高雪，王偲博，李正洋，楊寶菊，飛進強，劉雅婷*

1 云南農(nóng)業(yè)大學，農(nóng)學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2 云南省測繪地理信息局地圖院，云南 昆明 650034

煙草，是云南省的一種重要的經(jīng)濟作物，其種植面積和產(chǎn)量位居中國首位[1]。然而，正番茄斑萎病毒屬病毒（Orthotospoviruses）是一類重要的植物病原物，嚴重危害云南煙草產(chǎn)業(yè)，屬于正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus），番茄斑萎病毒科（Tospoviridae），布尼亞病毒目（Bunyavirales）[2]。煙草感染正番茄斑萎病毒屬病毒后，出現(xiàn)煙葉壞死、畸形、褪綠、頂芽壞死等癥狀，影響煙草的經(jīng)濟效益[3]。Orthotospovirus屬病毒主要通過薊馬以持久增殖型方式傳播[4]，在田間可傳播該屬病毒的薊馬屬于纓翅目（Thysanoptera）薊馬科（Thripidae）的花薊馬屬（Frankliniella）和薊馬屬（Thrips），主要有西花薊馬（Frankliniella occidentalis）、花薊馬（Frankliniellaintonsa）、棕櫚薊馬（Thrips palmi）、煙薊馬（Thrips tabaci），細角帶薊馬（Taeniothrips eucharii）[5]等，鄭雪[6]等人研究發(fā)現(xiàn)，云南省煙田中正番茄斑萎病毒屬病毒的傳毒薊馬主要是煙薊馬和花薊馬等。

1915 年，Brittlebank 在澳大利亞的番茄植株上發(fā)現(xiàn)了一種新的病害癥狀“斑駁、萎蔫”，這是關于番茄斑萎病毒病的最早描述[7]。1930 年，Samuel[8]等人確定了引起這種癥狀的原因是由于病毒侵染，將該病毒命名為“番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV)”。截止目前，該屬有31 種病毒被發(fā)現(xiàn)及鑒定，其中18 個確定種和13 個暫定種[9]。Orthotospovirus 屬病毒粒子呈球狀，直徑約為80-120 nm；粒體外層由一層脂質(zhì)包裹，脂質(zhì)由兩種被稱為糖蛋白（Glycoprotein，Gn/Gc）的多糖蛋白組成；脂膜內(nèi)部為核殼體蛋白（Nucleocapsid protein，N）構成的病毒衣殼[10]。N 蛋白是Orthotospovirus屬病毒中最保守的蛋白，N 蛋白序列相似值是用于鑒定種和血清組劃分的主要依據(jù)[11]。Orthotospovirus屬病毒寄主范圍廣泛，其代表種番茄斑萎病毒（Tomatospotted wilt virus，TSWV) 每年可造成達10 億美元的巨大經(jīng)濟損失，已被列為世界危害最大的10 種植物病毒之一[12]。近年來，RT-PCR 檢測是診斷鑒定Orthotospovirus屬病毒的重要方法[13]，同時，可以通過制備高效價的核殼體蛋白抗體進行該屬病毒種類的檢測[14]。

在煙草上，國內(nèi)最早是1992 年姚革[15]在四川的曬煙上發(fā)現(xiàn)TSWV，2010 年Dong[16]等人報道了TSWV 侵染云南煙草，2011 年蔡健和[17]等人首次報道番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV ）侵染中國廣西煙草，同年張仲凱[18]等人報道TZSV 侵染云南煙草，2012 年劉雅婷等[19]發(fā)現(xiàn)云南文山和楚雄煙草上感染了馬蹄蓮褪綠斑病毒（Calla lily chlorotic spot virus，CCSV）。由此可見，煙草上Orthotospovirus屬的病毒種類在增加。

本研究自2012 年以來對云南省煙草種植區(qū)的病害進行調(diào)查，采集疑似感染Orthotospovirus屬病毒的煙草樣品。采用酶聯(lián)免疫吸附測定和RT-PCR 方法鑒定，生物信息學分析序列并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定侵染煙草的正番茄斑萎病毒屬病毒的種類。為云南省正番茄斑萎病毒屬病毒的防控提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

圖1 煙草樣品采集地點分布圖Fig. 1 Distribution of tobacco sample collection sites

2012 以來，從云南省昭通、昆明、曲靖、玉溪、楚雄、紅河、臨滄、保山、大理和麗江地區(qū)共采集38份疑似Orthotospovirus屬病毒癥狀的煙草樣品（圖1），主要癥狀有煙葉畸形、褪綠、壞死等。

1.2 血清檢測

血清檢測所用的抗體：番茄斑萎病毒（TSWV，血清組Ⅰ）、鳳仙花壞死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus，INSV，血清組Ⅲ）、鳶尾黃斑病毒（Iris yellow spot virus，IYSV），番茄褪綠斑病毒（Tomato chlorotic spot virus，TCSV，血清組Ⅱ）＆花生環(huán)斑病毒（Groundnut ring spot virus，GRSV，血清組Ⅱ），西瓜銀色斑駁病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV，血清組Ⅳ）＆花生芽壞死病毒（Groundnut bud necrosisvirus，GBNV，血清組Ⅳ）5 種病毒酶聯(lián)檢測試劑盒購自美國 Agdia 公司。辣椒褪綠病毒（Capsicum chlorosis virus，CaCV）、番茄環(huán)紋斑點病毒（TZSV）、馬蹄蓮褪綠斑病毒（CCSV）、朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspotvirus，HCRV）這4 種病毒的抗體由課題組委托武漢三鷹生物技術有限公司制備。

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附和間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測TSWV，INSV，IYSV，TCSV＆ GRSV，WSMoV ＆ GBNV，CaCV，TZSV，CCSV，檢測步驟參照ELISA 試劑盒說明書。以健康植株為陰性對照，樣品OD 值/陰性對照OD 值大于2 為陽性反應，OD 值是利用酶標儀在450 nm 和415 nm 波長下測定。

1.3 RT-PCR 檢測及測序

PCR檢測引用3對正番茄斑萎病毒屬通用引物[20,21]和6對由課題組設計特異性N基因引物[22]，具體見（表1）。采用RNA提取試劑盒（全式金，北京）提取38個煙草樣本的總RNA，用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit （TaKaRa，大連）合成cDNA。在PCR反應管中配置20 μL反應體系為：cDNA 1 μL，F(xiàn)orward Primer （10 μM）1 μL，Reverse Primer（10 μM）1 μL，Prime STAR Max DNA Polymerase 10 μL，ddH2O補充至20 μL。然后分裝到各個PCR反應管中進行目的片段擴增。PCR反應程序為：98℃ 10s；98℃ 20s，50℃ 1-2 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃ 保存。將獲得的PCR產(chǎn)物用1.2% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，與DNA Maker條帶比較，確定出現(xiàn)目的條帶的大小。割膠純化之后，進行克隆轉化，測序，獲得病毒的N基因序列。

表1 用于煙草樣品中病毒鑒定的RT-PCR 引物Tab. 1 RT-PCR primers used for virus identification in tobacco samples

1.4 構建系統(tǒng)發(fā)育樹

測序返回的煙草樣品的N 基因序列，使用MEGA 7.0 軟件打開測序公司測序結果的.ab1 文件；觀察文件中信號是否單一，是否出現(xiàn)雜峰，重疊峰等現(xiàn)象。如果出現(xiàn)雜峰和重疊峰，則表明該測序結果不可用，需要重新測序；導出FASTA 格式文件；序列分析，刪除載體序列；BLAST 序列結果。將分離的21個N 基因序列和從National Center for Biotechnology Information website （NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih. gov/）下載的正番茄斑萎病毒屬的31 種病毒的N 基因序列進行分析，31 種病毒N 基因序列分別是TNSV （登錄號KM355773.1），TNeV （登錄號AY647437.1），PhySMV（ 登 錄 號AF067151.1），MSMV （登 錄 號EU275149.1），GRSV （登 錄 號AF251271.1），ANSV （ 登 錄 號GQ478668.1），ZLCV （ 登 錄 號NC031759.1），MVBaV （ 登 錄號NC026619.1），TNRV（ 登 錄 號FJ489600.2），LNRV （ 登 錄 號AB852525.1），PCSV （ 登 錄 號KF383956.1），WSMoV（ 登 錄 號NC003843.1），WBNV （登錄號GU584184.1），TSWV（登錄號JN664252.1），TZSV （ 登 錄 號NC010489.1），TYRV（登錄號AY686718.1），BeNMV （登錄號NC_018071.1），SVNaV （登錄號HQ728387.1），PolRSV（登 錄 號KJ541744.1），PYSV （登 錄 號AF013994.1），PCFV（ 登 錄 號AF080526.1），MYSV（ 登 錄 號NC008300.1），IYSV（ 登 錄 號AF001387.1），INSV（登錄號GU112504.1），PNSV（登錄號HE584762.1），GBNV（登錄號NC003619.1)，CSNV（ 登 錄 號AB600873.1），CCSV（ 登 錄 號AY867502.1），CaCV（ 登 錄 號NC008301.1），HCRV（ 登 錄 號JX833564.1），TCSV（ 登 錄 號AF282982.1）。選用MEGA 7.0 中集成的Clustal W進行多序列比對，通過Neighbor-Joining 法進行系統(tǒng)發(fā)育分析，Bootstrap 為1,000 次。

2 結果

2.1 血清鑒定結果

血清檢測結果顯示，38 份煙草樣品中有16 份樣品檢測出Orthotospovirus屬病毒，16 份樣品檢測出17 份Orthotospovirus屬病毒的分離物，CaCV 0 份，TZSV 2 份，CCSV 2 份，HCRV 3 份，TSWV 10 份，INSV 0 份，IYSV 0 份，TCSV＆GRSV 0 份，WSMoV＆GBNV 0份，其中NT-16 是TSWV 和HCRV 復合侵染（表2）。

2.2 RT-PCR 鑒定結果

RT-PCR 檢測結果顯示，38 份煙草樣品中有20份樣品感染Orthotospovirus 屬病毒，其中TSWV 單獨侵染的樣品11 份，集中在昆明市、玉溪市、曲靖市、昭通市、楚雄州和紅河州；HCRV 單獨侵染樣品4 份，集中在保山市、昭通市；TSWV&HCRV 復合侵染1 份在曲靖市；TZSV 單獨侵染2 份在昆明市；CCSV 單獨侵染樣品2 份在麗江市和昭通市（表2）。

2.3 煙草上正番茄斑萎病毒屬病毒N 基因的進化分析

圖2 Orthotospovirus 屬病毒N 基因序列的系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on N gene of Orthotospoviruses

表2 煙草樣品中Orthotospovirus 屬病毒種類鑒定結果Tab. 2 Identification of Orthotospoviruses in tobacco samples

如系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）所示，12 份煙草樣品的分離物與TSWV 相似度達到93%，5 份煙草樣品的分離物與HCRV 相似度達到98%，2 份煙草樣品的分離物與TZSV 相似度達到94%，2 份煙草樣品的分離物與CCSV 相似度達到97%。由此可見，系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結果和RT-PCR 的檢測結果相一致。

3 討論

自1989 年在我國廣州珠江三角洲的花生上發(fā)現(xiàn)TSWV 以來[23]，在四川[15]、云南[24]、北京[25]、貴州[26]、寧夏[27]、天津[28]、山東[29]、重慶[30]、湖北[31]、黑龍江[32]等 14 個地區(qū)報道Orthotospovirus屬病毒的發(fā)生，Orthotospovirus屬病毒的自然寄主包括煙草、辣椒、番茄、甜瓜、西瓜、萵苣、蜘蛛蘭、鳶尾和蝴蝶蘭等經(jīng)濟作物。由于云南省具有生物多樣性、以及豐富的氣候資源和傳播介體種類為正番茄斑萎病毒屬病毒的發(fā)生、傳播提供條件[33]，我國現(xiàn)已報道Orthotospovirus屬病毒有12 種，其中云南有8種，包括番茄斑萎病毒（TSWV）[34]、鳳仙花壞死斑病毒（INSV）[35]、馬蹄蓮褪綠斑病毒（CCSV）[19]、番茄環(huán)紋斑點病毒（TZSV）[36]、朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（HCRV）[37]、花生環(huán)斑病毒（GRSV）[24]，辣椒褪綠斑病毒（Pepper chlorotic spot virus，PCSV)[38]和西瓜銀色斑駁病毒（WSMoV）[39]，其中 TSWV 在云南番茄上發(fā)病最為嚴重，平均檢出率為 13.11%[40]。云南省是我國Orthotospovirus屬病毒種類最多、發(fā)病最嚴重的區(qū)域。

近年來，煙草上由薊馬傳播的正番茄斑萎病毒屬病毒引起的煙草斑萎病危害日趨嚴重[6]，造成極大的經(jīng)濟損失。由于云南省氣候多樣，而且干旱范圍增加、程度的加深等問題的出現(xiàn)，加重病蟲害的發(fā)生，加速以薊馬為傳播介體的正番茄斑萎病毒屬病毒病的傳播。本研究發(fā)現(xiàn)云南省煙草上的Orthotospovirus屬病毒除了TSWV、TZSV、CCSV，還出現(xiàn)了HCRV，以及HCRV&TSWV 復合侵染。HCRV&TSWV 復合侵染煙草后，出現(xiàn)嚴重的黃化、沿葉脈壞死的現(xiàn)象。

植物病毒的檢測主要采用 ELISA，檢測過程操作簡便、準確性強、易標準化、規(guī)模生產(chǎn)等，可以用于檢測田間Orthotospovirus屬病毒[21]。本研究對采自云南省10 個地州市煙田的38 個煙草樣本采用 ELISA 和 RT-PCR 法檢測，兩種方法檢測結果的符合率85%，采自昭通市 NT-11，紅河州 NT-14，保山市 NT-34 和 NT-37 樣品RT-PCR 檢測出Orthotospovirus屬病毒，而ELISA 方法沒有檢測到Orthotospovirus屬病毒，可能由于樣品中病毒量較低，導致血清學方法沒有檢測到Orthotospovirus屬病毒。

4 結論

本研究對云南省10 個地州市采集的38 份煙草上Orthotospovirus屬病毒進行鑒定。結果表明：（1）38 份疑似Orthotospovirus屬病毒的煙草樣品有12 份感染了TSWV，占比31.58%，TSWV 是侵染云南煙草的斑萎類病毒優(yōu)勢種，主要集中煙草的主栽區(qū)，包括昆明市、玉溪市、曲靖市、昭通市、楚雄州等地區(qū)；（2）云南煙草首次報道了HCRV 在煙草上的發(fā)生，集中在保山市、昭通市，并發(fā)現(xiàn)TSWV&HCRV復合侵染的情況；（3）同一個地區(qū)的煙草同時感染2-3 種Orthotospovirus屬病毒。本研究報道HCRV、CCSV、TZSV、TSWV、TSWV&HCRV 侵染煙草，Orthotospovirus屬病毒侵染煙草的范圍不斷擴大，病毒種類也不斷增多，給病毒的防治帶來一定的難度。本研究明確了云南煙草上Orthotospovirus屬病毒發(fā)生情況，對科學制定煙草正番茄斑萎病毒屬病毒的防治措施，保障云南省煙草種植業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展提供一定的理論依據(jù)。