史瑩瑩，康雨薇，邵俊鋒，郭娟，許慧卿

（揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州225127）

隨社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，人民生活水平大幅度提高，對肉制品需求量也呈上升趨勢。牛肉肉質(zhì)鮮嫩，蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)豐富，受到消費者青睞。為保障肉制品的質(zhì)量安全，建立一種快速、準(zhǔn)確的牛肉制品中牛源性成分及含量的檢測方法意義重大。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)，其原理是利用特異性引物體外擴增目的DNA 片段[1]，然后對所得DNA 片段進(jìn)行分析從而達(dá)到鑒別物種的目的[2]。本文選擇實時熒光相對定量方法，旨在量化肉制品中牛肉成分，對市場的牛肉制品進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、牛肉制品：揚州市大型農(nóng)貿(mào)市場以及大型超市；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）：天根生化科技（北京）有限公司；TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ：Takara 公司；引物：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗儀器

StepOne Real-time PCR 儀 ：Applied Biosystems；Nanodrop2000 核酸蛋白定量儀：Thermo Scientific；DYY-11 型電泳儀：北京市六一儀器廠；Tanon3500 凝膠成像一體機：上海天能科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)美國NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫公布的牛線粒體細(xì)胞色素b 基因序列（登錄號MH157891.1），運用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計篩選對牛有特異性的PCR擴增引物。由于混合肉制品成分復(fù)雜，且實時熒光PCR 反應(yīng)干擾因素多，為保證數(shù)據(jù)的精確、可靠，采用相對定量法。選擇在結(jié)構(gòu)和功能上具高度保守性的16SrDNA 作為內(nèi)參管家基因[3]，根據(jù)16SrDNA 基因保守序列設(shè)計一對內(nèi)源基因引物。引物交于上海生工生物工程有限公司合成，取適量引物用高壓滅菌后的超純水溶解，配制成10 μmol/L 的儲備液。引物序列、溶解溫度值（melting temperature，Tm）與擴增片段大小具體見表1。

表1 引物序列、Tm 值及PCR 產(chǎn)物大小Table 1 The sequence of primers，Tm and the size of PCR product

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理

取50 mg 樣品充分剪碎，置于預(yù)冷潔凈的研缽中，用液氮研磨至粉末狀。

混合標(biāo)準(zhǔn)品及模擬樣品：精確稱取經(jīng)液氮研磨成粉末狀的生鮮牛肉和生鮮豬肉（精確度0.000 1 g），按質(zhì)量比混合，得到牛肉質(zhì)量百分比為5%、10%、30%等混合樣品。

1.4.2 DNA 提取

采用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）提取的樣品總DNA。取50 mg 樣品于2 mL 離心管，按提取說明書稍做改進(jìn)，加入蛋白酶K 消化時間延長至6 h 直至肌肉組織溶解，后按說明繼續(xù)操作。最終將提取的樣品DNA 溶于80 μL Tris-EDTA 洗脫液（TE）中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 DNA 濃度和純度測定

取TE 為空白調(diào)零，取2 μL 樣品，用核酸蛋白測定儀測定提取后的DNA 模板的濃度、A260/A280及A260/A230比值。取 9 μL 和 1 μL 6×Loading Buffer 混合，用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測模板DNA 提取效果。

1.4.4 實時熒光PCR 體系

反應(yīng)體系 10 μL：TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）5.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye （50×）0.2 μL，DNA 模板1.0 μL，滅菌水 3.0 μL。兩步法 PCR 擴增程序：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30 s，共 40 個循環(huán)。對熔解曲線進(jìn)行分析，無引物二聚體和非特異性產(chǎn)物。

1.4.5 引物特異性研究

以市售新鮮的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉5 種畜禽肉DNA 為模板，濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL，各取1 μL，用NIU 引物進(jìn)行實時熒光PCR 反應(yīng)，分析NIU引物擴增的物種特異性。

1.4.6 內(nèi)參引物通用性研究

以市售新鮮的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉5 種畜禽肉DNA 為模板，濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL，各取1 μL，用16S 內(nèi)參引物進(jìn)行實時熒光PCR 反應(yīng)，分析內(nèi)參引物對常見物種擴增的通用性。

1.4.7 引物靈敏度檢測

將提取的牛肉DNA 原液稀釋至50 ng/μL，然后進(jìn)行 5 倍系列梯度稀釋，即 50、10、2 ng/μL、400、80、16、3.2 pg/μL、640、128 fg/μL 等梯度，去離子水作為陰性對照模版，進(jìn)行實時熒光PCR 檢測。

1.4.8 牛源性定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以0%、10%、30%、50%、70%、90%和100%的牛豬肉混合標(biāo)準(zhǔn)品，提取DNA，濃度統(tǒng)一至50 ng/μL，進(jìn)行實時熒光PCR 反應(yīng)。以16SrDNA 作為內(nèi)參，以牛源性成分0%的樣品為對照，采用相對定量法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.9 模擬混合樣品驗證標(biāo)準(zhǔn)曲線

以牛肉質(zhì)量百分比為5%、15%、45%、65%、95%模擬混合樣提取DNA，濃度統(tǒng)一至50 ng/μL。進(jìn)行實時熒光PCR 反應(yīng)。以16SrDNA 作為內(nèi)參，將Ct 值帶入所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算牛源性成分含量，以檢驗標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。

1.4.10 市售牛肉制品檢測

在大型農(nóng)貿(mào)市場或者超市采集牛肉制品包括牛肉串、肥牛卷、牛肉丸、牛柳等。將樣品置于滅菌水浸泡漂洗后提取DNA，按1.4.4 所述試驗條件進(jìn)行實時熒光PCR 反應(yīng)。檢測是否含有牛源性成分，并通過△Ct 值計算樣品中牛肉含量。

1.5 試驗數(shù)據(jù)處理

每個試驗做3 個重復(fù)，各平行測定3 次，試驗數(shù)據(jù)以（x±s）表示。

2 試驗結(jié)果

2.1 DNA濃度和純度測定結(jié)果

不同肉類DNA 濃度和純度測定結(jié)果見表2。

核酸提取過程中容易混入蛋白質(zhì)及碳水化合物等雜質(zhì)。A260/A280＞1.8 可以說明溶液中無蛋白質(zhì)污染，A260/A230比值可以幫助判斷核酸溶液中是否混有糖類等雜質(zhì)，當(dāng) A260/A230＜2.0 時，則說明 DNA 溶液被碳水化合物污染[4]。提取的生鮮豬、牛、羊、雞、鴨肌肉組織DNA 經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1 所示。

表2 DNA 濃度和純度測定結(jié)果Table 2 DNA concentration and purity test results

圖1 2%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 2%agarose gel electrophoresis

條帶清晰無拖尾且完整。說明提取的DNA 可用于實時熒光PCR 反應(yīng)。

2.2 實時熒光PCR反應(yīng)檢測牛源性成分特異性、內(nèi)參引物通用性檢測結(jié)果

分別選取生鮮豬、牛、羊、雞、鴨肉的DNA 作為檢測模板，用NIU 引物進(jìn)行實時熒光PCR 反應(yīng)檢測，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 引物NIU 對不同肉類DNA 的擴增曲線Fig.2 Amplification curves of DNA samples derived from different meats using NIU primer

在常見的5 種畜禽生鮮肉中牛肉DNA 結(jié)果顯示唯一陽性，其余肉類檢測結(jié)果顯示均為陰性。同時以離子水作為陰性對照模版，結(jié)果均正常。表明設(shè)計的NIU 引物特異性較高，符合試驗要求，試驗可信度較高。

以16SrDNA 作為內(nèi)參引物靶基因，將生鮮豬、牛、羊、雞、鴨作的DNA 為模板，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 引物16S 對不同肉類DNA 的擴增曲線Fig.3 Amplification curves of DNA samples derived from different meats using 16S primer

內(nèi)參引物16S 對常見的5 種畜禽生鮮肉有較好的擴增效率，結(jié)果顯示均為陰性，且內(nèi)參基因16S 檢測的Ct 值集中在狹窄范圍內(nèi)，Ct 值相對穩(wěn)定。同時以離子水作為陰性對照模版，結(jié)果顯示陰性。這表明內(nèi)參引物16S 具有通用性，可以作為內(nèi)參校正基因使用。引物NIU 擴增融解曲線和內(nèi)參引物16S 擴增融解曲線見圖4 和圖 5。

圖4 引物NIU 擴增融解曲線Fig.4 Melting curves of NIU primer

圖5 內(nèi)參引物16S 擴增融解曲線Fig.5 Melting curves of internal reference primer 16S

NIU 引物和內(nèi)參基因16S 的熔解曲線Tm 值分別為 83.04 ℃（圖 4）和 77.97 ℃（圖 5），均為特異的單個峰，沒有引物二聚體和其它非特異性峰的存在，目標(biāo)片段具有高度特異性。

2.4 引物NIU靈敏度檢測

為檢測引物NIU 的靈敏度，將提取的牛肉DNA原液稀釋至50 ng/μL，5 倍系列梯度稀釋，以無酶水作為陰性對照。對濃度 50 ng/μL～128 fg/μL 的模板 DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 引物NIU 對不同DNA 濃度梯度的擴增曲線Fig.6 Amplification curve for different DNA concentration gradients of primer NIU

當(dāng)模板濃度低至0.64 pg/μL 時，仍清晰地進(jìn)行指數(shù)擴增。陰性對照結(jié)果顯示正常。因此，本方法檢測低限可達(dá) 0.64 pg/μL。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

不同牛肉含量的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)實時熒光反應(yīng)檢測，其對應(yīng)的Ct 值結(jié)果如表3 所示。以標(biāo)準(zhǔn)品中牛肉含量百分對數(shù)值lg（牛肉含量百分比%）為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的循環(huán)閾值差值△Ct（△Ct=Ct 牛肉-Ct 內(nèi)參）為縱坐標(biāo)，得到肉質(zhì)量百分比的對數(shù)值與△Ct 的線性關(guān)系，繪制成牛肉質(zhì)量百分比的對數(shù)值與△Ct 值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7 所示。

表3 不同牛肉含量百分比Ct 值檢測結(jié)表Table 3 Ct value of different beef content percentage standards

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸公式為y=-3.364 5x+0.873 7，R2=0.992 6，PCR 的反應(yīng)效率（E）=（10-1/k-1）×100%（k 為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率），本標(biāo)準(zhǔn)曲線E=98.25%。《實時熒光定量國際化標(biāo)準(zhǔn)-MIQE 指南》指出：R2＞0.980 以及 90%＜擴增效率E＜105%。結(jié)果表明，本標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系和擴增效率，符合實時熒光定量國際化標(biāo)準(zhǔn)的要求。

圖7 混合牛肉含量以及采用內(nèi)參16S 熒光PCR 擴增的△Ct 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Normalised calibration curve for the estimationof the content level of poultry meat with beef meatusing 18S rRNA amplification as a reference gene

2.6 模擬混合肉樣檢測結(jié)果

模擬牛肉含量為5 %、15 %、45 %、65 %、95 %的混合樣品，按1.4.4 反應(yīng)體系進(jìn)行檢測。將所得的△Ct代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算牛源性成分含量，并且計算回收率，以檢驗標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量測定的準(zhǔn)確性，結(jié)果如表4所示。

表4 模擬混合肉樣Ct 值檢測結(jié)果Table 4 Ct value of simulated mixed meat sample

檢測的牛源性成分含量與實際值符合程度較高，回收率較為理想。本試驗建立的量化肉制品中牛肉成分的實時熒光相對定量方法具有實踐意義。

3 討論

食品質(zhì)量與安全一直是社會關(guān)注的熱點問題，現(xiàn)代生活水平大幅度提高，群眾對肉及肉制品的需求量日益增加，尤其是優(yōu)質(zhì)的肉類如牛、羊肉。目前對肉類種屬鑒別的方法主要有：以特征形態(tài)為基礎(chǔ)的感官鑒別、以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)鑒別方法[5]以及以核酸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)等[6]。感官鑒別屬于粗略鑒別法，且檢測結(jié)果容易受實驗人員的主觀因素影響[7]。由于加工處理過程中蛋白質(zhì)的質(zhì)量受肉制品的新鮮度、加工程度等因素的影響，蛋白質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定[8]，以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的鑒定會存在干擾結(jié)果且重復(fù)性差[9]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是利用特異性引物體外擴增目的DNA 片段，然后對所得DNA 片段進(jìn)行分析從而達(dá)到鑒別物種的目的。常見的PCR 技術(shù)有常規(guī)PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR、數(shù)字PCR、DNA 測序等。自從 1998 年 Tartaglia 等[10]首次報道基于普通PCR 方法檢測飼料中的牛、羊源性成分，PCR 鑒定物種的方法日趨成熟。何瑋玲等[11]利用Cytb基因的差異性位點，設(shè)計了相同上游引物但下游各自特異性的4 條PCR 引物，建立了一種快速鑒別豬肉、牛肉、羊肉和雞肉成分的多重PCR 方法。Tobe SS 等[12]基于線粒體細(xì)胞色素b 基因?qū)?8 種常見哺乳動物建立了一套物種特異性多重鑒定體系，且靈敏度達(dá)1.6 pg級。付理文等[13]建立了一種可同時檢測豬、牛、羊、雞、鴨、鵝6 種動物源性成分的六重實時熒光定量PCR 方法，同一反應(yīng)體系下實現(xiàn)一次對6 種動物快速定量檢測，耗時短、效率高、適用性廣。微滴數(shù)字PCR 精確度高但實驗成本昂貴以及實驗條件要求高且操作復(fù)雜[14]。本文選擇實時熒光PCR 方法，以牛線粒體細(xì)胞色素b 為靶位基因，設(shè)計出對牛有特異性擴增的引物。在檢測結(jié)果能判斷是否檢出的基礎(chǔ)上，選擇16SrDNA為內(nèi)參引物，建立不同肉質(zhì)量百分比的對數(shù)值與之對應(yīng)的△Ct 值的線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。并對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行質(zhì)量評估，驗證其可行性。相比較普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，實時熒光PCR 在檢測過程中處于封閉體系，無需后續(xù)的電泳以及紫外拍照等操作，很大程度縮短了檢測時間，并且減少PCR 產(chǎn)物污染避免假陽性，試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性大大提高?，F(xiàn)行有效的進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T4397-2015）雖運用實時熒光法對出口食品中牦牛源性成分的檢測但結(jié)果僅能判斷是否檢出，未能檢測制品中牛肉成分含量。本文選擇實時熒光相對定量方法，為量化肉制品中牛肉成分摻假摻偽研究提供參考意見。