陳凌，賀偉強(qiáng)，曹巧巧

（嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)與環(huán)境學(xué)院，浙江嘉興314036）

馬齒莧（Portulaca oleracea）為馬齒莧科1 年生肉質(zhì)草本植物，在我國分布廣泛，資源豐富，是我國衛(wèi)生部劃定的藥食同源的野生植物之一[1]。馬齒莧中的生物活性物質(zhì)主要是黃酮和多糖，馬齒莧活性物質(zhì)具有明顯的抗癌抗衰老、治療糖尿病、降血脂，預(yù)防冠心病、高血壓、肥胖癥，抑制腫瘤細(xì)胞生長及延長細(xì)胞壽命的作用[2-7]。馬齒莧多糖對(duì)核桃油的抗氧化性最好[8]，因此，有效提取馬齒莧多糖對(duì)開發(fā)多功能食品抗氧化劑具有重要意義。

酶法提取多糖具有快速、高效、反應(yīng)溫度溫和、易于控制等諸多優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用在植物多糖的提取上。酶法提取馬齒莧多糖的工藝已有一些報(bào)道，錢志偉等[9]用纖維素酶提取馬齒莧多糖，呂萍等[10]比較了蛋白酶、纖維素酶、果膠酶酶提取馬齒莧多糖，米熱班古·木太力甫等[2]用纖維素酶超聲輔助法提取馬齒莧多糖，他們都是以干制馬齒莧為原料，以多糖含量為指標(biāo)研究馬齒莧多糖提取工藝。陳莉萍等[11]研究比較了鮮、干馬齒莧在化學(xué)成分以及質(zhì)量濃度、抗菌作用方面均有明顯不同，新鮮馬齒莧的抗菌作用明顯優(yōu)于干馬齒莧。而用新鮮馬齒莧酶解提取多糖的研究至今未見，由于Dubois 等[12]建立的苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量，是以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，其原理是利用濃硫酸將多糖水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，再和苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法測(cè)定其含量。本試驗(yàn)前期研究了不同方法提取的馬齒莧多糖對(duì)Fe3+、Ce4+的還原能力以及對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）和羥自由基（·OH）的清除作用，結(jié)果表明果膠酶酶解提取的多糖抗氧化性最強(qiáng)[13]，因此我們以鮮馬齒莧為原料，以多糖含量和對(duì)DPPH 自由基的清除率（雙指標(biāo)）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化果膠酶提取馬齒莧多糖的工藝，雙指標(biāo)用以修正酶解過度產(chǎn)生的葡萄糖帶來的正誤差，并比較以單指標(biāo)（多糖）和以雙指標(biāo)為響應(yīng)值提取的馬齒莧多糖的抗氧化性，為馬齒莧多糖的高效提取提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

馬齒莧采摘于嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)，經(jīng)本院陳玉琴副教授鑒定為馬齒莧科馬齒莧屬一年生草本植物。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；無水酒精、葡萄糖、濃硫酸、苯酚（均為分析純）：上海聯(lián)試化工試劑有限公司；果膠酶（酶活力≥50.0 U/g）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

DK-S24 型恒溫水浴鍋：上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；T6-紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；BS224S 型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；JYZ-E6 九陽原汁機(jī)：九陽股份有限公司；Synergy UV 超純水儀：Merck Millipore（美國）公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 馬齒莧多糖的提取

新鮮馬齒莧洗凈、用純凈水過一遍，蒸汽殺青，用螺旋榨汁機(jī)壓榨，以超純水為溶劑用果膠酶酶解提取馬齒莧多糖，酶解數(shù)小時(shí)后，加熱至100 ℃5 min 鈍化酶活性，過濾得酶解液，儲(chǔ)藏于4 ℃冰箱備用。采用苯酚-硫酸法測(cè)定馬齒莧酶解液中多糖含量[14]，回歸方程為y=0.679 3x-0.012 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，線性范圍在0～8.75 μg/mL，并計(jì)算馬齒莧多糖得率。

多糖得率/（g/kg）=提取多糖的質(zhì)量（g）/鮮馬齒莧的質(zhì)量（kg）

1.3.2 馬齒莧酶解液對(duì)DPPH 自由基清除率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取30.6 mg DPPH，用70%乙醇溶解后定容于500 mL 容量瓶，作為儲(chǔ)備液儲(chǔ)藏在棕色瓶于4 ℃的冰箱中保存。利用DPPH 溶液的紫紅色，在加入抗氧化劑后顏色變淡來表示其對(duì)DPPH 自由基的清除能力。取0.50 mL 馬齒莧酶解液加入10.00 mL DPPH 乙醇溶液，搖勻，37 ℃避光反應(yīng) 15 min 后，在 523 nm 波長處測(cè)定其吸光度（以70 %乙醇為空白調(diào)零），重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。根據(jù)下列公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH 自由基的清除率：

DPPH 自由基清除率/%=[1－（Ai－Aj）/A0]×100

式中：A0表示 0.50 mL 水和 10.00 mL DPPH 自由基反應(yīng)液的吸光值；Ai表示0.50 mL 樣品和10.00 mL DPPH 自由基反應(yīng)液的吸光值；Aj表示0.50 mL 樣品和10.00 mL 70%乙醇的吸光值。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

采用1.3.1 中方法提取馬齒莧多糖，提取條件為：固定提取條件為 料液比 1 ∶20（g/mL），酶解溫度為 30 ℃，提取時(shí)間為 1.5 h，考察酶添加量（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L）對(duì)馬齒莧多糖得率及對(duì)DPPH 自由基清除率的影響；固定提取條件為料液比為 1 ∶20（g/mL），酶解溫度為30 ℃，酶添加量為0.2 g/L，考察提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）對(duì)馬齒莧多糖得率及對(duì) DPPH 自由基清除率的影響；固定提取條件為料液比為1 ∶20（g/mL），酶添加量為0.2 g/L，提取時(shí)間為1.5 h，考察提取溫度（30、40、50、60、70 ℃） 對(duì)馬齒莧多糖得率及對(duì) DPPH自由基清除率的影響。

1.3.4 Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定對(duì)多糖得率和對(duì)DPPH 自由基清除率影響大的3 個(gè)水平，建立三因素三水平的Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)，以多糖得率和對(duì)DPPH 自由基清除率為響應(yīng)值，各因素的3 個(gè)水平采用-1、0、+1 進(jìn)行編碼，具體見表 1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 9.0 軟件作圖，Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 果膠酶添加量對(duì)馬齒莧多糖得率及DPPH 自由基的清除率的影響

果膠酶添加量對(duì)馬齒莧多糖得率及DPPH 自由基的清除率的影響見圖1。

圖1 酶添加量對(duì)多糖得率及DPPH 自由基清除率的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on polysaccharide yield and DPPH free radical clearance

由圖1 可見，隨著果膠酶添加量的增加，馬齒莧多糖得率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。由于果膠酶的酶解作用，使細(xì)胞壁多糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，多糖不斷被溶出，當(dāng)果膠酶添加量大于0.2 g/L 時(shí)，隨著細(xì)胞內(nèi)溶物釋放量變多，多糖的溶解度降低導(dǎo)致得率降低[15]。這和鄒雪等[16]的研究相吻合，鄒雪等研究了不同濃度果膠酶對(duì)藍(lán)莓半甜紅酒風(fēng)味成分的影響，結(jié)果表明，添加果膠酶處理后藍(lán)莓半甜紅酒的總酸、甲醇、雜醇油比未添加果膠酶時(shí)均有所提升，其原因可能是多糖轉(zhuǎn)化為酸和醇。多糖得率最大時(shí)對(duì)DPPH 自由基的清除率并不是最大，其原因是此時(shí)測(cè)得的多糖包含了酶解過度產(chǎn)生的葡萄糖。因此選擇多糖得率和對(duì)DPPH 自由基的清除率相對(duì)較大的果膠酶添加量為0.2 g/L。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)馬齒莧多糖得率及DPPH 自由基的清除率的影響

酶解時(shí)間對(duì)馬齒莧多糖得率及DPPH 自由基的清除率的影響見圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)馬齒莧多糖得率及DPPH 自由基清除率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on polysaccharide yield and DPPH free radical clearance of Portulaca oleracea

由圖2 可知，提取時(shí)間低于1.5 h 時(shí)，馬齒莧多糖得率隨酶解時(shí)間的增加而增加，超過1.5 h 之后隨時(shí)間的增加而下降。表明，提取時(shí)間對(duì)多糖得率有著比較明顯的影響，時(shí)間過短，多糖提取不充分，時(shí)間過長，可能引起多糖的分解，進(jìn)而導(dǎo)致多糖得率下降。對(duì)DPPH自由基的清除率在3 h 時(shí)達(dá)到最高，這可能與其他抗氧化成分（如黃酮、酚類等）的提取有關(guān)，從多糖得率和對(duì)DPPH 自由基的清除率兩方面考慮選擇酶解時(shí)間為1.5 h。

2.1.3 酶解溫度對(duì)馬齒莧多糖得率及DPPH 自由基的清除率的影響

酶解溫度對(duì)馬齒莧多糖得率及DPPH 自由基的清除率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)馬齒莧多糖得率及DPPH 自由基清除率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on polysaccharide yield and DPPH free radical clearance of Portulaca oleracea

由圖3 可知，在30 ℃～40 ℃時(shí)隨溫度的升高多糖得率和對(duì)DPPH 自由基的清除率升高，溫度高于40 ℃多糖得率和對(duì)DPPH 自由基的清除率開始下降，因?yàn)闇囟雀哂?0 ℃酶開始失活。70 ℃時(shí)多糖得率和對(duì)DPPH 自由基的清除率又開始上升，這時(shí)是溫度的升高使多糖得率增加。70 ℃時(shí)對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到最高，而多糖得率并不是最大，這可能是由于溫度的升高引起其它活性成分如黃酮的提取率增加有關(guān)。兩者綜合選擇酶解溫度為40 ℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 Box-Benhken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以果膠酶添加量（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）為自變量，對(duì) DPPH 自由基的清除率（Y1）和多糖得率（Y2）為因變量（響應(yīng)值），設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and experimental results

2.2.2 回歸方程方差分析

以酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度為自變量，多糖得率作為響應(yīng)值，利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行非線性回歸的二次多項(xiàng)式模型擬合，預(yù)測(cè)的模型如下：

Y2=2.79+0.12A-0.11B+0.037C-0.24AB+0.005AC-0.3BC+0.53A2+0.48B2-0.37C2

回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 多糖得率試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance table of experimental results of extraction rate of polysaccharides

續(xù)表3 多糖得率試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Continue table 3 Analysis of variance table of experimental results of extraction rate of polysaccharides

由表3 可知，模型的 F=25.53，P＜0.01，表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng) F=0.57，P＞0.05，不顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.978 7，說明該模型能解釋97.87%響應(yīng)值的變化，因而該模型的擬合程度比較好，能準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)實(shí)際情況。其校正決定系數(shù)R2adj＝0.940 4，表明此模型能解釋94.04%響應(yīng)值變化，說明試驗(yàn)有較好的精確度和可靠性?？梢杂么四Ｐ蛠矸治龊皖A(yù)測(cè)馬齒莧多糖提取工藝結(jié)果。由P 值的大小可以得出各因素對(duì)于馬齒莧多糖得率影響順序?yàn)椋篈（酶解溫度）＞B（酶解時(shí)間）＞C（酶添加量）。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)回歸方程得到響應(yīng)面分析圖，考察擬合之后的響應(yīng)曲面形狀，分析所選定的3 個(gè)變量對(duì)考察的2 個(gè)響應(yīng)值的影響。通過對(duì)響應(yīng)面等值線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，并且可以通過對(duì)3D 曲面圖的分析，直觀地評(píng)價(jià)各因素間的交互作用[17-18]。在響應(yīng)面圖中，曲面的傾斜度表明該試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高，即坡度越陡峭，表明該試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。響應(yīng)面等高線圖可以直觀地反映出兩個(gè)因素間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，等高線的形狀越接近橢圓形，表示兩個(gè)因素交互效應(yīng)越強(qiáng)，而圓形則反之[19-20]。如圖4 響應(yīng)曲面坡度較陡峭，說明酶添加量與酶解時(shí)間之間交互作用對(duì)多糖得率的影響較強(qiáng)。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 單指標(biāo)提取

圖4 酶添加量和酶解時(shí)間的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Responsive surfaces and contours of enzyme addition and enzymatic hydrolysis time

圖5 酶添加量和酶解溫度的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Responsive surfaces and contours of the enzyme addition amount and the enzymolysis temperature

圖6 酶解時(shí)間和酶解溫度的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Responsive surfaces and contours of enzymatic hydrolysis time and enzymolysis temperature

以馬齒莧多糖濃度為考察指標(biāo)，根據(jù)Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)所得回歸方程的最優(yōu)預(yù)測(cè)值求解，最佳工藝條件為料液比1 ∶20（g/mL）、果膠酶添加量0.246 g/L、酶解溫度44.2 ℃、酶解時(shí)間1.5 h。在此條件下平行3 次試驗(yàn)多糖平均得率為8.13 g/kg ，RSD 為2.50%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.18%。

2.3.2 雙指標(biāo)提取

以馬齒莧多糖濃度和對(duì)DPPH 自由基清除率為考察指標(biāo)，根據(jù)Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)所得回歸方程的最優(yōu)預(yù)測(cè)值求解，馬齒莧多糖提取的最佳工藝條件為：料液比 1 ∶20（g/mL），果膠酶添加量為 0.15 g/L，酶解溫度為39.0 ℃，酶解時(shí)間為2.0 h，馬齒莧多糖得率的理論預(yù)測(cè)值為4.15 g/kg。平行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)所得多糖得率為4.22 g/kg，RSD 為1.53%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.52%。

2.3.3 馬齒莧多糖與VC的抗氧化性比較

圖7 馬齒莧多糖和VC 對(duì)DPPH 自由基清除率的比較Fig.7 Comparison of DPPH free radical clearance rates of Portulaca oleracea polysaccharides and VC

用單指標(biāo)和雙指標(biāo)為響應(yīng)值提取的馬齒莧多糖對(duì)DPPH 自由基的抗氧化性如圖7 所示，馬齒莧多糖對(duì)DPPH 自由基都有較強(qiáng)的清除能力，但比VC的抗氧化性差。以單、雙指標(biāo)為響應(yīng)值提取的馬齒莧多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率相差不大，說明用這2 組參數(shù)提取的馬齒莧多糖的含量差不多。單指標(biāo)所需果膠酶的用量大于雙指標(biāo)，提取溫度高于雙指標(biāo)，用苯酚-硫酸法測(cè)得多糖含量雖然高于雙指標(biāo)，但實(shí)際上包含了部分多糖酶解的葡萄糖。因此雙指標(biāo)能很好地校正多糖測(cè)定方法的不足，使多糖提取工藝的研究更切合實(shí)際。

3 結(jié)論

響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧酶法提取多糖的工藝，應(yīng)以馬齒莧多糖得率和對(duì)DPPH 自由基的清除率為因變量，雙指標(biāo)以修正酶解過度產(chǎn)生的葡萄糖，使苯酚-硫酸法測(cè)得的多糖更符合酶解液中多糖含量的實(shí)際。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行分析，對(duì)果膠酶酶解提取鮮馬齒莧中的多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了酶法提取馬齒莧多糖的回歸模型，由該模型優(yōu)化的馬齒莧多糖提取的最佳工藝條件為：料液比1 ∶20（g/mL），果膠酶添加量0.15 g/L，酶解溫度39.0 ℃，酶解時(shí)間2.0 h，多糖得率達(dá)到4.22 g/kg，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.52%；對(duì)DPPH 自由基的平均清除率為53.1%，RSD為1.49%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.39%。果膠酶法提取馬齒莧多糖，提取工藝簡潔，提取條件溫和，是一種低能耗的提取馬齒莧多糖的方法。