曾智娟 ，劉 念 *，衛(wèi)春會(huì)，孫中理，李 覓，張 磊，周成龍，熊 艷，李 琳，柴 悠

（1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 成都 611130；3.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；4.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000；5.四川外交家酒業(yè)有限公司，四川 資陽(yáng) 641300）

濃縮型雪梨發(fā)酵酒指利用富集5～6倍[1]梨中糖類、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃縮梨汁接種酵母發(fā)酵而成的果酒。其發(fā)酵過(guò)程無(wú)外加糖[2]，營(yíng)養(yǎng)成分高于普通發(fā)酵酒，且香氣濃郁醇厚。雪梨發(fā)酵酒的色、香、味等指標(biāo)綜合影響著果酒的和諧程度[3]。酒體透亮，顏色宜人、口感清爽會(huì)直接影響消費(fèi)者選擇，下膠澄清工藝則是保證酒體品質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)之一[4]。目前，生產(chǎn)中常添加聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）、皂土、活性炭等下膠劑來(lái)加速澄清、提高酒體穩(wěn)定性[5-6]。PVPP是一種對(duì)單體酚類和二聚體酚類物質(zhì)、羧酸和小分子物質(zhì)具有較強(qiáng)的選擇性吸附能力的樹(shù)枝狀聚合物，能有效除去酒中非生物沉淀[7]；皂土是一種通過(guò)自身膨脹吸附酒中帶正電蛋白質(zhì)去除熱不穩(wěn)定蛋白的下膠劑，但也伴隨脫色及去氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[8]。活性炭因其大的表面積及其帶電性有效吸附酚類及其衍生物等極性化合物[9]。大豆蛋白是由豆類蛋白構(gòu)成的新型、植物源綠色下膠劑，是傳統(tǒng)明膠、蛋清等動(dòng)物源下膠劑的替代品。復(fù)合抗氧化澄清劑FPR是由PVPP、皂土、纖維素和阿拉伯膠等改良復(fù)合而成的商用澄清劑，其主要用于抗氧化，預(yù)防氧化造成的色澤變化和香氣損失。

GRANATO T M等[10-11]研究顯示植物蛋白類下膠劑相較于動(dòng)物下膠劑具有更高的安全性，避免人畜共患病的風(fēng)險(xiǎn)，且對(duì)酒體色澤、香氣影響更小。武運(yùn)等[12]研究表明澄清劑采用明膠-皂土，比例為3∶1，得到的庫(kù)爾勒香梨顏色佳，澄清效果好。但現(xiàn)在大多是對(duì)不同梨的梨汁發(fā)酵酒的下膠研究，關(guān)于比較不同下膠劑對(duì)濃縮型雪梨發(fā)酵酒的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用PVPP、皂土、大豆蛋白、商用復(fù)合澄清劑（FPR）、活性炭5種不同類型下膠劑，研究各下膠劑在熱穩(wěn)定的劑量下，對(duì)濃縮雪梨酒的濁度、色度、色調(diào)、色差、酒腳干質(zhì)量、總多酚含量和感官品評(píng)的影響，以期為濃縮雪梨酒澄清技術(shù)的發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃縮型雪梨發(fā)酵酒（酒精度12.5%vol）：四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院果露酒實(shí)驗(yàn)室提供；釀酒酵母EC1118：LALLEMAND集團(tuán)。

1.1.2 主要試劑

皂土、大豆蛋白：法國(guó)LALLEMAND公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、商用復(fù)合澄清劑[（FPR）：PVPP、皂土、纖維素和阿拉伯膠等改良復(fù)合而成的商用澄清劑]：上海杰兔工貿(mào)有限公司；福林-肖卡試劑：美國(guó)Sigma 公司；活性炭等其他常規(guī)試劑：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-2100UV 型紫外-可見(jiàn)分光光度儀：賽默飛世爾科技公司；TD-500離心機(jī)：四川蜀科儀器有限公司；SGZ-3數(shù)顯濁度儀：上海悅豐儀器儀表有限公司；SC-80C 全自動(dòng)色差計(jì)：北京康光光學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 澄清劑配制

皂土：稱取1 g皂土在10倍沸水中浸泡24 h，制成10%懸浮液；大豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、商用復(fù)合澄清劑（FPR）、活性炭：制成10%的溶液。加入200 mg/L SO2保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分析方法

濁度：取30 mL酒液用濁度儀測(cè)定[13]。

Coleman Nephlos值：采用BERG H W[14]濁度儀方法。色度、色調(diào)值：采用MARTINEZ-RODRIGUER A[15]方法。色差：采用CIELab顏色空間進(jìn)行評(píng)價(jià)[16]，測(cè)定L*值、a*值、b*值及下膠處理后的酒樣與對(duì)照樣的ΔL*、Δa*、Δb*、ΔE*[17]?？偡雍浚翰捎肍olin C比色法[18]測(cè)定。

感官分析：參照COSME F等[5]的方法。稍作修改，由10名經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的師生對(duì)隨機(jī)編號(hào)的酒樣進(jìn)行品評(píng)，從外觀（澄清度、顏色）、香氣（濃郁度、豐富度、果香）、風(fēng)味（持久性、整體平衡感）7個(gè)方面采用十點(diǎn)強(qiáng)度量化進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行感官雷達(dá)圖分析。

1.3.3 試驗(yàn)步驟

（1）熱穩(wěn)定性試驗(yàn)確定下膠劑量

本實(shí)驗(yàn)以雪梨濃縮酒為材料，以PVPP（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L）、皂土（0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L）、大豆蛋白（0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L）、商用復(fù)合澄清劑（FPR）（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L）和活性炭（0.4 g/L、0.8 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L）的下膠量添加，以不做處理的酒樣為空白樣，離心機(jī)5 000 r/min離心15 min，0.45 μm膜過(guò)濾，取30 mL酒液用濁度儀測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)。將剩余酒樣80 ℃水浴30 min后，于4 ℃下冷卻1 d，測(cè)定濁度，再將剩余酒樣80 ℃水浴6 h后，于4 ℃下冷卻1 d，測(cè)定濁度。

（2）不同下膠劑的處理及測(cè)定

根據(jù)（1）的最佳下膠劑量結(jié)果對(duì)酒樣下膠，離心機(jī)5 000 r/min離心15 min后進(jìn)行濁度、色度、色調(diào)、色差、總酚含量的測(cè)定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)利用Microsoft Office Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的基本處理，用IBM SPSS Statistics 21.0分析軟件進(jìn)行方差分析，用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同下膠劑下膠劑量的確定

溫度升高是酒體形成沉淀的主要原因，酒液加熱-冷卻前后濁度變化是酒體穩(wěn)定-不穩(wěn)定的體現(xiàn)，常采用測(cè)定酒液濁度差來(lái)判斷酒體穩(wěn)定性。Coleman Nephlos值能預(yù)判酒體的穩(wěn)定程度，且方法快捷，能有效縮短酒體穩(wěn)定性測(cè)定時(shí)間，BERG H W等[14]研究顯示，酒液濁度差值大小與Coleman Nephlos值存在約為1∶5.6的關(guān)系，且酒中蛋白質(zhì)穩(wěn)定程度與Coleman Nephlos值存關(guān)系見(jiàn)表1。由表1可知，酒體達(dá)穩(wěn)定的最高值為20.8，不穩(wěn)定的最低值達(dá)32.1。

表1 Coleman Nephlos值與白葡萄酒中蛋白質(zhì)穩(wěn)定程度的關(guān)系[17]Table 1 Relationship between Coleman Nephlos and protein stability in white wine

圖1 不同下膠劑在80 ℃加熱30 min、6 h情況下的差值濁度和Coleman Nephlos值變化Fig.1 Variation of turbidity and Coleman Nephlos value of different fining agents treated at 80 ℃for 30 min and 6 h

如圖1所示，當(dāng)PVPP為0.8 g/L、皂土為1.0 g/L、大豆蛋白為0.3 g/L、FPR為0.8 g/L，活性炭為1.4 g/L時(shí)，酒樣在80 ℃下加熱30 min后蛋白質(zhì)達(dá)到穩(wěn)定，在下膠范圍內(nèi)，5種下膠劑的Coleman Nephlos值先快速下降，當(dāng)臨近最佳下膠劑量時(shí)，Coleman Nephlos值存在逐漸放緩的趨勢(shì)。

6 h加熱處理下的酒液，Coleman Nephlos值達(dá)到穩(wěn)定數(shù)值時(shí)，除大豆蛋白的最佳下膠量仍然在0.3 g/L外，其他酒樣到達(dá)穩(wěn)定的下膠量有所延后，當(dāng)PVPP為1.0 g/L、皂土為1.2 g/L、FPR為1.0 g/L，活性炭為1.6 g/L下膠劑量時(shí)，酒樣加熱6 h蛋白質(zhì)達(dá)到穩(wěn)定。

兩個(gè)加熱試驗(yàn)所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除大豆蛋白處理樣外，差值濁度數(shù)據(jù)在6 h的加熱處理中均＞30 min，說(shuō)明30 min可能隱含蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的問(wèn)題，但也推測(cè)6 h的測(cè)量方法可能有一定的過(guò)度下膠。NORDESTGAARD S J等[19]也有類似推測(cè)，認(rèn)為6 h的加熱處理沉淀葡萄酒中的蛋白性物質(zhì)同時(shí)，也沉淀了其他物質(zhì)，降低酒液的澄清度。

2.2 不同下膠劑對(duì)濃縮型雪梨發(fā)酵酒基本指標(biāo)的影響

2.2.1 不同下膠劑對(duì)梨酒色度、色調(diào)、色差的影響

圖2 不同下膠劑對(duì)雪梨發(fā)酵酒色度、色調(diào)的影響Fig.2 Effect of different fining agents on the color and hue of fermented pear wine

由圖2可知，各處理樣的色度相較于對(duì)照樣都下降顯著（7.81%～14.44%）（P＜0.05），各處理樣之間差異顯著（P＜0.05），其中色彩密度下降最大的是活性炭處理樣、最小的是大豆蛋白處理樣。色度介于1.730～2.020，在紅葡萄酒色度標(biāo)準(zhǔn)[20]中屬于淺寶石紅。

色調(diào)相較于對(duì)照樣都有所增加（12.59%～18.68%）（P＜0.05），表明經(jīng)下膠處理后的酒樣其色調(diào)值有向橙色偏移的趨勢(shì)。各處理樣之間差異顯著（P＜0.05），其中活性炭處理樣向橙色偏移量最大，F(xiàn)PR向橙色偏移量最小。BAKKERJ等[21]研究證明，葡萄酒中的多酚花色素、花色苷、單寧等因素大部分決定了葡萄酒顏色。本試驗(yàn)中，活性炭、皂土、FPR三種下膠劑對(duì)酒體色澤的吸附較強(qiáng)，可能是因?yàn)檫@三種下膠劑對(duì)梨酒中的色素物質(zhì)正負(fù)離子吸附形成聚合物從而使酒體向橙色偏移。

表2 不同下膠劑對(duì)雪梨發(fā)酵酒色度值的量化處理Table 2 Quantification of colorimetric values of fermented pear wine by different fining agents

由表2可知，不同下膠劑量處理的濃縮型雪梨發(fā)酵酒的明亮度L*值為76.04～78.58，酒體呈現(xiàn)亮風(fēng)格，各處理組明亮度均顯著提高了2.10～4.64（P＜0.05），且各處理組之間存在顯著性差異（P＜0.05），其中FPR處理樣向亮偏移度最大，活性炭處理樣向亮偏移度最小。紅-綠值Δa*相較于空白均向綠色偏移，偏移度為2.77～5.17（P＜0.05），各處理組間差異性顯著（P＜0.05），其中活性炭向綠的偏移度最大，大豆蛋白偏移度最小，酒體呈現(xiàn)淡紅色。黃-藍(lán)值b*值為59.31～64.77（P＜0.05），存在顯著差異，酒體呈檸檬黃偏嫩黃色，各處理組的黃-藍(lán)值b*相較于空白向藍(lán)色偏移，偏移范圍為3.50～8.96（P＜0.05），存在顯著差異，其中活性炭向藍(lán)色的偏移量最大，大豆蛋白向藍(lán)色的偏移度最小。

CIE 1976（L*a*b*）色度值分級(jí)定論中，當(dāng)總色差介于3～6之間時(shí)，感覺(jué)色調(diào)改變明顯；當(dāng)總色差＞6時(shí)，感覺(jué)色彩變化。本試驗(yàn)中，總色差ΔE*值為5.26～10.55（P＜0.05），各處理組間存在顯著性差異（P＜0.05），其中活性炭顏色過(guò)渡最為明顯達(dá)10.56，能明顯識(shí)別色彩差異，處理樣向橙色方向偏移。大豆蛋白處理樣總ΔE*值最小，但也達(dá)到5.25，色調(diào)改變明顯，向橙色偏移。皂土、活性炭下膠后顏色差異明顯，可能與皂土、活性炭在酒中因其物理作用膨脹存在大的吸附面積，加上帶電性從而有效的吸附一些色素物質(zhì)造成強(qiáng)脫色結(jié)果。WEISS K C等[22]也有類似研究表明：皂土雖可沉淀大分子蛋白質(zhì)使酒體更加穩(wěn)定，但也會(huì)嚴(yán)重吸附葡萄酒色澤。SINGLETON V L等[23]認(rèn)為活性炭脫色是選擇性的去除黃酮單體和二聚體從而有強(qiáng)脫色作用。

2.2.2 不同下膠劑對(duì)梨酒理化指標(biāo)酒腳、多酚的影響

下膠劑可以加速酒腳產(chǎn)生，使原本需要經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間才能自然沉淀下來(lái)的物質(zhì)如大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)、死酵母等提前與下膠劑通過(guò)吸附、聚合等作用沉到罐底，但酒腳除去同時(shí)也會(huì)伴隨酒樣損失。由圖3可知，不同下膠劑處理的酒樣產(chǎn)生的酒腳干質(zhì)量范圍為38.0～141.5 mg，相對(duì)于對(duì)照組均有所增加（10.1～113.6 mg），且存在顯著性差異（P＜0.05）。其中，活性炭處理樣酒腳干質(zhì)量最多，大豆蛋白處理樣酒腳干質(zhì)量最少僅為38.0 mg，推測(cè)大豆蛋白在酒的環(huán)境里可能與酒中一些不溶物質(zhì)反應(yīng)，從而使不溶物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶物質(zhì)，其次也有可能因?yàn)榇蠖沟鞍资侵参镄晕镔|(zhì)，本身帶有大部分可溶性物質(zhì)，具體是哪些物質(zhì)還需要進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖3 不同下膠劑對(duì)雪梨發(fā)酵酒產(chǎn)生的酒腳干質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of different fining agents on the wine lees dry weight of fermented pear wine

采用Folin C比色法在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定樣品吸光度值得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.050 6x-0.003，R2=0.999。由圖4可知，下膠劑處理的酒樣總多酚范圍為2 747.04～3 952.57 mg/L，各處理組之間差異性顯著（P＜0.05）。處理樣相較于對(duì)照樣均有顯著下降（8.26%～19.27%）（P＜0.05）。其中，活性炭下膠處理的酒樣總多酚減少量最多，相比對(duì)照組少了1 205.53 mg/L。原因可能為活性炭較大的吸附表面積為蛋白質(zhì)的吸附提供大量位點(diǎn)，被吸附物質(zhì)近距離接觸產(chǎn)生及大吸附力，從而有效吸附酚類物質(zhì)及其衍生物。JACKSON R S[24]也有類似解釋。此外，大豆蛋白處理的酒樣總多酚含量減少最少，但仍減少了355.73 mg/L，對(duì)酚類物質(zhì)仍具有明顯的吸附作用，COSME F等[5]也表明植物型蛋白類澄清劑對(duì)于酚類物質(zhì)有明顯的吸附作用，降低酒顏色褐變，延長(zhǎng)貯存時(shí)間。

圖4 不同下膠劑對(duì)雪梨發(fā)酵酒總多酚的影響Fig.4 Effect of different fining agents on total polyphenols of fermented pear wine

2.3 不同下膠劑對(duì)濃縮型雪梨發(fā)酵酒感官分析結(jié)果

圖5 感官分析結(jié)果雷達(dá)圖Fig.5 Radar chart of sensory analysis results

由圖5可知，不同下膠劑處理的酒樣在外觀、香氣、風(fēng)味方面均有不同程度的影響。從外觀分析，處理酒樣的澄清度均高于對(duì)照組，皂土處理組澄清度最高，F(xiàn)PR處理樣次之。顏色均有不同程度的吸附，其中PVPP處理組吸附最少，活性炭和皂土處理組吸附顏色最多。這主要與下膠劑與酒作用時(shí)吸附蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的同時(shí)也吸附了酒體色素的作用機(jī)理有關(guān)[25]。從香氣感官分析，經(jīng)下膠處理酒樣的濃郁度、豐富感、果香均有一定程度的下降，其中活性炭和皂土處理對(duì)酒樣影響最大，大豆蛋處理組對(duì)香氣感官品質(zhì)的影響最小與VINCENZI S 等[26]研究結(jié)果相同。從風(fēng)味感官分析，經(jīng)下膠處理酒樣的持久性和平衡感除活性炭處理組外，其他下膠處理組影響較少，其中大豆蛋白和FPR在風(fēng)味感官分析上與對(duì)照組最為接近。

綜上所述，不同下膠劑對(duì)雪梨濃縮發(fā)酵酒的感官品評(píng)均有不同程度的影響，綜合外觀、香氣、風(fēng)味等方面綜合評(píng)分發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白及FPR處理組最為接近原酒，且處理酒樣澄清度較好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、皂土、大豆蛋白、商用復(fù)合澄清劑（FPR）、活性炭5種不同類型下膠澄清劑在濁度、色度、色調(diào)、色差、酒腳干質(zhì)量、總多酚含量方面對(duì)濃縮型雪梨發(fā)酵酒的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)下膠量為PVPP 0.8 g/L、皂土1.0 g/L、大豆蛋白0.3 g/L、FPR 0.8 g/L，活性炭1.4 g/L時(shí)，酒樣在80 ℃、30 min加熱測(cè)試中達(dá)到穩(wěn)定。

按照得出的下膠量處理酒樣對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，各處理組在以上指標(biāo)中均存在顯著性差異。色澤方面：處理樣色度相較于對(duì)照樣都顯著下降（7.81%～14.44%），色調(diào)值均有顯著提高（12.59%～18.68%），且向橙色偏移的趨勢(shì)，色差指標(biāo)中，活性炭與原酒樣差別最遠(yuǎn)，大豆蛋白與對(duì)照組最接近。酒腳沉淀方面：大豆蛋白處理酒樣產(chǎn)生酒腳少。不同下膠劑對(duì)酒樣的總多酚含量均有顯著降低（8.26%～19.27%），其中活性炭處理樣多酚減少量最多，大豆蛋白處理樣對(duì)多酚的影響量最少。

感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，皂土在澄清度方面較為透亮，但對(duì)酒的顏色和香氣品質(zhì)影響較大，大豆蛋白、FPR有較好的澄清效果且在香氣、風(fēng)味方面有較好的評(píng)價(jià)。綜上分析，0.3 g/L大豆蛋白處理樣澄清透亮，香氣豐富，更適于濃縮型雪梨發(fā)酵酒的下膠澄清。