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        基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的防己黃芪湯防治2型糖尿病的潛在作用機制研究

        2020-03-27 12:19:09陳璟徐貝貝徐墜成單鑫王威許惠琴呂志陽
        現(xiàn)代鹽化工 2020年1期
        關(guān)鍵詞:數(shù)據(jù)庫糖尿病信號

        陳璟 徐貝貝 徐墜成 單鑫 王威 許惠琴 呂志陽

        摘 ? 要:為了基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究防己黃芪湯防治2型糖尿病的潛在作用機制,采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及技術(shù)平臺(TCMSP),按照口服生物利用度OB≥30%和類藥性DL≥0.18篩選處方中的活性成分及其相關(guān)靶點,通過Uniprot數(shù)據(jù)庫找出對應(yīng)官方基因名稱。利用疾病靶點相關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索與2型糖尿病相關(guān)的靶點基因。將活性成分所對應(yīng)的靶點基因和2型糖尿病相關(guān)的靶點基因進(jìn)行交集獲得兩者的共同基因即為防己黃芪湯治療2型糖尿病的關(guān)鍵靶點。使用Cytoscape軟件構(gòu)建中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò),根據(jù)度值進(jìn)行篩選,尋找該方劑防治2型糖尿病的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫及ClueGo插件對關(guān)鍵作用靶點進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析,從而探究防己黃芪湯干預(yù)2型糖尿病的生物過程及作用通路。結(jié)果顯示,篩選得到防己黃芪湯122個活性成分及242個潛在作用靶點,其中,與2型糖尿病重復(fù)的83個關(guān)鍵靶點中STAT3,AKT1,TNF,JUN,TP53,MAPK14,MAPK1,MAPK8可能通過調(diào)控AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路、AMPK信號通路、FoXO信號通路發(fā)揮治療作用。由此得出結(jié)論:通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測防己黃芪湯防治2型糖尿病的關(guān)鍵靶點及其相關(guān)信號通路,推測該方劑對2型糖尿病的潛在作用機制,大都和脂代謝的過程、氧化應(yīng)激過程相關(guān),為進(jìn)一步闡明防己黃芪湯對2型糖尿病的作用機制提供了科學(xué)依據(jù)。

        關(guān)鍵詞:防己黃芪湯;2型糖尿病;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);潛在靶點

        糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)為臨床上常見的一種代謝紊亂性疾病,在全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類身體健康[1],其患者以長期高血糖為主要特征,嚴(yán)重時通常伴有如心血管疾病、腎病、眼底病變等多種并發(fā)癥。其中,2型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus,T2DM )占糖尿病患者90%以上[2],陳思蘭等發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與胰島素抵抗(Insulin-Resistance,IR)密不可分,因胰島素抵抗導(dǎo)致患者胰島素分泌相對不足。西醫(yī)治療多通過控制患者飲食或使用降糖藥物來保證治療效果[3],然而長期服用容易產(chǎn)生許多副作用,降低療效。為了尋找能夠防治2型糖尿病的有效藥物,本研究將目光放到傳統(tǒng)的中醫(yī)藥上。中醫(yī)藥在防治DM方面歷史悠久,積累了大量的寶貴臨床經(jīng)驗,近年來文獻(xiàn)報道屢見不鮮。

        DM屬中醫(yī)消渴病范疇,中醫(yī)認(rèn)為IR的發(fā)生為脾失健運、肝失疏泄、腎陽不化等臟腑功能失調(diào)所致[4]。張景岳在《景岳全書·痰飲》中說:“五臟之病,雖皆能生痰,然無不由于脾腎?!逼⒛I虛損導(dǎo)致機體津液代謝異常,痰濕困脾,阻滯機體組織間物質(zhì)交換,影響胰島素和葡萄糖、脂質(zhì)、蛋白等水谷精微代謝,表現(xiàn)為痰濁、血瘀,二者互相影響,共同加重IR程度。由此可見,可以通過改善IR來治療T2DM,從中醫(yī)辯證角度出發(fā),采用一些活血化瘀、理氣化痰、滋陰補腎的中藥復(fù)方,將會在治療T2DM上大有成效。據(jù)《金匱要略》記載,防己黃芪湯(FJHQT)具有補氣健脾、祛風(fēng)除濕、利水消腫之功效。防己黃芪二者配伍,祛風(fēng)利濕不傷表,固表止汗不留邪,白術(shù)作為臣藥健脾利濕,甘草又調(diào)和諸藥,使其相得益彰[5]。研究表明[6-9],F(xiàn)JHQT確有調(diào)血脂、降血糖、減肥的功效。賈真等[10]通過大鼠實驗發(fā)現(xiàn)防己黃芪湯可以提高高脂飼養(yǎng)大鼠的胰島素敏感性,改善脂質(zhì)代謝紊亂。目前,F(xiàn)JHQT中各單味藥的化學(xué)成分雖有報道,但鑒于中藥成分復(fù)雜而DM又是多基因、多靶點作用的疾病,對該方劑防治T2DM仍缺乏系統(tǒng)的研究。

        網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過不同層次的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建系統(tǒng)地揭示藥物作用靶點與疾病靶點之間的關(guān)系,從微觀層面觀察復(fù)雜藥物對多靶點疾病的干預(yù)和影響。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選FJHQT中各單味藥的活性成分及作用靶點,檢索已知的T2DM的相關(guān)靶點,利用DAVID數(shù)據(jù)庫及ClueGo分析探究防己黃芪湯干預(yù)2型糖尿病的潛在作用通路,為臨床治療T2DM提供新思路。

        1 ? ?材料與方法

        1.1 ?FJHQT處方中各單味藥活性成分的篩選

        通過查詢《中國藥典2015版》所得防己黃芪湯處方中4味藥分別是:防己、黃芪、白術(shù)、甘草。采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及技術(shù)平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)篩選防己、黃芪、白術(shù)、甘草4味藥中的活性成分。TCMSP包括:《中國藥典2015版》含有的400多種中藥材,800多個相關(guān)疾病的基因,3 000多個靶點基因和20 000多種活性成分,TCMSP作為可靠的中草藥信息數(shù)據(jù)平臺,為廣大學(xué)者搜集中藥復(fù)方所含成分及其相關(guān)作用靶點等相關(guān)化學(xué)信息提供了便利。研究人員可通過設(shè)置口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)、類藥性(Drug Likeness,DL)等ADME參數(shù)獲取自己想要的有效信息。FJHQT作為湯劑,臨床上通常以口服方式給藥,故按照口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18進(jìn)行篩選得到FJHQT中的活性成分,記錄其相關(guān)靶點蛋白名和在其他文獻(xiàn)中收集到的關(guān)于FJHQT的重要成分及其相關(guān)靶點蛋白名于Excel表格中。

        1.2 ?處方中潛在作用靶點預(yù)測及構(gòu)建“藥物活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

        Uniprot,全稱Universal Protein,是目前信息最豐富、資源最廣的免費蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,使用者可通過其中的關(guān)鍵詞搜索到感興趣的蛋白名稱。由上述TCMSP搜索得到活性成分及其相關(guān)靶點蛋白名,將藥物相關(guān)靶點蛋白名通過Uniprot數(shù)據(jù)庫中的Uniprot KB搜索區(qū)找出對應(yīng)的官方基因名(Gene Symbol),篩選物種為人類的靶點基因名稱。將4味藥的基因名導(dǎo)入到Excel表格,刪除重復(fù)項得到全方的潛在作用靶點。用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建“藥物活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,其中節(jié)點代表藥物化學(xué)成分和相應(yīng)的作用靶點,節(jié)點的度值(Degree)表示藥物活性成分與作用靶點連線的條數(shù),通過度值篩選可以得到與藥物活性成分高度連接的蛋白,這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的作用不可忽視。

        1.3 ?T2DM靶點的收集

        檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)和人類在線孟德爾遺傳平臺(http://www.omim.org/)等與疾病靶點相關(guān)的數(shù)據(jù)庫,以“Type 2 diabetes Mellitus”為關(guān)鍵詞搜索與2型糖尿病相關(guān)的已知靶點并刪除重復(fù)項進(jìn)行整合。

        1.4 ?關(guān)鍵作用靶點的獲取

        將藥物潛在作用靶點與疾病相關(guān)靶點通過omicshare平臺(https://www.omicshare.com/)繪制維恩圖,從而得到防己黃芪湯治療T2DM的關(guān)鍵作用靶點,為后續(xù)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖提供依據(jù)。

        1.5 ?關(guān)鍵作用靶點的GO注釋及KEGG通路富集

        利用DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵作用靶點進(jìn)行GO注釋分析,將篩選條件設(shè)置為細(xì)胞的組成(cellular component),分子的功能(molecular function)和生物的過程(biological process)3個篩選條件,最后再點擊Functional Annotation Table,得到GO注釋結(jié)果。利用Cytoscape3.7.0軟件中的ClueGo插件對關(guān)鍵作用靶點進(jìn)行KEGG通路分析,將關(guān)鍵作用靶點輸入到GENES一欄,選擇物種為人類,再設(shè)定P<0.05,選擇KEGG通路,最后點擊start開始分析,得到防己黃芪湯干預(yù)2型糖尿病的潛在作用通路。

        2 ? ?實驗過程分析

        2.1 ?FJHQT活性成分及相關(guān)靶點信息

        利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢到防己的化學(xué)成分50個,黃芪的化學(xué)成分87個,白術(shù)的化學(xué)成分55個,甘草的化學(xué)成分280個,共計472個化學(xué)成分。經(jīng)OB、DL等藥代動力學(xué)(ADME)參數(shù)篩選得到防己的活性成分3個,黃芪的活性成分20個,白術(shù)的活性成分7個,甘草的活性成分92個,共計122個活性成分,將其相關(guān)靶點蛋白名記錄于Excel表格中。

        2.2 ?FJHQT潛在作用靶點預(yù)測結(jié)果及“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)分析

        對上述122個活性成分進(jìn)行潛在作用靶點預(yù)測并進(jìn)行靶點基因名稱的修正,通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集122個活性成分的潛在作用靶點,打開Uniprot(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫,選擇Uniprot KB搜索區(qū),將潛在作用靶點的蛋白名鍵入得到對應(yīng)的官方基因名,剔除非人源靶點。將活性成分、相關(guān)靶點蛋白名、官方基因名3列數(shù)據(jù)統(tǒng)計于Excel表格中,刪除重復(fù)項得到1 994條對應(yīng)關(guān)系。將官方基因名單獨列出去后得到FJHQT的潛在作用靶點242個。將122個活性成分及242個潛在作用靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.0 軟件進(jìn)行可視化構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò),揭示藥物成分與靶點之間的關(guān)系。按度值篩選排名前20的有槲皮素(Quercetin),PTGS2,ESR1,CALM1,HSP90AB1,NOS2,AR,PPARG,山奈酚(kaempferol),PAL_GLEAN10007028,PRSS1,GSK3B,CDK2,ESR2,CCNA2,F(xiàn)10,NCOA2,SCN5A,MAPK14,CHEK1。

        2.3 ?T2DM相關(guān)靶點信息

        通過人類在線孟德爾遺傳平臺OMIM檢索到T2DM相關(guān)靶點31個,通過Genecards數(shù)據(jù)庫檢索到T2DM相關(guān)靶點408個,共計439個相關(guān)靶點。

        2.4 ?關(guān)鍵作用靶點的生物功能預(yù)測及作用通路分析

        通過DAVID數(shù)據(jù)庫對上述關(guān)鍵作用靶點進(jìn)行GO注釋分析,根據(jù)錯誤分析率(FDR)<0.05篩選得到20條GO條目(見圖1),其中,大多數(shù)關(guān)于生物學(xué)的過程主要涉及:內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控、DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、MHC Ⅱ類生物合成過程的調(diào)節(jié)、肽基絲氨酸磷酸化過程、脂多糖介導(dǎo)信號通路等。關(guān)于分子功能主要涉及細(xì)胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、MAP激酶活性。此外,有的條目還顯示與炎癥反應(yīng)、血管生成有關(guān)。GO注釋分析結(jié)果如圖1所示。通過Cytoscape3.7.0 軟件中的ClueGo插件對關(guān)鍵靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析,其中P<0.05的通路有11條被顯著富集(見圖2),分別是:AGE-RAGE信號通路、AMPK信號通路、VEGF信號通路、T細(xì)胞受體通路、松弛素信號通路、MAPK信號通路、ErbB信號通路、胰島素信號通路、鞘脂信號通路、FoXO信號通路,表示FJHQT可能通過這些通路起到防治T2DM的作用,應(yīng)予以重點關(guān)注。

        3 ? ?實驗結(jié)果分析

        現(xiàn)階段,我國糖尿病患者已經(jīng)有9 000多萬人,而其中2型糖尿病居多,2型糖尿病是一種慢性代謝功能障礙,其特征在于進(jìn)行性胰島素抵抗和高血糖癥?,F(xiàn)代分子學(xué)研究表明,不同信號通路及其相關(guān)蛋白、基因參與調(diào)控該疾病的發(fā)生與發(fā)展,相互作用機制復(fù)雜,單純通過使用降血糖、降血壓、改善微循環(huán)等“點對點”的藥物干預(yù)方式,很難推動糖尿病治療進(jìn)展,臨床效果較差。中藥復(fù)方成分復(fù)雜,其多靶點的協(xié)同作用值得引起注意,防己黃芪湯在臨床治療消渴癥包括一些糖尿病并發(fā)癥方面的療效確切,但是中藥復(fù)方治療T2DM的作用機制尚不清晰。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)突破單靶點的研究模式,從多靶點研究思路出發(fā),為探索中藥復(fù)方的療效提供新思路。本研究采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思路,初步挖掘、分析防己黃芪湯多靶點防治T2DM可能的作用機制。

        本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法對防己黃芪湯進(jìn)行研究,最后得到防己黃芪湯122個入血活性成分,預(yù)測了242個潛在作用靶點。其中槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)等活性成分可作用于多個靶點。槲皮素屬于植物類黃酮并且在體外具有有效的抗氧化特性,最近的文獻(xiàn)報道槲皮素可能在體內(nèi)具有抗癌和抗炎功能,與此同時,槲皮素還可以預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[10],山奈酚可用作治療糖尿病腎病的潛在治療劑。在對靶點的預(yù)測過程中,發(fā)現(xiàn)CALM1、PTGS2等靶點可作用于多個潛在活性成分,這表現(xiàn)出了中藥多個成分共同作用的特征。在GO富集分析結(jié)果中,發(fā)現(xiàn)主要涉及:內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控、DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、MHC Ⅱ類生物合成過程的調(diào)節(jié)、肽基絲氨酸磷酸化過程、脂多糖介導(dǎo)信號通路等。在KEGG通路分析結(jié)果中,發(fā)現(xiàn)預(yù)測的關(guān)鍵靶點主要集中作用在AGE-RAGE信號通路、AMPK信號通路、VEGF信號通路。這些通路主要在氧化應(yīng)激、炎癥、脂質(zhì)代謝等方面具有良好的作用,并且上述通路與目前相關(guān)研究結(jié)果具有一致性,證明本研究預(yù)測出的結(jié)果具有可靠性。

        4 ? ?結(jié)語

        通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測防己黃芪湯防治2型糖尿病的關(guān)鍵作用靶點及其相關(guān)信號通路,推測防己黃芪湯對2型糖尿病的潛在作用機制,推測結(jié)果可能主要是:內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控、DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)等。關(guān)于分子功能主要涉及細(xì)胞因子活性等。此外,有的條目還顯示與炎癥反應(yīng)、血管生成有關(guān),為闡明防己黃芪湯對2型糖尿病的作用機制提供了科學(xué)依據(jù),但還存在一些缺陷,主要是未對預(yù)測獲得的活性成分、關(guān)鍵靶點和有關(guān)通路進(jìn)行實驗驗證。為了進(jìn)一步探討其復(fù)雜的過程和作用機制,將會結(jié)合上述結(jié)果進(jìn)行更深入的實驗研究。

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