董 鵬，李小紅，王俊紅，劉超峰2，王玉環(huán)，張春虹

血管并發(fā)癥是糖尿病的主要并發(fā)癥，高血糖加速動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要原因[1-2]。對(duì)糖尿病病人來(lái)說(shuō)選擇一種能有效降糖，同時(shí)又能對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物具有重要的臨床意義。利拉魯肽是一種胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類(lèi)似物，有研究表明，其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[3-4]，且利拉魯肽能有效減少糖尿病人心血管事件的發(fā)生[5-8]；相關(guān)報(bào)道表明，利拉魯肽能抑制血管平滑肌增殖，延緩動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生[9-10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1類(lèi)似物利拉魯肽能有效減少平滑肌細(xì)胞KCa3.1蛋白表達(dá)。在鏈尿菌素(STZ)誘導(dǎo)的小鼠模型中，利拉魯肽抑制平滑肌增殖的作用可能與激活腺苷酸活化的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)通路有關(guān)[10]。目前利拉魯肽對(duì)糖尿病平滑肌KCa3.1與AMPK通路關(guān)系研究報(bào)道較少。本研究擬根據(jù)前期研究，探討對(duì)糖尿病大鼠模型利拉魯肽是否通過(guò)AMPK通路抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖及KCa3.1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 血管緊張素Ⅱ(阿拉丁，A107852)，血管緊張素(索萊寶，I8830)，利拉魯肽Liraglutide(selleck，S8256)，Dorsomorphin (Compound C)(selleck，S7840)，達(dá)爾伯克(氏)必需基本培養(yǎng)基(DMEM)，高糖(Hyclone)，血清(CIBCO)，Anti-alpha smooth muscle Actin抗體(abcam，ab124964)，TRITC熒光二抗(Jackson分裝)，Hoechst 33342(碧云天，1︰5 000稀釋)，F(xiàn)ast Start Essential DNA Green Master(Roche，06924204001)，TRIZOL(Invitrogen，15596026)，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，K1622)，RIPA裂解液(強(qiáng))(西安赫特生物科技有限公司，WB00920)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(bioworld，AP0063)，KCNN4抗體(proteintech，60276-1-lg)，Kv1.3(proteintech，14079-1-AP)，AMPK抗體(abcam，ab32047)，磷酸化AMPK(PAMPK)抗體(abcam，ab133448)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK8)(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，C008)，PVDF膜(Millipore)。

1.2 平滑肌細(xì)胞制備

1.2.1 大鼠VSMCs的分離與原代培養(yǎng) SPF級(jí)雄性SD大鼠3只，體重約150 g，處死大鼠，在無(wú)菌條件下迅速取出全段胸主動(dòng)脈，將血管轉(zhuǎn)移到含DMEM(10%胎牛血清)的無(wú)菌平皿中，使用DMEM培養(yǎng)液清洗中膜層平滑肌數(shù)次后，以眼科彎剪剪切成約1 mm 三大組織塊；將組織塊(約15個(gè)小塊/段血管)均勻貼放于6 cm培養(yǎng)皿底，間距0.1 cm；組織塊旁滴加少量血清，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中6 h，使組織塊干涸并與瓶壁牢固貼附。6 h后加DMEM(20%胎牛血清)培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞從組織塊邊緣游出后更換培養(yǎng)液，隔天換液1次；當(dāng)細(xì)胞80%融合時(shí)，即可傳代。

1.2.2 VSMCs的傳代培養(yǎng) 使用不含血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，加入0.125%胰酶和0.02%EDTAb混合消化液2 mL，室溫下消化20 s后轉(zhuǎn)移到37 ℃培養(yǎng)箱中消化1 min，鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮、間隙增大并有少數(shù)細(xì)胞脫落時(shí)，棄消化液，加入含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液10 mL終止消化并反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，按1∶3接種，細(xì)胞密度保持1×106個(gè)/mL，約3 d長(zhǎng)滿(mǎn)單層，采用同法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.2.3 VSMCs鑒定 采用特異的平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-actin細(xì)胞免疫熒光染色后，胞漿著色為紅色，表示細(xì)胞為VSMCs，在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

1.3 平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)及干預(yù)

1.3.1 細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期VSMCs細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)；按照5 000個(gè)細(xì)胞每孔鋪96孔板(正常培養(yǎng)基)；次日細(xì)胞饑餓處理24 h(無(wú)血清培養(yǎng)基)；第3天加入藥物處理，每組6個(gè)重復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)1 d、3 d、5 d，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，CCK8溶液(避光)10 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中1 h，測(cè)定OD450。

1.3.2 細(xì)胞造模及檢測(cè) 將大鼠平滑肌細(xì)胞分為4組，進(jìn)行如下處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期VSMCs細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)；按照50×104個(gè)細(xì)胞每孔鋪6孔板(正常培養(yǎng)基)；次日細(xì)胞饑餓處理24 h(無(wú)血清培養(yǎng)基)；第3天，A組為正常組；B組加入血管緊張素Ⅱ100 nmol/L；C組加入利拉魯肽1 μmol/L+血管緊張素Ⅱ100 nmol/L； D組加入利拉魯肽1 μmol/L+AMPK阻滯劑4 μmol/L+血管緊張素Ⅱ100 nmol/L。血管緊張素Ⅱ培養(yǎng)72 h后使用Western-Blotting檢測(cè)KCa3.1蛋白表達(dá)。

1.3.3 Western-Blotting 將培養(yǎng)好的細(xì)胞取出，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞從6孔板刮起，采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸轉(zhuǎn)移至1.5 EP管中，以8 000 r/min離心2 min收集細(xì)胞。將離心管中加入RIPA裂解液80 μL，冰上裂解1～2 h，4 ℃條件下，以12 000 r/min離心10 min，上清液即為細(xì)胞總蛋白。使用氨基黑定量法測(cè)得蛋白樣品濃度。配制10%的分離膠，5%的濃縮膠。上樣進(jìn)行電泳，使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗孵育，4 ℃過(guò)夜孵育，清洗；二抗孵育，室溫2 h，進(jìn)行顯影。

2 結(jié) 果

2.1 平滑肌細(xì)胞形態(tài)鑒定大鼠血管平滑肌 顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀、三角狀。采用α-actin細(xì)胞免疫熒光染色后，胞漿著色為紅色，倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照，確認(rèn)為VSMCs。詳見(jiàn)圖1。

圖1 血管平滑肌α-actin細(xì)胞免疫熒光染色

2.2 利拉魯肽對(duì)大鼠VSMCs的影響 利拉魯肽與大鼠血管平滑肌作用15 min后，與基線(xiàn)值比較PAMPK水平明顯上升，PAMPK/AMPK比值明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明利拉魯肽能促進(jìn)AMPK磷酸化，激活A(yù)MPK細(xì)胞通路。詳見(jiàn)圖2。

＊P<0.05。

2.3 利拉魯肽對(duì)大鼠VSMCs KCa3.1蛋白表達(dá)的影響 Western-Blotting實(shí)驗(yàn)表明，B組KCa3.1蛋白表達(dá)高于A組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C組KCa3.1蛋白表達(dá)較B組下降(P<0.05)。D組與B組KCa3.1蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組KCa3.1蛋白表達(dá)高于C組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明血管緊張素Ⅱ?qū)Ca3.1蛋白有一定的促進(jìn)作用，利拉魯肽作用于AMPK通路，抑制細(xì)胞KCa3.1蛋白表達(dá)。詳見(jiàn)圖3。

＊P<0.05。

3 討 論

糖尿病后發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化是常見(jiàn)并發(fā)癥，其中平滑肌增殖是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要步驟。有報(bào)道表明，GLP-1受體激動(dòng)劑可對(duì)抗增齡和應(yīng)激導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊增加，通過(guò)細(xì)胞AMPK/SIRT1/FOXO3a信號(hào)通路抑制平滑肌細(xì)胞收縮型向分泌型基因的轉(zhuǎn)換[11-17]。既往研究表明，利拉魯肽能對(duì)抗動(dòng)脈血管粥樣硬化，且利拉魯肽作用于血管內(nèi)皮及血管平滑肌[12-14]，通過(guò)細(xì)胞表面GLP-1受體發(fā)揮作用，多條細(xì)胞通路發(fā)揮作用，是否能激活細(xì)胞通路，抑制平滑肌增殖，從而影響KCa3.1蛋白表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。

本課題組前期研究表明，GLP-1類(lèi)似物艾塞那肽具有阻斷糖尿病大鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程KCa3.1的表達(dá)，KCa3.1是動(dòng)脈粥樣硬化的重要標(biāo)志，早期動(dòng)脈粥樣硬化即可出現(xiàn)KCa3.1上升[15-19]。有研究表明，GLP-1類(lèi)似物利拉魯肽能激活A(yù)MPK通路，抑制細(xì)胞增殖，延緩細(xì)胞從G0到G1轉(zhuǎn)變[10]。有研究表明，血管緊張素Ⅱ能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖[14]，血管緊張素Ⅱ和利拉魯肽協(xié)同作用，利拉魯肽能抑制血管緊張素Ⅱ?qū)е碌钠交〖?xì)胞增殖，利拉魯肽和AMPK抑制劑共同作用于細(xì)胞導(dǎo)致利拉魯肽抑制平滑肌增殖作用減弱；MTT法測(cè)得的增殖曲線(xiàn)證明利拉魯肽能抑制血管平滑肌增殖，AMPK抑制劑可減弱這種作用[10]。

本研究結(jié)果表明，利拉魯肽作用于大鼠血管平滑肌細(xì)胞AMPK通路促進(jìn)AMPK磷酸化，增加PAMPK/AMPK比值。Western-Blotting表明，利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞KCa3.1蛋白表達(dá)具有抑制作用。與B組比較，C組KCa3.1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與B組比較，D組KCa3.1蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組KCa3.1蛋白表達(dá)高于C組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明使用AMPK抑制劑后利拉魯肽對(duì)KCa3.1抑制減弱。本研究結(jié)果提示，利拉魯肽抑制KCa3.1蛋白表達(dá)的關(guān)鍵是能有效激活A(yù)MPK，激活A(yù)MPK通路VSMCs增殖，細(xì)胞增殖減緩導(dǎo)致KCa3.1蛋白表達(dá)下調(diào)。利拉魯肽作用于其他細(xì)胞通路，這些細(xì)胞通路是否對(duì)VSMCs KCa3.1蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，尚需進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究表明利拉魯肽能激活A(yù)MPK細(xì)胞通路，從而抑制VSMCs增殖，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞KCa3.1蛋白表達(dá)下調(diào)。