李海濤

（鄭州工業(yè)應用技術學院，河南新鄭451100）

苯乙胺類物質(zhì)（phenethylamines，PEAs）是一類具有苯乙胺骨架結(jié)構(gòu)的天然合成化合物，具有藥理活性，常用作興奮劑、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、抗抑郁藥物等[1]。世界反興奮劑機構(gòu)（World Anti-doping Agency，WADA）禁止參加競技運動比賽的運動員使用苯乙胺及其衍生物，因為這些物質(zhì)具有刺激和增強機體性能的作用[2]。PEAs 是在減肥與運動營養(yǎng)補充劑中發(fā)現(xiàn)的一類非常受歡迎的成分。美國國立衛(wèi)生研究院膳食補充標簽數(shù)據(jù)庫（Dietary Supplement Label Database，DSLD）列出了一系列膳食補充劑，在其中就包含PEAs。此外，有些產(chǎn)品可能將植物及其提取物當做PEAs 的天然來源，特別是仙人科、柑桔屬及何首烏屬等植物，而其中一些植物已被用作膳食補充劑的成分[3]。此外，在許多膳食補充劑中也發(fā)現(xiàn)了一些人工合成的PEAs，其中包括已被標記為藥物或新型物[4]。

為了保證膳食補充劑的安全性，研究者們制定了多種PEAs 的定性和定量分析方法。其中包括酸性高錳酸鉀化學發(fā)光檢測的高效液相色譜法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜[6]以及高效毛細管電泳等[7]。由于PEAs 是一類結(jié)構(gòu)相似的極性胺，在復雜的基質(zhì)中，其分析測定可能帶來較大的挑戰(zhàn)。色譜和電泳法因其在單獨組分檢測前的高效分離能力而成為首選的分析技術。然而，這些方法需要標準物質(zhì)PEAs 作為定性和定量的參考物質(zhì)，為了確定某些特定的PEAs 作為檢測和分析的目標，可能需要對樣品的組成預先了解。核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）是測定結(jié)構(gòu)的一種有效手段，可用于定量分析。由于它具有高重現(xiàn)性、自動化、不需要相同的參考物質(zhì)進行量化和通用檢測等優(yōu)點，受到越來越多的關注。核磁共振已成功地應用于生物材料提取物、食品、草藥和膳食補充劑等復雜混合物的分析[8]。它是非選擇性的，不需要事先了解混合物中的化學成分，本研究以20 種運動膳食補充劑為研究對象，基于核磁共振法對產(chǎn)品配方中的苯乙胺、辛弗林、甲基辛弗林和大麥芽堿這4 種主要的苯乙胺類物質(zhì)進行了定性分析和定量測定。通過一維和二維NMR 譜的分析，對補品中的標記PEAs 和未標記PEAs 進行了檢測和鑒定，不需進行色譜預分離。此外，還建立并驗證了一種定量核磁共振法多重檢測待測樣品輔料中4 種苯乙胺類物質(zhì)的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 膳食補充劑樣品

本研究中涉及的20 種運動膳食補充劑購買途徑為市售與網(wǎng)購（因涉及到生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品隱私，依相關規(guī)定研究中均由樣品編號替代）。樣品選購原則均基于產(chǎn)品的標簽信息包含至少一個以下所涉及的概念或聲明：“減肥”、“代謝率加強”、“興奮劑”、“脂肪營養(yǎng)”、“食欲調(diào)節(jié)”、“燃燒卡路里”、“精神集中/提升情緒”等。產(chǎn)品外觀為膠囊、粉末或片劑形式（均在產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)）。

1.1.2 試劑

苯乙胺（≥99 %）、辛弗林（≥98 %）、大麥芽堿（≥97.5%）、3-（三甲基甲硅烷基）丙酸鈉鹽（sodium 3-trimethylsilyl -[2，2，3，3]tetradeuteropropanoate，TSP）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲基辛弗林（≥98%）：美國ChromaDex 公司。

1.1.3 儀器

Milli-Q 凈水系統(tǒng)：美國密理博（中國）有限公司；MicrofugeR16 離心機：美國貝爾曼庫爾特有限公司；Agilent DD2-500MHz 型核磁共振儀（配備OneNMR 探針和Agilent Vnmrj 4.0 軟件）：美國Varian 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 定性分析

將20 種運動膳食補充劑樣品依次編號為S1、S2、S3、……、S20，并分別稱取100 mg 的均質(zhì)粉末放置于2 mL 的離心管中，加入400 μL 氘代甲醇/氘化水溶液（體積比為4 ∶1），加入適量0.5 mmol/L TSP 作為內(nèi)標；渦旋攪拌混合30 s 后在室溫25 ℃下超聲處理15 min。在25 ℃、13 000 r/min 的參數(shù)下離心 7 min。 在 NMR分析前，將上清液（200 μL）轉(zhuǎn)移至 3 mmol/L NMR 管中備用。

1.2.2 定量分析

精確稱取50 mg～250 mg 樣品并溶解在5 mL HCl-KCl 水溶液（含有 0.15 mol/L HCl 和 0.15 mol/L KCl）中。在室溫25 ℃下超聲處理20 min，然后以4 000 r/min離心 7 min。準確地移取200 μL 上清液并與100 μL含有1.5 mmol/L TSP 的重水溶液混合。將混合溶液轉(zhuǎn)移到3 mmol/L NMR 管中進行NMR 的分析測定（每個樣品進行3 次重復試驗）。

制備 D2O/H2O（1 ∶2，體積比），含有 0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L KCl 及0.5 mmol/L TSP 溶液用于標準溶液的制備和稀釋。在 4.4、4.3、4.0 mg/mL 和 3.0 mg/mL 的濃度下配制苯乙胺、辛弗林、大麥芽堿和甲基辛弗林的標準原液。通過對標液的梯度稀釋，制備了含有4 種標準化合物不同濃度（2 μg/mL～2 200 μg/mL）的標準溶液。用校正曲線測定了膳食補充劑中4 種PEAs 的含量。通過繪制特征共振峰面積比建立單獨的校準曲線。其內(nèi)參比TSP 在0.0 ppm 與校準濃度范圍內(nèi)對應的濃度水平之間的比值為1.15 ppm。

1.2.3 驗證試驗

本研究基于檢測方法的選擇性、特異性、穩(wěn)定性、線性度、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）、準確度、精密度和重復性等多方面考量，對該方法進行驗證試驗。所有驗證參數(shù)都是依據(jù)“人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調(diào)會議（international council for harmonization，ICH）”準則 Q2（R1）[9]的要求進行。對驗證樣本和標準解決方案進行了日內(nèi)測試（6 次/d）與日間測試（5 次/d，連續(xù) 3 d）。

1.2.4 核磁共振測定條件

在499.79 MHz 處測量了1H NMR 譜，用預飽和脈沖程序抑制了H2O 信號。光譜寬度為8 503 Hz，掃描次數(shù)為128，數(shù)據(jù)點為44 218，弛豫延遲為15 s，采集時間為 2.6 s，脈沖寬度為 7.40 μs（90°）。針對 Vnmrj 4.0軟件的反轉(zhuǎn)恢復脈沖序列，對苯乙胺類物質(zhì)和TSP 共振信號的縱向弛豫時間T1 進行了測量和計算。結(jié)果表明，其靶1H 信號的T1 值在1.0 s～2.9 s 之間。因此，在定量測量條件下，所有這些共振可以被認為是完全放松的。HSQCAD 和gHMBCAD 的最佳耦合常數(shù)分別為145 Hz 和8 Hz。對于CIGAR-HMBC 試驗，將15N譜寬設為-10 ppm～300 ppm，化學位移為0 ppm，優(yōu)化耦合常數(shù)范圍為4 Hz～10 Hz，瞬態(tài)數(shù)32，增量數(shù)256。核磁共振數(shù)據(jù)處理用Mnova 軟件，用0.3 Hz 譜線展寬對自由誘導衰變（free induction decays，F(xiàn)ID）進行傅里葉變換。對光譜進行基線校正。在化學位移δ=0.0 ppm時，根據(jù)TSP 信號標定了NMR 譜的化學位移。利用Mnova 軟件提供的譜反褶積（GSD）函數(shù)和峰值拾取法對所有選定的NMR 峰進行了集成。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯乙胺類物質(zhì)提取方法的優(yōu)化

為確定最佳的萃取條件，選取適量的補充劑進行了以下4 種萃取體系的優(yōu)化評價試驗，分別為A：甲醇/水（體積比為 4 ∶1）；B：乙腈/水（體積比為 4 ∶1）；C：氯化氫水溶液（0.1 mol/L HCl）；D：苯（樣品先在 0.1 mol/L NaOH 溶液中溶解）。結(jié)果表明，體系A 最能有效地提取補充劑樣品中的大部分化學成分，在樣品中所有成分的回收率方面優(yōu)于體系B；系統(tǒng)C 不但有較高的提取率和重現(xiàn)性，而且可以顯著地減少樣品矩陣的干擾。體系D 能夠為待測樣品提供相對干凈的1H NMR譜，但若想要達到有效的回收率則需要大量的苯。因此，系統(tǒng)A 被用于定性分析，系統(tǒng)C 用于定量檢測。在C 體系中加入適量的KCl，可對萃取液的pH 值產(chǎn)生緩沖作用。此外，還觀察到在C 體系中加入KCl 可在某些組分的1H NMR 譜中產(chǎn)生尖銳的共振峰[10]。

2.2 補充劑中PEAs的定性分析

苯乙胺類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)簡單，只有兩個特征片段，即苯基和乙胺。理論上，其1H NMR 譜中苯基的化學位移范圍在δH6.0 ppm～7.5 ppm 內(nèi)表現(xiàn)出特征共振，乙胺在δH3.0 ppm～5.0 ppm 范圍內(nèi)表現(xiàn)出特征共振。本研究首次在溶劑體系A 中測定了其1H NMR 譜。在此基礎上，如果在1H NMR 譜的相應化學位移范圍內(nèi)沒有檢測到其特征共振，則可以篩選出不含（或其含量低于該方法的LOD 值）這4 種苯乙胺類物質(zhì)的補充劑樣品。基于二維核磁共振試驗對20 個待測樣品進行了鑒定分析。特別是利用1H-15N CIGAR-HMBC 核磁共振試驗，對苯乙胺類物質(zhì)特有的乙胺部分的信號進行了選擇性檢測，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 樣品S1 的二維核磁共振譜圖Fig.1 2D NMR spectra of sample S1

由圖1 可知樣品 S1 的二維1H-15N CIGAR，gCOSY，gHMBCAD 和HSQCAD 等高線譜圖。如圖1（B）CIGAR 譜圖中，可以觀察到質(zhì)子信號（三重態(tài)）在δH2.98 ppm 處與氮信號在δH31.8 ppm 處之間存在著1H-15N 相關性，表明樣品制劑中存在胺組分。類似地，從樣品S1 的4 個譜圖中確定苯乙胺的結(jié)構(gòu)。這些信號反映了結(jié)構(gòu)中的氮原子并通過二維光譜分析證實了這兩種含氮組分的存在。

本研究對20 種運動膳食補充劑（樣品編號依次為S1～S20）進行了相關的定性分析，其結(jié)果如表1 所示。

表1 樣品定性分析檢測結(jié)果Table 1 Test results for qualitative analysis of samples

由表1 可知，4 種苯乙胺類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、NMR 共振分配相關數(shù)據(jù)以及樣品定性分析結(jié)果。在20 種補充劑中，有10 種樣品含有苯乙胺，含有辛弗林和甲基辛弗林的樣品數(shù)分別為8 種和5 種，而含有大麥芽堿的樣品數(shù)為5 種。其中4 種苯乙胺類物質(zhì)均未檢出的樣品有4 個，分別為S4、S6、S10 和S16。在本研究中，在含有不同化學成分的樣品光譜中可觀察到苯乙胺類的一些質(zhì)子信號有少量的化學位移漂移，但碳化學位移幾乎是恒定的。由于13C 譜通常比1H 譜簡單得多，因此13C NMR 是復雜混合物定性分析中一種有效的輔助手段。

2.3 驗證試驗

基于ICH 標準對該定量方法進行了相關的驗證試驗。所有的苯乙胺類物質(zhì)均提供了它們自己的特征共振峰，且互不干擾，以便進行更加精確地計算。通過二維NMR 試驗驗證了該化合物的峰級分布。此外，利用反褶積函數(shù)來提高峰面積積分的精度[11]。通過對4種苯乙胺類物質(zhì)的線性度、LOD 和LOQ 進行相關驗證試驗。如表2 所示。

由表2 可知，校正方程的較高相關系數(shù)表明4 種化合物在較寬的動態(tài)濃度范圍內(nèi)具有良好的線性響應?；跇艘涸?2 μg/mL～400 μg/mL 范圍內(nèi)建立的校準曲線，測得 LOD=3.2 σ/s 和 LOQ=9.8 σ/s（其中 σ 為回歸曲線y 截距的標準差，s 為校準曲線的斜率）[12]。

通過日內(nèi)和日間（連續(xù)3 d）的相關測定對該方法的精密度和重現(xiàn)性進行了檢驗。如表3 所示。

表3 4 種苯乙胺類物質(zhì)定量分析相關參數(shù)Table 3 Quantitative analysis parameters of four phenylethylamines

由表3 可知，4 種苯乙胺類物質(zhì)的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于 3.5%。因4 種物質(zhì)的含量均在96.9%～104.3%之間，表明所建立的核磁共振法對運動膳食補充劑中4 種苯乙胺類物質(zhì)的定量是可靠準確的。

2.4 樣品中4種苯乙胺類物質(zhì)的多重檢測

針對20 份樣品依據(jù)上述方法對苯乙胺、辛弗林、大麥芽堿和甲基辛弗林的濃度（質(zhì)量百分比，mg/100 mg）進行了多重檢測，分析結(jié)果見表4。

表4 多重檢測20 份樣品中4 種苯乙胺類物質(zhì)的含量Table 4 Multiple detection of 4 phenylethylamines in 20 samples mg/100 mg

表4 多重檢測20 份樣品中4 種苯乙胺類物質(zhì)的含量Table 4 Multiple detection of 4 phenylethylamines in 20 samples mg/100 mg

由表4 可知，該方法可以多重檢測這4 種苯乙胺類物質(zhì)，并且在20 份樣品中，有10 個產(chǎn)品中檢出了苯乙胺，含量變化范圍為0.8%～28.9%，占調(diào)查產(chǎn)品的一半。然而在樣品S2 和S20 的產(chǎn)品標簽中并沒有提到苯乙胺。樣品S20 的標簽中只提到了甲基辛弗林，而實際并未檢測此物質(zhì)，而是檢測到未提及的苯乙胺。而針對 S20 產(chǎn)品的日推薦食用劑量（1 粒/次，2 次/d）應攝入1 350 mg 的物質(zhì)含量，而依據(jù)本研究的檢測結(jié)果計算，實際食用量約412 mg。針對辛弗林的檢測結(jié)果可知，在所有樣品中有8 個樣品檢出該物質(zhì)，其含量在0.6%～5.7%。樣品S6 與S12 雖然在產(chǎn)品標簽中有提到，但實際未檢測到。而在檢出苯乙胺的10 個樣品中又有50%的樣品同時檢出了辛弗林。在8 個辛弗林的檢出樣品中又有3 個樣品標簽中未提及含有辛弗林。甲基辛弗林的檢測結(jié)果顯示出其含量在0.2%～11.9%之間。而在4 種物質(zhì)都未檢出的樣品S4、S6、S10 和S16 均有提到含甲基辛弗林，但都未檢出。針對大麥芽堿的檢測則可知3 個樣品中的大麥芽堿均與其它苯乙胺類物質(zhì)同時存在，未單獨檢出。

3 結(jié)論

本研究利用核磁共振法來鑒別和量化膳食補充劑中的4 種常見的苯乙胺類物質(zhì)。NMR 可以提供豐富的檢測信息，使被檢產(chǎn)品的配方成分作為一個整體而得以識別出來，不需要事先了解補充劑中成分的具體信息。基于一維和二維NMR 技術（包括1H-15N CIGAR-HMBC）對20 個商品保健品中檢測和鑒定了4 種苯乙胺類物質(zhì)，即苯乙胺、辛弗林、甲基辛弗林和大麥芽堿，建立并驗證了多重測定樣品中4 種苯乙胺類物質(zhì)含量的核磁共振定量方法。這項研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)情況下，未貼上標簽的苯乙胺類物質(zhì)在補充劑中被檢測到，而標簽上所列的苯乙胺類物質(zhì)實際上未檢測到。研究還發(fā)現(xiàn)，苯乙胺類物質(zhì)（包括總量和單個物質(zhì)含量）的濃度在不同的補充劑中差異很大。核磁共振技術作為一種有效的檢測手段，在未來的膳食補充劑和新型苯乙胺類物質(zhì)的檢測分析方面將得到充分地肯定與有效利用。