孫曉玲

（長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，吉林長(zhǎng)春130033）

人參為五加科人參屬植物，具有安神、治勞傷虛損、食少、倦怠、補(bǔ)氣固脫、健脾益肺、寧心益智、養(yǎng)血生津及久虛不復(fù)、氣血津液不足之癥的功效[1]。人參中含有人參皂苷、氨基酸和多肽、多糖類、維生素、揮發(fā)油和17 種以上微量元素等功能性成分[2]。有科學(xué)研究表明，人參可以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)穩(wěn)定、促進(jìn)腦垂體對(duì)能量分子的吸收，提高心臟功能、降低血糖指標(biāo)、增強(qiáng)人體的免疫力以及抗癌抗氧化的作用[3-4]。我國(guó)是世界上最重要的人參產(chǎn)出國(guó)和輸出國(guó)之一，近年來(lái)，在有效成分分離與提純、新產(chǎn)品的研發(fā)等方面都取得了較大進(jìn)展。

人參多糖作為人參中重要的活性成分，不僅具有抗菌、抗腫瘤、抗衰老等功效，還具有降血糖、降血壓、降脂、抗炎等生物活性[5]。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)人參資源的綜合利用，避免資源浪費(fèi)，許多學(xué)者對(duì)人參莖葉的化學(xué)成分進(jìn)行大量研究，盡管莖葉中多糖的含量與根部相比較低，但多糖成分及種類大致相同，所起到的藥理作用也非常相似[6]。本試驗(yàn)對(duì)人參莖葉中的粗多糖的提取工藝進(jìn)行研究，采用水提醇沉法分離提取人參莖葉中的粗多糖，確定最佳提取工藝參數(shù)，為人參莖葉多糖的提取方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參莖葉：吉林省長(zhǎng)白山；硫酸亞鐵銨、鄰二氮菲、檸檬酸、檸檬酸鈉：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

754 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：天益化工材料有限公司；FA2004W 電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；SC-3610 高速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；RB-552B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 人參莖葉粗多糖制備工藝流程

人參莖葉→干燥→粉碎→過(guò)40 目篩→脫脂→水浴提取→濃縮→加乙醇→離心→取沉淀→真空干燥→人參莖葉多糖

1.3.2 水提醇沉淀法

稱取20.0 g 人參粉末，加入10 倍量的蒸餾水，在90 ℃下提取5 h，過(guò)濾，殘?jiān)偌? 倍量的水提取1 h，把兩次過(guò)濾的濾液合并，濃縮至50 mL，加入與濃縮后的藥液同體積的石油醚萃取2 次脫脂，再加入一定濃度的乙醇，靜置12 h，真空泵抽濾，將濾液于高速離心機(jī)中以3 000 r/min，離心30 min，得上清液待測(cè)。

1.3.3 溶液的制備

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取在105 ℃下干燥至恒重的分析純葡萄糖10.00 mg，用蒸餾水溶解后定容于100 mL 容量瓶中，配制成濃度為0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

苯酚溶液的制備：將苯酚試劑放在60 ℃水浴中，待有少量液體出現(xiàn)時(shí)，吸取5 g 至100 mL 容量瓶中，加水溶解，定容，搖勻，再轉(zhuǎn)入棕色瓶中，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液管準(zhǔn)確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置于 50 mL 容量瓶中，加蒸餾水至刻度。分別加入5%苯酚3 mL、15 mL 濃硫酸，搖勻，放置10 min 后于40 ℃水浴加熱10 min，取出后冷水浴5 min，在波長(zhǎng)490 m 下測(cè)定吸光度，同時(shí)做空白對(duì)照，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 多糖含量及提取率的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[7]。多糖提取率/%=多糖質(zhì)量（g）/原料質(zhì)量（g）×100

1.3.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.6.1 提取溫度對(duì)人參莖葉多糖提取率的影響

以干燥粉碎后的人參莖葉為原料，料液比1∶20（g/mL），提取時(shí)間 4 h，pH6，提取溫度 50、60、70、80、90、100 ℃，最后測(cè)定多糖的提取率。

1.3.6.2 提取時(shí)間對(duì)人參莖葉多糖提取率的影響

以干燥粉碎后的人參莖葉為原料，料液比1∶20（g/mL），提取溫度 80 ℃，pH 6，提取時(shí)間 1、2、3、4、5、6、7 h，最后測(cè)定多糖的提取率。

1.3.6.3 料液比對(duì)人參莖葉多糖提取率的影響

以干燥粉碎后的人參莖葉為原料，選擇提取溫度80 ℃，提取時(shí)間 4 h，pH 6，料液比 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），最后測(cè)定多糖的提取率。

1.3.6.4 pH 值對(duì)人參莖葉多糖提取率的影響

以干燥粉碎后的人參莖葉為原料，料液比1∶20（g/mL），提取溫度 80 ℃，提取時(shí)間 4 h，pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，最后測(cè)定多糖的提取率。

1.3.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以人參莖葉提取率為指標(biāo)，分別考察提取溫度、提取時(shí)間、料液比、pH 值對(duì)人參莖葉多糖提取率的影響，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，確定最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平Table 1 Factor codes and levels of the orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 人參莖葉多糖提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)人參莖葉多糖提取率的影響

提取溫度對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide

由圖1 可知，當(dāng)提取溫度在 50 ℃～90 ℃之間，多糖的提取率隨著溫度的升高而增加，溫度超過(guò)90 ℃時(shí)，提取率出現(xiàn)下降。這是因?yàn)闇囟壬?，溶劑的滲透能力和溶解能力提高，分子動(dòng)能增加，使原料中的多糖更有效地溶出，提取率不斷提高；但溫度達(dá)到100 ℃后，料液中的多糖分子受到破壞，多糖含量減少[8]。因此，初步確定提取溫度為90 ℃。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)人參莖葉多糖提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effects of extraction time on extraction rate of polysaccharide

由圖2 可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的提取率逐漸增加，但是時(shí)間在5 h 后，提取率出現(xiàn)略微下降。提取時(shí)間較短時(shí)，產(chǎn)物不充分溶解；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，大分子多糖容易發(fā)生斷裂，在后期處理時(shí)出現(xiàn)損失現(xiàn)象，影響提取效果[9]。因此，提取時(shí)間以5 h 為宜。

2.1.3 料液比對(duì)人參莖葉多糖提取率的影響

料液比對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effects of material-to-water ratio on extraction rate of polysaccharide

由圖3 可以看出，隨著溶劑的不斷增加，多糖的提取率也不斷升高，當(dāng)料液比在 1 ∶20（g/mL）～1 ∶23（g/mL）之間時(shí)，提取率開(kāi)始緩慢下降。這是因?yàn)樵跓崃恳欢ㄇ闆r下，固相與液相之間存在濃度差，溶劑量越多，人參莖葉細(xì)胞內(nèi)外的多糖濃度梯度就越大，使多糖擴(kuò)散到溶劑里的含量增加，繼續(xù)增大溶劑量，多糖提取率隨之降低[9-10]。因此初步確定料液比的最適比例為1 ∶20（g/mL）。

2.1.4 pH 值對(duì)人參莖葉多糖提取率的影響

pH 值對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 pH 對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effects of pH on extraction rate of polysaccharide

從圖4 可以看出，隨著pH 值的增大，多糖提取率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH 值達(dá)到6.0 以后提取率開(kāi)始下降，原因可能是提取液在弱酸條件下，有利于原料中多糖的溶出，當(dāng)提取液呈堿性時(shí)，一些不利于多糖的成分被提出[11]，進(jìn)而影響了多糖的提取率，因此提取的pH 值選擇6.0 為佳。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，選用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 2 Results of the orthogonal test

由表2 可知，各因素對(duì)人參莖葉多糖提取率影響程度的主次順序?yàn)锳＞C＞B＞D，即提取溫度為主要影響因素，其次為料液比，再次為提取時(shí)間，pH 值影響最小，最佳方案為A3B1C2D1，即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間 4 h、料液比 1 ∶25（g/mL）、pH5.0。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance

表3 可知，提取溫度對(duì)人參莖葉多糖提取率有顯著影響，其余因素影響不大。采用水提醇沉法提取人參莖葉多糖時(shí)，為達(dá)到最佳提取效果，需要重點(diǎn)控制提取溫度。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳工藝條件下提取人參莖葉多糖工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)Table 4 Verification test for the optimal processing

試驗(yàn)結(jié)果表明，在最佳工藝條件下，人參莖葉多糖的提取率為5.64%。

3 結(jié)論

本研究采用水提醇沉法提取人參莖葉多糖，通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)及驗(yàn)證試驗(yàn)保證了試驗(yàn)的精確性。提取溫度、提取時(shí)間、料液比、pH 值是提取多糖的主要因素，經(jīng)過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)，測(cè)得最優(yōu)工藝條件為：提取溫度 90 ℃、提取時(shí)間 4 h、料液比 1 ∶25（g/mL）、pH5.0。本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)優(yōu)化的工藝參數(shù)為人參資源得到合理的開(kāi)發(fā)與利用提供了一定的理論依據(jù)。