李琳

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.中國商業(yè)聯(lián)合會商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（天津），天津300070）

萬古霉素（vancomycin）屬于糖肽類抗生素，被視作抗生素的“最后一道防線”，主要用來治療對所有抗生素都無效的嚴(yán)重感染[1]。萬古霉素是一種廣譜抗菌素，具有嚴(yán)重的耳毒性及腎毒性，所以只用于短期搶救。

由于畜牧養(yǎng)殖行業(yè)越發(fā)集中的發(fā)展，為了疾病預(yù)防的需要[2]，不合理的使用抗生素現(xiàn)象比較普遍。人體長期攝入低劑量的抗生素，會造成抗生素在體內(nèi)逐漸蓄積進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)多器官發(fā)生病變。長期攝入低計(jì)量的抗生素也會引起人體內(nèi)菌群的紊亂和耐藥性，最終可能導(dǎo)致超級細(xì)菌的形成[3]。

同時(shí)，萬古霉素被列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》[4]中，目前相關(guān)部門尚未頒布相應(yīng)的檢測方法，國外主要采用液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測[5-6]。本文建立了高效液相色譜法測定肉制品中萬古霉素殘留量，為工作方法的建立提供了一種思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

1.1.1 主要試劑

鹽酸萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)純品（1404-93-9）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：美國 FisherChemical 公司；甲酸（分析純）、乙酸（分析純）：天津市化學(xué)試劑五廠分廠；乙酸銨、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技所有限公司；二氯甲烷、乙醚、石油醚、正己烷（均為分析純）：天津市化學(xué)試劑股份公司第二分公司；氨水（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；磷酸（分析純）：天津市化學(xué)試劑研究所有限公司；PCX-SPE 柱、C18-SPE 柱：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

Agilent 1260 液相色譜儀：美國Agilent 公司；AL204 電子分析天平（精確至 0.000 1 g）、FE20 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)（精確至0.01）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A 微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；12 管防交叉污染固相萃取裝置：美國SUPELCO 公司；GM-0.50 兩用型隔膜真空泵：天津市騰達(dá)過濾器件廠；A10 純水機(jī)：MILLIPORE 公司；0.22 μm微孔過濾膜[聚醚砜（poly ether sulphone，PES）]、0.22 μm過濾膜：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；一次性無菌注射器：江西洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的提取方法

稱取5.00 肉制品，置于離心管中，加入10 mL 0.1%甲酸水-乙腈（體積比為 7 ∶3），漩渦振蕩 1 min，超聲輔助提取 20 min。4 ℃下 8 000 r/min 離心 5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中。殘?jiān)偌尤? mL 0.1%甲酸水-乙腈，漩渦振蕩1 min，超聲輔助提取20 min。4 ℃下 8 000 r/min 離心 5 min，合并上清液，加入3 mL 乙腈飽和的二氯甲烷，振蕩混勻。4 ℃下8 000 r/min 離心5 min，棄去二氯甲烷層，再加入2 mL二氯甲烷，振蕩混勻。4 ℃下8 000 r/min 離心5 min，棄去二氯甲烷層，水相層待凈化。

1.2.2 固相萃取柱凈化方法

固相萃取柱經(jīng)過3 mL 甲醇，3 mL 水活化固相萃取柱，棄去流出液后，以小于1 mL/min 速度將待凈化液通過固相萃取柱，加入1 mL 水，棄去淋洗液，負(fù)壓抽干，用8 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，收集流出液，35 ℃氮吹至近干，用1.0 mL 0.1 %甲酸水溶解定容，過0.22 μm 水系膜，待測定使用[7]。

1.2.3 液相條件

色譜柱：Aglient ZORBAX SB-C18 柱，150 mm（柱長）×4.6 mm（內(nèi)徑），粒徑 5 μm；流速：1.0 mL/min；流動相：20 mmol 乙酸銨（pH 3.2）-乙腈；梯度洗脫：0.00～3.00 min，乙腈體積保持 10%，3.00 min～15.00 min，乙腈體積由10 %增加到90 %，15.00 min～15.01 min，乙腈體積由90 %降低到10 %，15.01 min～20.00 min，乙腈體積保持10%；檢測波長：236 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.4 不同因素對萬古霉素出峰情況的影響

1）液相色譜體系中流動相的選擇。選擇乙酸銨和磷酸二氫鉀作為水相流動相分別進(jìn)行色譜分離，分析不同鹽溶液對萬古霉素出峰情況的影響；

2）液相色譜體系中流動相的水相pH 值的選擇。調(diào)節(jié)水相 pH 值分別為 3.2，5，7，分析鹽溶液不同 pH 值對萬古霉素出峰情況的影響；

3）提取劑的選擇和使用體積，對萬古霉素回收率的影響。稱取5.000 g 的加標(biāo)肉制品，每份用10 mL 的提取劑進(jìn)行提取，計(jì)算萬古霉素的回收率，測試提取劑對萬古霉素結(jié)果的影響；稱取5.000 g 的加標(biāo)肉制品3 份，第一份添加10 mL 提取劑；第二份添加15 mL提取劑分兩次超聲輔助提?。ǖ谝淮?0 mL，第二次5 mL），第三份添加15 mL 提取劑，測試萬古霉素的回收率，測試提取劑使用體積對萬古霉素結(jié)果的影響；

4）對固相萃取過程中的洗脫劑進(jìn)行選擇和使用體積，對萬古霉素回收率的影響。根據(jù)固相萃取柱和萬古霉素的極性，選擇洗脫液分別為5%氨化甲醇[8]、10 %醋酸甲醇[9]、0.1 %甲酸-乙腈（1+9）、乙腈[10]進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件的優(yōu)化

流動相中加緩沖鹽是為保持流動相的酸堿度穩(wěn)定，同時(shí)也能使被測物質(zhì)保持穩(wěn)定[8]。在已知的高效液相色譜法測定萬古霉素應(yīng)用中，大部分的研究報(bào)道在血藥研究[11-12]和人體細(xì)胞組織[13-14]中藥物殘留上。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]，流動相使用的是0.05 mol/L 磷酸二氫鉀（pH=3.2）-乙腈。由于磷酸鹽容易結(jié)晶，導(dǎo)致液相色譜容易磨損或污染，因此本文討論用乙酸銨是否能代替磷酸二氫鉀進(jìn)行色譜分離。圖1 是流動相不同緩沖鹽下萬古霉素的色譜圖。

圖1 不同緩沖鹽體系的色譜圖Fig.1 Chromatographic charts of different buffer salt systems

由圖1 可以看出，色譜峰對稱性都很好，并且無拖尾現(xiàn)象，因此緩沖鹽對峰形影響的差別很小，但乙酸銨的響應(yīng)值明顯優(yōu)于磷酸二氫鉀，因此乙酸銨可以作為流動相中的緩沖鹽使用。

同時(shí)測試了50 mmol/L 乙酸銨、20 mmol/L 乙酸銨對萬古霉素出峰情況的影響，結(jié)果表明，乙酸銨的濃度對峰形效果的影響不明顯?？紤]到分析純試劑對儀器靈敏度可能略有影響，所以最終選擇20 mmol/L 乙酸銨作為緩沖鹽使用。

圖2 是在不同pH 值的流動相下萬古霉素的色譜圖。

由圖2 中可以看出，pH=7、pH=5 時(shí)，有拖尾現(xiàn)象并且色譜峰響應(yīng)值也不高，而pH=3.2 時(shí)出峰效果最理想，峰形比較對稱，無拖尾現(xiàn)象，響應(yīng)值明顯，因此本文流動相緩沖鹽是pH=3.2 的20 mmol/L 乙酸銨。

圖2 不同pH 值緩沖液的色譜圖Fig.2 Chromatographic charts of different pH value buffers

紫外吸收波長的選擇，影響到試驗(yàn)的靈敏度和穩(wěn)定性[17]。對萬古霉素進(jìn)行了全波長掃描，在280 nm 處有特征吸收波長[18]，但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道大部分的測試萬古霉素選擇的吸收波長為236 nm[19]。因此本文中，以280 nm 和236 nm 做比較，查看兩種波長下色譜圖的差異，結(jié)果表明，吸收波長236 nm 處的吸收強(qiáng)度高于280 nm 處，考慮到乙腈的截止波長是210 nm，乙酸銨的截止波長是230 nm。因此，最終選擇236 nm 作為檢測波長進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 液相方法曲線線性

將萬古霉素用 0.1 %甲酸稀釋成 8.5、17、51、85、119、170 μg/mL。用液相色譜儀二極管陣列檢測器進(jìn)行測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制校正曲線，圖3 是萬古霉素在液相色譜中的校準(zhǔn)曲線圖。

圖3 萬古霉素液相色譜儀校準(zhǔn)曲線Fig.3 Calibration curve of vancomycin liquid chromatography

萬古霉素在液相色譜中的線性方程式是：Y=9.014 62X+0.538 75，線性相關(guān)系數(shù) R2=0.999 84，可以看出濃度與響應(yīng)值線性良好。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取劑的選擇和用量

提取方案的選定主要是根據(jù)分析物的特性來定。但也需要考慮樣品的組分（如脂肪含量、蛋白質(zhì)含量等）以及后面的吸附劑性質(zhì)等因素。要求提取溶劑使分析物能進(jìn)入溶液中而樣品中其他物質(zhì)不溶或少量溶于該溶液中。

測試了不同提取劑[甲醇∶水=5∶5[8]、乙腈∶水=5∶5[20]、乙腈∶0.1%甲酸=3∶7[21]、乙腈∶20 mmol/L 乙酸銨=3∶7（以上均為體積比）]對萬古霉素回收率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同提取劑下萬古霉素回收率Fig.4 The recovery of vancomycin with different extractants

由圖4 可以看出，用乙腈∶0.1%甲酸=3 ∶7 提取回收的效果略優(yōu)于其他提取劑。因此，本試驗(yàn)選擇使用乙腈∶0.1%甲酸=3 ∶7 作為提取劑。

對提取劑用量做優(yōu)化，圖5 為提取劑不同用量對萬古霉素回收率的影響。

圖5 提取劑不同用量和方式下萬古霉素回收率圖Fig.5 Recovery of vancomycin with different dosage and methods of extractant

由圖5 可以看出，用15 mL 分2 次超聲輔助提取回收的效果明顯優(yōu)于其他提取方式的效果，因此，本試驗(yàn)選擇15 mL 提取劑分兩次超聲輔助提取（第一次10 mL，第二次5 mL）作為提取條件。

2.3.2 固相萃取柱的選擇

文獻(xiàn)中，固相萃取柱一般選擇主要選擇2 個(gè)品種，反向材料和陽離子交換材料。因此，本文選擇了PCXSPE[22]、C18-SPE[23]進(jìn)行比較，對萬古霉素回收率結(jié)果見圖6。

圖6 不同固相萃取柱對樣品中萬古霉素回收率效果圖Fig.6 Effect charts of vancomycin recovery in samples by different solid phase extraction columns

由圖6 可以看出，兩種固相萃取柱對萬古霉素吸附的效果相近，PCX-SPE 為固相萃取柱時(shí)萬古霉素的回收率略高。

2.3.3 洗脫劑的選擇和用量

圖7 是不同洗脫液回收率的試驗(yàn)結(jié)果比較。

圖7 不同洗脫液回收率Fig.7 Recovery of different eluents

結(jié)果表明，5%氨化甲醇洗脫液對回收率結(jié)果的影響明顯優(yōu)于其他洗脫液的效果，因此，本試驗(yàn)選擇5%氨化甲醇作為洗脫液。

對于洗脫液用量的優(yōu)化，以5 mL 為基礎(chǔ)，增加洗脫液用量，試驗(yàn)結(jié)果表明8 mL 洗脫液可以比較完全的洗下目標(biāo)物質(zhì)，并且雜質(zhì)干擾比較少。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 檢出限和定量限的確定

按照方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按照試驗(yàn)步驟進(jìn)行操作凈化空白樣品，用空白樣品不斷稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)信噪比得到的濃度，計(jì)算出檢出限和定量限。檢出限是指由基質(zhì)空白所產(chǎn)生的儀器背景信號的3 倍值的所對應(yīng)的物質(zhì)濃度，經(jīng)過測量計(jì)算檢出限（S/N=3）為0.5 mg/kg。定量限是指由基質(zhì)空白所產(chǎn)生的儀器背景信號的10 倍值的所對應(yīng)的物質(zhì)濃度，經(jīng)過測量計(jì)算定量限（S/N=10）為 8 mg/kg。

2.4.2 加標(biāo)回收率測定、精密度驗(yàn)證

由于市面上沒有銷售已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，所以采用空白樣品添加不同濃度待測物質(zhì)制成有確定含量的樣品，按照操作步驟進(jìn)行測試。本文進(jìn)行3 個(gè)水平的回收率試驗(yàn)，分別添加 30、80、150 μg/mL3 種不同濃度，加標(biāo)回收率結(jié)果見表1。

表1 空白樣品加標(biāo)回收率Table 1 Recovery rate of blank sample

經(jīng)過計(jì)算，3 個(gè)添加水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：6.67%、3.63%、4.20%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)，符合有機(jī)物檢測的回收率水平要求。

2.5 試驗(yàn)方法的應(yīng)用

利用本試驗(yàn)已經(jīng)建立的方法對市場上銷售的肉制品進(jìn)行檢測，隨機(jī)選擇5 個(gè)不同品牌的不同類型肉制品（包括老火腿、臘腸、粉腸、午餐肉、蒜腸）進(jìn)行檢測，均為未檢出萬古霉素殘留。

3 結(jié)論

本文建立了液相色譜法測定肉產(chǎn)品中萬古霉素含量。線性范圍是 8.5 μg/mL 到 170 μg/mL，方法檢出限為0.5 mg/kg，定量限為8 mg/kg。添加回收率在75%～95%，精密度為5%～8%。

應(yīng)用本試驗(yàn)方法對市場上銷售的5 種肉制品進(jìn)行測試，結(jié)果表明5 個(gè)產(chǎn)品均未檢出萬古霉素殘留。為肉制品中萬古霉素含量的測定提供了一個(gè)研究思路。