中無大鼠死亡?？瞻捉M大鼠在假造模后注射處稍敏感，抗拒觸摸、按壓注射處，精神、活動、進(jìn)食情況可。模型組及給藥組均右下肢跛行，站立取食頻次降低，精神不佳，活動減少。造模后可見膝關(guān)節(jié)軟骨明顯退變、潰瘍、脫失，合并滑膜增厚，與KOA 軟骨退變特點(diǎn)一致，表明造模成功（圖1）。模型組及給藥組均隨干預(yù)進(jìn)程出現(xiàn)不同程度恢復(fù)，其中給藥組精神、活動情況改善優(yōu)于模型組。

圖1 造模組與空白組軟骨退變對比

2.2 軟骨細(xì)胞形態(tài)特征及染色鑒定

圖2 鏡下觀察軟骨及甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

原代軟骨細(xì)胞24h 左右即可貼壁，可見少量細(xì)胞呈多角形或不規(guī)則狀緩慢生長，傳代后增殖速度變快原代約需6d 可傳至下一代，隨后每代需3～4d。第四代后逐漸失去軟骨細(xì)胞形態(tài)特征。甲苯胺藍(lán)染色如圖2 所示，細(xì)胞核呈深藍(lán)，胞漿及間質(zhì)呈淡藍(lán)色，表明提取及培養(yǎng)所得為軟骨細(xì)胞且純度較好，可用于后續(xù)實驗。

2.3 MTT 比色法篩選最佳干預(yù)條件 MTT 結(jié)果顯 示，800μg/mL 及1000μg/mL 組 軟 骨 細(xì) 胞 增 殖度 在24h，48h 及72h 條 件 下 均 低 于100，200，400μg/mL 組。各濃度組在培養(yǎng)48h 及72h 時，細(xì)胞增殖度均低于各自相應(yīng)濃度組培養(yǎng)24h 的細(xì)胞增殖度。且48h 及72h 各濃度組內(nèi)均出現(xiàn)不同程度軟骨細(xì)胞生長抑制（P＜0.05）。因此，800μg/mL 及1000μg/mL 組及48h、72h 的培養(yǎng)時長不適用于后續(xù)實驗，故本實驗選取100，200，400μg/mL 加味陽和湯干預(yù)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)24h 為干預(yù)條件（圖3）。

圖3 MTT比色法篩選不同濃度加味陽和湯干預(yù)軟骨細(xì)胞條件

2.4 MMP-3、MMP-9、MMP-13 及Col2a 蛋 白 表達(dá)水平比較 IL-1β 組MMP-3、MMP-9、MMP-13及Col2a 表達(dá)與空白組均有顯著差異（P＜0.001）。100，200，400μg/mL 加味陽和湯干預(yù)后顯示，加味陽和湯干預(yù)24h 能降低軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-3、MMP-9及MMP-13表達(dá)，提高Col2a蛋白表達(dá)。其中，400μg/mL 組相比100μg/mL 及200μg/mL 組干預(yù)效果更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4，表1）。

圖4 不同濃度加味陽和湯對軟骨細(xì)胞MMPs及Col2a表達(dá)的影響

表1 各組MMPs及Col2a指標(biāo)表達(dá)情況（，n=3）

表1 各組MMPs及Col2a指標(biāo)表達(dá)情況（，n=3）

注：與空白組相比，&P＜0.05，&P＜0.01，&P＜0.001；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與加味陽和湯高劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

組別 MMP-3 MMP-9 MMP-13 Col2a溶媒組 0.273±0.039 0.272±0.017 0.242±0.149 1.911±0.229模型組 2.127±0.288&&& 2.016±0.217&&& 2.504±0.543&&& 0.338±0.157&&&低劑量組 1.492±0.159**### 1.449±0.167***### 1.557±0.199**## 0.683±0.138##中劑量組 0.711±0.153*** 0.671±0.063*** 0.836±0.39*** 0.832±0.273*#高劑量組 0.475±0.193*** 0.445±0.041*** 0.242±0.186*** 1.337±0.311***

2.5 組織病理觀察 空白組軟骨面顏色鮮亮，平整，軟骨細(xì)胞排列有序，無明顯列席，膠原纖維走向齊整，無血管翳，未見波浪狀斷裂；模型組鏡下可見軟骨整體波浪狀斷裂，凹凸不平，各層軟骨均可見軟骨細(xì)胞壞死、排列紊亂，裂隙深達(dá)至中間層，基質(zhì)可見沿膠原纖維走向撕裂，鈣化軟骨層纖維樣變、血管翳、潮線增寬。加味陽和湯給藥組軟骨淺表層面基本光滑平整，未見明顯深達(dá)中間層裂隙；可見基質(zhì)層及鈣化軟骨層內(nèi)有部分軟骨細(xì)胞均勻排列，血管翳大多消失（圖5 和表2）。

圖5 加味陽和湯對軟骨面的保護(hù)作用

表2 軟骨組織病理切片改良Mankin評分（，n=4）

表2 軟骨組織病理切片改良Mankin評分（，n=4）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別 溶媒組 模型組 給藥組結(jié)構(gòu)改變 0.21±0.06 3.93±0.30* 1.72±0.17#軟骨細(xì)胞改變 0.22±0.11 2.37±0.39* 1.19±0.21#番紅區(qū)改變 0.36±0.10 2.61±0.41* 1.29±0.37#潮線 0.14±0.06 0.67±0.21* 0.33±0.16#總分 0.92±0.14 9.55±1.21* 4.60±0.63#

3 討論

KOA 可歸于中醫(yī)學(xué)之“骨痹”范疇。《素問·痹論》有云：“痹在骨則重……在于皮則寒?！边@一論述高度的概括了痹病的臨床表現(xiàn)。許鴻照教授認(rèn)為，中老年腎失封藏，腎陽不足。腎陽虛則溫煦失職，不能氣化，陰寒內(nèi)凝于肢體關(guān)節(jié)，鼓動血行不利而逐漸成瘀，氣化失司則體內(nèi)津液內(nèi)聚為痰濕之邪，三者共成“寒、痰、瘀”實邪為標(biāo)，實邪一成，不通則痛。故許鴻照教授在清代名方陽和湯的基礎(chǔ)上，配伍舒筋活絡(luò)之雞血藤、木瓜、漢防己以治療KOA 收獲滿意效果。方中熟地大補(bǔ)陰血，鹿角膠填精補(bǔ)髓，強(qiáng)筋壯骨；肉桂、炮姜溫陽散寒解，麻黃開腠理以達(dá)表；白芥子祛經(jīng)絡(luò)及皮里膜外之痰；雞血藤補(bǔ)血、活血、祛瘀，木瓜祛風(fēng)除溫，舒筋活絡(luò)；漢防已利水消腫，止痛，甘草調(diào)和諸藥。全方共奏溫陽通絡(luò)之效，故通則不痛矣。前期研究表明，加味陽和湯可延緩KOA 患者軟骨退變［6］。我們推測該效果是由于下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族這一系列促軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵基因的表達(dá)而產(chǎn)生的。

軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度降解與軟骨細(xì)胞凋亡形成惡性循環(huán)是KOA 病理過程的主要特點(diǎn)。軟骨組織由軟骨細(xì)胞及ECM共同組成，軟骨細(xì)胞僅占不足10%，其余均為ECM及水。軟骨組織的功能主要由軟骨細(xì)胞分泌的ECM 中排列有序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)提供。研究表明，軟骨細(xì)胞主要功能是分泌ECM，同時ECM 又可反饋作用于軟骨細(xì)胞，兩者處于動態(tài)平衡［11］。ECM 由膠原、非膠原糖蛋白、氨基多糖與蛋白聚糖及彈性蛋白組成。其中，氨基多糖可與甲苯胺藍(lán)反應(yīng)，且與ECM 中氨基多糖含量變化而變化，故可用甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞。研究表明［12］，II 型膠原（collagen II，Col2a）是構(gòu)成ECM 框架并提供抗壓縮性能的標(biāo)志性物質(zhì)，可作為評價軟骨細(xì)胞及ECM 完整性的關(guān)鍵指標(biāo)。OA 發(fā)展時伴有ECM 中蛋白多糖濃度不斷下降，Col2a 的降解導(dǎo)致網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)纖維方向發(fā)生改變，也降低了對蛋白多糖的限制作用，共同導(dǎo)致ECM 降解，軟骨逐漸退變，產(chǎn)生KOA 臨床癥狀。

MMPs 是ECM 降解過程中的核心因素。MMPs與纖維蛋白溶酶共同作用下對幾乎所有軟骨ECM中蛋白多糖具有高裂解活性［13-14］。研究顯示，阻斷或降低MMP 家族的表達(dá)，可延緩關(guān)節(jié)軟骨降解［15-16］。MMPs 不同亞型MMP 對各基質(zhì)成分的降解能力有所差異，這些不同亞型在KOA 過程中即可各自作用，也可相互協(xié)作共同降解軟骨［17］。其中較為重要的有是MMP-3、9 及13。MMP-3 除直接降解ECM 外，另可激活MMP-9、MMP-13等酶原產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，協(xié)同作用于ECM［18］。MMP-9 可破壞ECM，暴露抗原，碎裂膠原使得其更易為MMP-3 降解。MMP-3 和MMP-9 相互作用導(dǎo)致膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)失去其原有堅固特性，最終致使軟骨退變［19］。MMP-13 在MMPs 中具有對II 型膠原最強(qiáng)的降解能力，在降解ECM 過程中處于關(guān)鍵地位。其降解速度是I 型膠原的5 倍，III 型膠原的6 倍［20］。

本實驗結(jié)果表明，加味陽和湯可下調(diào)軟骨細(xì)胞中異常增高的MMP-3、9、13，從而保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)并上調(diào)Col2a 表達(dá)。同時動物實驗病理切片結(jié)果表明，加味陽和湯可延緩軟骨組織降解。本實驗進(jìn)一步證實了MMPs 是軟骨降解的核心因素，并表明加味陽和湯通過下調(diào)MMPs 進(jìn)而發(fā)揮軟骨保護(hù)作用可能是其作用機(jī)制之一。這一發(fā)現(xiàn)為臨床運(yùn)用加味陽和湯治療KOA 提供了理論基礎(chǔ)，但其與上游信號通路的關(guān)系仍需進(jìn)一步探究。