張立挺，蔣子文，高磊，徐曉娟，王宏鵬，黃俊

（浙江科技學(xué)院浙江省廢棄生物質(zhì)循環(huán)利用與生態(tài)處理技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310023）

我國的塑料制品自2010 年～2017 年持續(xù)增長，2017 年更是達(dá)到了7515.5 萬噸，位居世界第一[1]。塑料雖然在過去幾十年給世界帶來方便，但其難降解的問題一直存在。目前城市垃圾中的塑料主要采用焚燒法處理，這樣做最直接的結(jié)果是污染大氣。在食品行業(yè)中，塑料的應(yīng)用范圍更是廣泛。近年來隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對食品品質(zhì)提出了更高的要求，但也對包裝的材料提出更環(huán)保的要求[2-3]。面對日益嚴(yán)重的資源枯竭、環(huán)境污染以及食品安全問題，人們開始把目光轉(zhuǎn)向綠色安全的生物可降解材料[4-5]?？墒衬な侵敢蕴烊坏目墒承晕镔|(zhì)例如多糖、蛋白質(zhì)等作為原料，加入一些可食性增塑劑，通過不同分子之間的相互作用產(chǎn)生的薄膜[6]。與傳統(tǒng)塑料包裝材料相比，它能夠更好防止水和油脂擴(kuò)散到食物表面，同時還可以選擇性的進(jìn)行氣體交換[7-8]。最重要的是，它對環(huán)境沒有污染，可以與食物一起被食用。即便被丟棄也可以自然降解，非常環(huán)保。

殼聚糖是自然界中的僅次于纖維素的第二大堿性生物多糖，具有良好的成膜性、抗菌性，生物相容性和生物可降解性[9]。同時明膠作為一種蛋白質(zhì)，它的吸水性強(qiáng)，水溶液黏度高，生物安全性高，在食品和醫(yī)藥等行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景[10]。因此，本研究以殼聚糖和明膠為成膜材料，加入一定量甘油作為增塑劑制備可食用復(fù)合膜，主要通過析因設(shè)計(jì)優(yōu)化成膜工藝，并對優(yōu)化后的可食用復(fù)合膜進(jìn)行表征和抗菌性能測試。

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖（脫乙酰度≥95%）、牛肉浸膏、生物試劑：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；瓊脂粉（生化試劑）、明膠（化學(xué)純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘油（分子生物級）：生工生物工程（上海）股份有限公司；冰乙酸（分析純）：上海展云化工有限公司；氯化鈉（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；蛋白胨：杭州微生物試劑有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：由浙江科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 膜的制備

稱取適當(dāng)質(zhì)量的殼聚糖，溶于1%的乙酸溶液中，在30 ℃下磁力攪拌使其溶解。同時配制適當(dāng)濃度的明膠溶液，在55 ℃～60 ℃下水浴加熱使其溶解。參考王麗媛等的研究結(jié)果[11]，將殼聚糖溶液與明膠溶液按6 ∶4（體積比）混合，并加入0.3%的甘油作為增塑劑，在30 ℃下磁力攪拌20 min，然后超聲脫氣30 min 備用。殼聚糖與明膠的單因素試驗(yàn)按以下方案進(jìn)行：

1）殼聚糖濃度分別為 0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%，乙酸溶液1%，明膠1.5%，甘油0.3%；

2）明膠濃度分別為 0.75 %、1 %、1.25 %、1.5%、1.75%，乙酸溶液1%，殼聚糖1%，甘油0.3%。

用50 mL 量筒量取50 mL 膜液倒在底面光滑、平整的培養(yǎng)皿（直徑約為9 cm）中，置于60 ℃的干燥箱中干燥24 h。干燥完畢將培養(yǎng)皿置于室溫（22 ℃）下過夜，然后揭膜并將膜樣置于硅膠干燥器中平衡2 d 后備用。

1.2.2 析因設(shè)計(jì)

參照食品包裝材料的要求，以較高的抗拉強(qiáng)度與斷裂伸長率和較小的水蒸氣透過系數(shù)為參考指標(biāo)，對成膜性能較好的幾個濃度進(jìn)行進(jìn)一步析因優(yōu)化設(shè)計(jì)，如表1 所示。

表1 析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)表Table 1 Factorial design experiment

1.2.3 機(jī)械性能測試

根據(jù)GB/T 13022-1991《塑料-薄膜拉伸性能試驗(yàn)方法》。測試前將膜樣裁成20 mm×50 mm 的規(guī)格，固定在試驗(yàn)機(jī)夾具上，拉伸速度設(shè)定為60 mm/min，測定復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度（TS）和斷裂伸長率（E）。每個水平樣品至少測試3 組。

1.2.4 水蒸氣透過系數(shù)（water vapour permeability，WVP）測試

根據(jù)美國試驗(yàn)材料學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)E96-05[12]，測試復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)。用膜將盛有10 mL 去離子水（100%相對濕度，22 ℃）的玻璃稱量瓶（規(guī)格25 mm×40 mm，瓶口內(nèi)直徑35 mm）口封住（實(shí)際操作時為保證有效面積的準(zhǔn)確性，用封口膜將瓶口外側(cè)的膜密封），然后將稱量瓶置于硅膠干燥器（試驗(yàn)時將硅膠干燥器置于22 ℃生化培養(yǎng)箱中，以保證測試溫度的穩(wěn)定）中平衡1 h，稱重。之后每2 h 稱一次，共稱5 次。

1.2.5 X 射線衍射測試（X-ray diffraction，XRD）

將殼聚糖膜、明膠膜和復(fù)合膜裁剪成合適大小，小心貼合在測試用玻璃片上進(jìn)行X 射線衍射。測試電壓為 40 kV，電流為 40 mA，模式為 2θ/θ，掃描角度為5°～50°。測試結(jié)束作圖并分析。

1.2.6 掃描電鏡測試（scanning electron microscope，SEM）

將殼聚糖膜、明膠膜和復(fù)合膜裁剪成合適大小，分別取3 種膜的水平表面和橫斷面固定在樣品臺上，噴金1.25 min。處理結(jié)束將待測樣品置于電鏡中，按要求測試，調(diào)整電鏡放大倍數(shù)，選取3 種膜的表面和橫斷面電鏡圖保存并分析。

1.2.7 抗菌性能測試

1.2.7.1 培養(yǎng)基的配置

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g～20 g，去離子水 1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌 20 min。

1.2.7.2 菌種的活化

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，于37 ℃下培養(yǎng)24 h。將活化好的斜面每支加入5 mL 已滅菌的去離子水，洗出菌并混勻。用移液槍取10 μL 菌懸液加到對應(yīng)培養(yǎng)皿中，涂布均勻。然后在每個培養(yǎng)皿上均勻放上3 個牛津杯（使用前在超凈臺中紫外殺菌），輕輕按壓使牛津杯與培養(yǎng)基表面無空隙接觸，然后在每個牛津杯中加入200 μL 膜液。將培養(yǎng)皿在37 ℃下培養(yǎng)適宜時間，觀察抑菌圈大小，用千分尺測出抑菌圈直徑，以評價其抗菌性能。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)設(shè)置3 個平行，采用SPSS16.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD 分析，并利用Oringin 8.0 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

殼聚糖/明膠濃度對復(fù)合膜的機(jī)械性能與水蒸氣透過系數(shù)的影響見圖1。

圖1 殼聚糖/明膠濃度對復(fù)合膜的機(jī)械性能與水蒸氣透過系數(shù)的影響Fig.1 Effect of chitosan/gelatin concentration on mechanical property and water vapor permeability of the composite films

單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1.75%水平的殼聚糖膜在烘干后玻璃化嚴(yán)重，而明膠0.75%水平的復(fù)合膜則過于柔軟，均不能撕下完整的膜。對剩余4 個較好成膜水平的膜性能進(jìn)行考察，如圖1A 所示，在控制明膠濃度為1.5%時，隨著殼聚糖含量的增加，復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度逐漸增大，在殼聚糖濃度為1.5 %時，抗拉強(qiáng)度為15.21 MPa。而復(fù)合膜的斷裂伸長率上升趨勢不顯著，當(dāng)殼聚糖濃度為1%時最大，為110.31%，而后略有下降。圖1B 表明，在殼聚糖濃度低于1.25%的范圍內(nèi)，復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)隨殼聚糖含量的增加而下降，約為 0.59 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2。而高于 1.25%時，水蒸氣透過系數(shù)略微回升?？刂茪ぞ厶菨舛葹?%，調(diào)整明膠的濃度，考察明膠濃度對復(fù)合膜機(jī)械性能和水蒸氣透過系數(shù)的影響。圖1C、1D 結(jié)果表明，隨著明膠濃度的增加，復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率均呈上升趨勢。當(dāng)明膠濃度為1.75%時，抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率達(dá)到最大，分別為11.09 MPa 和113.56%。而復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)先下降后上升，在明膠濃度為1.25%時達(dá)到最小，其值為 0.56 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2。殼聚糖與明膠濃度增加后，自身攜帶的羧基和羥基與明膠分子之間氫鍵及共價鍵作用強(qiáng)度增加，微觀表現(xiàn)為復(fù)合膜內(nèi)分子排列緊密，分子間作用力增強(qiáng)[13]。宏觀表現(xiàn)為復(fù)合膜的機(jī)械性能增加，即抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率增加，水蒸氣透過系數(shù)減小。然而，進(jìn)一步提高殼聚糖或明膠濃度，又會使水蒸氣透過系數(shù)出現(xiàn)反彈。因此，選擇殼聚糖濃度為1%～1.5%，明膠濃度1.25%～1.75%進(jìn)行進(jìn)一步析因優(yōu)化設(shè)計(jì)，以其獲得性能最優(yōu)化復(fù)合膜制備工藝。

析因設(shè)計(jì)結(jié)果及析因設(shè)計(jì)結(jié)果分析見表2 和表3。

表2 析因設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The results of the factorial design

根據(jù)表2、表3 可知，明膠濃度對復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)影響最大，最大極差為0.177。最優(yōu)組合為A2B1，即殼聚糖濃度1.25%，明膠濃度1.25%。其水蒸氣透過系數(shù)為 0.563 5 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2，抗拉強(qiáng)度為12.64 MPa，斷裂伸長率為119.44%。以抗拉強(qiáng)度為考察指標(biāo)，殼聚糖濃度對復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度影響最大，最大極差為3.88。最優(yōu)組合為A3B2，即殼聚糖濃度1.5%，明膠1.5%。其水蒸氣透過系數(shù)為0.849 2 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2，抗拉強(qiáng)度為 15.21 MPa，斷裂伸長率為109.16%。以斷裂伸長率為考察指標(biāo)，殼聚糖濃度對復(fù)合膜斷裂伸長率的影響最大，最大極差為12.1。最優(yōu)組合為A3B3，即殼聚糖濃度1.5%，明膠濃度1.75%。其水蒸氣透過系數(shù)為 0.507 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2，抗拉強(qiáng)度為14.98 MPa，斷裂伸長率為133.22%。綜上所述，考慮到食品包裝材料的要求，選擇水蒸氣透過系數(shù)最低、抗拉強(qiáng)度較大、斷裂伸長率適中的組分，確定最佳膜的組合為：殼聚糖濃度1.5 %，明膠濃度1.25%。由該組合制備的復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)為0.403 mg·mm·kPa-1·h-1·m-2，抗拉強(qiáng)度為 13.24 MPa，斷裂伸長率為112.45%。該復(fù)合膜與現(xiàn)有報道的殼聚糖-明膠、殼聚糖-海藻酸鈉、殼聚糖-羧甲基纖維素復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度與斷裂伸長率相當(dāng)，但水蒸氣透過系數(shù)至少低1 個數(shù)量級，該指標(biāo)性能顯著提升[14-16]。

表3 析因設(shè)計(jì)結(jié)果分析表Table 3 Analysis of factorial design experiment results

2.2 復(fù)合膜的表征

首先對最優(yōu)化組成復(fù)合膜進(jìn)行紅外光譜表征結(jié)構(gòu)表征。殼聚糖、明膠及復(fù)合膜的紅外光譜圖見圖2。

殼聚糖的吸收峰中，3 439.8 cm-1為N-H 和O-H的伸縮振動產(chǎn)生，2 925.0 cm-1為C-H 伸縮振動，1 631.0 cm-1為 C＝O 的伸縮振動，即酰胺 I 帶[17]。明膠的吸收峰中，3 441.1 cm-1為N-H 和O-H 的伸縮振動產(chǎn)生，2 925.4 cm-1為 C-H 伸縮振動，1 637.6、1459.2 cm-1及1 261.8 cm-1分別為酰胺I 帶，酰胺II 帶和酰胺III帶[18]。復(fù)合膜的吸收峰中，3 437.1 cm-1為N-H 和O-H的伸縮振動產(chǎn)生，2 925.8 cm-1為C-H 伸縮振動，1 635.2、1 458.2 cm-1及 1 266.8 cm-1分別為酰胺 I 帶，酰胺II 帶和酰胺III 帶。與明膠膜相比，復(fù)合膜的特征峰幾乎都向低波段偏移，但未超過殼聚糖的特征峰波數(shù)。研究表明，若兩種水性高分子相容性良好，分子間的氫鍵相互作用會加強(qiáng)，表現(xiàn)為羧基振動峰向低波數(shù)方向偏移[19]。由此可見，1.5%殼聚糖和1.25%明膠混合后制備的復(fù)合膜內(nèi)部有較強(qiáng)的氫鍵作用，具有良好的相容性。

圖2 殼聚糖膜、明膠膜及復(fù)合膜紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of chitosan film，gelatin film and composite film

進(jìn)一步應(yīng)用X 射線衍射驗(yàn)證殼聚糖與明膠之間的相互作用。圖3 為殼聚糖、明膠及復(fù)合膜的X 射線衍射圖譜。

圖3 殼聚糖膜、明膠膜及復(fù)合膜X 射線衍射圖Fig.3 XRD spectra of chitosan film，gelatin film and composite film

從圖3 中可以發(fā)現(xiàn)，殼聚糖膜的衍射峰主要在2θ 為8.16°、11.18°、18°和 22.9°處，強(qiáng)度分別為 389、728、738和612。明膠膜的衍射峰主要在2θ 為7.82°和20.54°處，強(qiáng)度分別為281 和464。復(fù)合膜的衍射峰主要在2θ為 8.18°、11.18°、18.06°和 22.6°，強(qiáng)度分別為 385、535、640 和602。與殼聚糖膜和明膠膜相比，復(fù)合膜的峰保留了殼聚糖的大部分峰，但峰的位置發(fā)生了偏移，強(qiáng)度有明顯變化，這可能是混入的明膠干擾了原來殼聚糖的結(jié)晶，與現(xiàn)有報道的膠原對殼聚糖纖維復(fù)合晶型影響類似，說明兩者之間產(chǎn)生了一定的相互作用[20]。

復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度、斷裂伸長率和水蒸氣透過系數(shù)是由組成膜的大分子決定的。這些大分子在成膜時是否均勻，是否完全溶解將直接影響可食膜的性質(zhì)。殼聚糖/明膠膜及復(fù)合膜掃描電鏡圖見圖4。

圖4 殼聚糖/明膠膜及復(fù)合膜掃描電鏡圖Fig.4 SEM analysis of chitosan/gelatin film and composite film

從圖4 可知，殼聚糖膜表面比較平整，沒有出現(xiàn)明顯的氣泡；其橫斷面層次分明，較光滑。明膠膜表面相對不光滑，能看到一些白色區(qū)域，這可能是明膠沒有完全溶解或有出現(xiàn)顆粒化的趨勢造成的；其橫斷面雖有分層，但是表面粗糙。復(fù)合膜的表面相對均一，很光滑，無明顯氣泡和突起物；其橫斷面比殼聚糖膜的還平整，紋理清晰。由此可見，混合后的殼聚糖和明膠形成了均一的體系，相容性好，具有較強(qiáng)的分子間作用力。因而復(fù)合膜緊致，機(jī)械性能良好，水蒸氣不易透過。

2.3 復(fù)合膜液的抗菌性能

作為食品包裝材料，可食復(fù)合膜具有一定的抑菌作用能有效延長食品的保質(zhì)期。本研究以大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為模型微生物，系統(tǒng)對照考察了最優(yōu)化復(fù)合膜配方的抑菌性能。

殼聚糖/明膠膜復(fù)合膜液抑菌性能見圖5。

如圖5 所示，殼聚糖膜液和復(fù)合膜液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌作用，而明膠膜液對測試的3 種細(xì)菌均無明顯抑菌作用（D/E/F）。

圖5 殼聚糖/明膠膜復(fù)合膜液抑菌性能Fig.5 Antimicrobial activity of chitosan/gelatin composite film solutions

殼聚糖膜液、明膠膜液和復(fù)合膜液的抑菌效率見表4。

表4 殼聚糖膜液、明膠膜液和復(fù)合膜液的抑菌效率Table 4 Bacteriostatic efficiency of chitosan，gelatin and composite film solution

由表4 可知，殼聚糖組分顯示出顯著的抑菌效應(yīng)，殼聚糖膜液的抑菌圈比復(fù)合膜液的平均大約5 mm，這是因?yàn)閺?fù)合膜液中1.5%殼聚糖絕對加入量低于參照組殼聚糖膜液中的加入量，使復(fù)合膜液抑菌試驗(yàn)組（G/H/I）培養(yǎng)基內(nèi)部平均殼聚糖濃度低于殼聚糖膜液對照組（A/B/C），抑菌效應(yīng)與殼聚糖濃度呈正相關(guān)關(guān)系，與現(xiàn)有報道完全一致[4，14]。

3 結(jié)論

當(dāng)殼聚糖濃度為1.5%、明膠濃度為1.25%時，制備出來的復(fù)合膜機(jī)械性能良好，水蒸氣透過系數(shù)較低，符合可食膜作為食品包裝材料的要求。通過紅外光譜、X 射線衍射、掃描電鏡等手段對復(fù)合膜進(jìn)行進(jìn)一步表征，結(jié)果表明與殼聚糖膜和明膠膜相比，復(fù)合膜的內(nèi)部分子之間有較強(qiáng)的氫鍵和分子間作用力，膜內(nèi)部致密，水蒸氣不容易通過?？咕囼?yàn)表明，復(fù)合膜液對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有顯著的抑制作用。因此，該復(fù)合膜在食品包裝上具有較好的應(yīng)用價值。