石丹丹 邵詩佳 宋 奇 于新祥 高召軍 李 珂 齊永秀

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

舒腦欣滴丸是由川芎、當(dāng)歸兩種藥配伍[1]，以川芎為君藥，輔以當(dāng)歸為臣，研制成舒腦欣滴丸，進(jìn)一步增強(qiáng)了川芎活血散淤，通絡(luò)止痛之力，同時兼顧養(yǎng)血柔絡(luò)[2]。舒腦欣滴丸具有較好的藥理作用，以緩絡(luò)脈之拘急，通補(bǔ)兼施，通調(diào)并舉，以達(dá)清腦、養(yǎng)腦護(hù)腦的作用。臨床主要用于血虛血瘀引起的偏頭痛，健忘、失眠等。研究表明舒腦欣滴丸對大鼠腦血流量有一定的增加作用；對低壓缺氧小鼠血液中乳酸含量和全血粘度有一定降低作用[3]。川芎中主要含有內(nèi)酯類、生物堿類、酚類以及揮發(fā)油等多種化合物，如二聚藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯 I、川芎三萜、阿魏酸、咖啡酸等多種化學(xué)成分；當(dāng)歸主要含有洋川芎內(nèi)酯雙藁苯內(nèi)酯、阿魏酸、阿魏醛等化學(xué)成分[4]。舒腦欣滴丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探索，已有研究表明舒腦欣滴丸給藥后，洋川芎內(nèi)酯A，Z-藁苯內(nèi)酯；Z-藁苯內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯I/H四種成分能透過血腦屏障進(jìn)入腦組織。本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，研究舒腦欣滴丸中阿魏酸在大鼠體內(nèi)的吸收、分布、代謝規(guī)律，為探討舒腦欣滴丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥材和試劑

舒腦欣滴丸(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司第六中藥廠，批號為Z20050041)；對照品阿魏酸(上海源葉生物有限公司，批號H27I7L16718)；甲醇(色譜純)；水(娃哈哈純凈水)；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters公司，配有2998二極管陣列檢測器，自動進(jìn)樣器，Empower色譜工作站)；KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TG凱特離心機(jī)(藍(lán)城凱特實驗儀器有限公司)；氮?dú)獯蹈蓛x(上海東方分析設(shè)施公司)；XW-80A渦旋混合儀(海門市其林爾雨儀器制造有限公司)；0.22 μm濾膜。

1.3 實驗動物

雄性健康SD大鼠[濟(jì)南朋悅動物繁育有限公司，批號SYXK(魯)20170023]，體重(280±10)g。實驗前飼養(yǎng)3天以適應(yīng)環(huán)境。

2 方法

2.1 色譜條件

Venusil MP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相∶甲醇-1%冰醋酸水溶液為35∶65，流速為1 mL·min-1，檢測波長275 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液的配制 精密稱取阿魏酸對照品適量，置10 mL容量瓶中，加 70%甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，得阿魏酸濃度為 200 μg·mL-1的對照品儲備液，4℃冰箱保存。使用前稀釋成工作溶液。

2.2.2樣品混懸液配制 取舒腦欣滴丸20粒，研碎，精密稱定 0.855 g(相當(dāng)于阿魏酸 0.35%)，加2 mL水，混勻，制成樣品混懸液，供大鼠灌胃給藥。

2.3 血漿樣品的處理

取給藥后各時間點血漿200 μL，置1.5 mL離心管中，加入50 μL 0.6 mol·L-1HCl，渦旋混勻，加入乙酸乙酯 0.6 mL，渦旋 3 min，5 000 r·min-1離心10 min，取上層有機(jī)相，重復(fù)提取3次，合并有機(jī)相，25℃氮?dú)獯蹈?，?00 μL甲醇復(fù)溶，12 000 r·min-1離心5 min，上層清液進(jìn)樣分析。

2.4 阿魏酸藥動學(xué)研究

取SD大鼠6只，雄性，稱重，順序編號，禁食12 h，自由飲水，分別灌胃給藥舒腦欣滴丸藥品混懸液(相當(dāng)于阿魏酸 10 mg·kg-1)，并于給藥后 0、0.17、0.33、0.5、0.75、1、2、3、4、8、12 h斷尾取血0.5 mL，置 1.5 mL抗凝離心管中，離心取血漿，并灌胃給與相同量的生理鹽水，按“2.3”項下方法處理樣品，測定阿魏酸濃度，利用 DAS2.1藥動學(xué)軟件統(tǒng)計分析，計算藥動學(xué)參數(shù)。

3 實驗結(jié)果

3.1 方法專屬性考察

分別取大鼠空白血漿，添加阿魏酸對照品的空白血漿，大鼠灌胃給藥后的血漿樣品，按2.3項下方法處理后進(jìn)行分析，阿魏酸保留時間為 12.4 min，結(jié)果表明空白血漿的內(nèi)源性物質(zhì)以及含藥血漿中的其他成分與阿魏酸分離度良好，對阿魏酸含量測定無干擾，見圖1。

圖1 空白血漿(A)、阿魏酸對照品(B)和含藥血漿樣品(C)HPLC色譜圖(峰1為阿魏酸)

3.2 線性關(guān)系、最低檢測限、定量限考察

取大鼠空白血漿200 μL，加入不同濃度的阿魏酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度分別為0.12，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)樣品，在“2.3”項下處理對照品血漿樣品，進(jìn)樣分析并記錄樣品峰面積，以濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，求得阿魏酸的回歸方程為Y=46 309X-18 119(r=0.999 5)，表明阿魏酸在0.12～10.0 μg·mL-1線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在此色譜條件下進(jìn)行測定，血漿樣品中阿魏酸最低檢測限分別為0.04 μg·mL-1，血漿樣品中阿魏酸最低定量限分別為0.12 μg·mL-1。

3.3 精密度實驗

取空白血漿加入阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低(0.2 μg·mL-1)、中(2.0 μg·mL-1)、高(8.0 μg·mL-1)3種濃度的含藥血漿樣品，每個濃度3個樣品，日內(nèi)各濃度重復(fù)進(jìn)樣5次，日間連續(xù)測定3 d，計算其日內(nèi)、日間精密度，日內(nèi)精密度 RSD 為3.54%，日間精密度 RSD 為3.96% ，符合方法學(xué)要求。

3.4 穩(wěn)定性試驗

取空白血漿加入阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低(0.2 μg·mL-1)、中(2.0 μg·mL-1)、高(8.0 μg·mL-1)3種濃度的含藥血漿樣品，每個濃度3個樣品，考察了阿魏酸低、中、高3個質(zhì)量濃度血漿樣品在不同條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明阿魏酸在上述保存條件下均穩(wěn)定，符合方法學(xué)要求。

3.5 回收率試驗

取200 μL空白血漿，制備阿魏酸(0.2、2.0、8.0 μg·mL-1)低、中、高3個不同濃度的血漿樣品，每個濃度配制5份，進(jìn)樣測定，記錄樣品峰面積，與相同質(zhì)量濃度的對照品峰面積之比計算提取回收率，結(jié)果見表2。阿魏酸提取回收率高于79%，符合方法學(xué)要求。

表1 血漿中阿魏酸提取回收率(n=5)

3.6 阿魏酸藥動學(xué)特征

大鼠灌胃后，在不同時間點采血并按所建立的方法測定其血藥濃度，采用DAS 2.1藥動學(xué)軟件進(jìn)行曲線擬合，計算藥動學(xué)參數(shù)，以理論血藥濃度與實測血藥濃度相關(guān)系數(shù)最大且AIC值最小為原則，判定其房室模型，阿魏酸在大鼠體內(nèi)均符合二室模型。平均血藥濃度-時間曲線見圖2，測定結(jié)果及主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表2。

圖2 舒腦欣滴丸中阿魏酸在大鼠體內(nèi)的藥-時曲線

4 實驗討論

4.1 結(jié)果分析

結(jié)果表明，大鼠灌胃舒腦欣滴丸后，阿魏酸在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)性質(zhì)均符合開放二室模型。從藥代動力學(xué)參數(shù)可知，阿魏酸達(dá)峰時間為(0.17±0.69)h，最大血藥濃度為(1.213±0.38)mg·L-1，吸收相半衰期為T1/2α=0.207±0.08h、T1/2β=3.855±4.35 h，表觀分布容積為(5.145±2.31)L·kg-1，血漿總清除率為(4.416±2.55)L·h-1·kg-1，其吸收迅速，且生物利用度高，在血漿中清除迅速，可以迅速分布到各組織器官，從而發(fā)揮其藥效作用。吸收相半衰期都在5 h以內(nèi)，提示臨床用舒腦欣滴丸時，給藥時間不能間隔時間太長，否則不能維持有效血藥濃度。

表2 舒腦欣滴丸中阿魏酸在大鼠體內(nèi)主要藥動學(xué)參數(shù)

4.2 實驗條件

血漿樣品的處理主要采用萃取法及水浴法。阿魏酸本是一種弱酸，血漿樣品經(jīng)過酸化后加入乙酸乙酯比加入乙醚的提取量更高一些[5]。另外阿魏酸對光不穩(wěn)定，放置的時間不宜過長，并需要在棕色的容量瓶中進(jìn)行配置，以減少在實驗過程中光照對阿魏酸產(chǎn)生降解的可能性，儲備液需放置在4℃的冰箱中進(jìn)行儲存。