孟雨婷，李華，陳志穎，吳玉玲，石航，張玲

基于成分檢測(cè)的大黃-蜇蟲(chóng)藥對(duì)最佳配伍比例的研究

孟雨婷，李華，陳志穎，吳玉玲，石航，張玲

（山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟(jì)南 250355）

目的：研究大黃-蜇蟲(chóng)不同比例配伍對(duì)水提液中有效成分的影響，探求藥對(duì)的最佳配伍比例。方法：采用HPLC法考察大黃-蜇蟲(chóng)藥對(duì)不同比例配伍共提液中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量變化情況；通過(guò)高速氨基酸分析儀分析大黃-蜇蟲(chóng)藥對(duì)不同比例配伍共提液中氨基酸的含量及組成；采用極差歸一化法，對(duì)不同比例配伍的大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、總氨基酸的含量進(jìn)行綜合分析，優(yōu)選出最佳配伍比例。結(jié)果：大黃-蜇蟲(chóng)（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）九個(gè)比例配伍進(jìn)行綜合分析后，確定在大黃-蜇蟲(chóng)配伍比例為1:3時(shí)有效成分含量最高。結(jié)論：大黃-蜇蟲(chóng)藥對(duì)最佳配伍比例為1∶3。

大黃；蜇蟲(chóng)；有效成分；配伍比例

大黃（Rheum palmatum L.），為蓼科大黃屬多年生草本，藥用部位通常為大黃的根狀莖及根[1-3]，味苦而微澀，性寒，具有排除積滯、破血逐淤、通絡(luò)的功能[4-8]。適宜生長(zhǎng)在清冷涼爽的地區(qū)，可以忍受寒冷，但是炎熱的地區(qū)不適合大黃的生長(zhǎng)，大黃主要生長(zhǎng)于林地邊緣[9]。蟄蟲(chóng)（Eupolyphaga sinensis Walker），別名地鱉蟲(chóng)、土鱉、土元等，地鱉蠊科昆蟲(chóng)地鱉或冀地鱉的雌蟲(chóng)干燥體，性寒味咸，有一定的毒性，使用時(shí)要注意用量且不能長(zhǎng)期使用[10]，具有破淤通經(jīng)的功效，主要用于女性月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后瘀阻、淤血腫痛等癥狀。

近年來(lái)女性由于輸卵管不通、子宮肌瘤、卵巢囊腫等導(dǎo)致的不孕患者增多，其病機(jī)關(guān)鍵是瘀血內(nèi)阻。中醫(yī)臨床用藥經(jīng)驗(yàn)證明，破血消癥類(lèi)藥物對(duì)于破淤消積方面的效果要比活血化瘀類(lèi)藥物的效果好得多。大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)，具有攻積導(dǎo)瀉、通經(jīng)消癥的作用，是中醫(yī)臨床常用藥對(duì)。大黃入血偏于瀉，有破除瘀血的作用；蟄蟲(chóng)入血偏于通，有疏通經(jīng)絡(luò)的作用；大黃、蟄蟲(chóng)配合使用，使得受阻的脈絡(luò)暢通，體內(nèi)積滯的瘀血可以消散[11-12]。目前少有對(duì)大黃-蟄蟲(chóng)對(duì)藥配伍后化學(xué)成分的監(jiān)測(cè)的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)大黃-蟄蟲(chóng)對(duì)藥不同比例配伍后有效成分的含量和組成的變化探討其配伍規(guī)律，為中醫(yī)臨床應(yīng)用提供更有利的支撐。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-10ATVP（日本島津公司）；高速氨基酸分析儀：L-8900（日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)科學(xué)那珂事務(wù)所）；高速冷凍離心機(jī)：ST16R（賽默飛世爾科技有限公司）；大黃素對(duì)照品：上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：T02S8F42983。

大黃酚對(duì)照品：上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：T23A8F42188；大黃素甲醚對(duì)照品：上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：T09M9F55482；5-磺基水楊酸：上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y07M9C55033；甲醇（色譜純）；蜇蟲(chóng)：安國(guó)市聚藥堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1809003；大黃：安國(guó)市聚藥堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1809006；大黃、蟄蟲(chóng)藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張芳副教授鑒定，均為正品藥材。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量測(cè)定

使用高效液相色譜儀分別對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液進(jìn)樣分析，混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的濃度可由稱(chēng)取的重量和稀釋倍數(shù)求得，由高效液相色譜儀進(jìn)樣分析生成的報(bào)告可得分別得到的峰面積，由此可得濃度-峰面積的線性回歸方程；根據(jù)進(jìn)樣分析得到的供試品溶液中的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，由線性回歸方程可分別求得其濃度，進(jìn)而求得1 g藥材中指標(biāo)性成分的含量。

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAXODS（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B）（85:15）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；體積流量：1 mL·min-1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。色譜圖如圖1所示。

1-大黃素；2-大黃酚；3-大黃素甲醚a(bǔ). 混合對(duì)照品溶液；b. 樣品溶液

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品適量，分別放置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲溶解，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.100，0.102，0.086 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。置冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 供試品溶液的制備

取大黃、蟄蟲(chóng)適量，粉碎，分別按不同配伍比例（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，1∶2，3∶1，4∶1，5∶1）稱(chēng)取粉碎后的大黃、蟄蟲(chóng)，混勻，分別置燒杯中加適量蒸餾水浸潤(rùn)30 min，后加入圓底燒瓶中，加10倍量蒸餾水，沸騰后再煎煮30 min，倒出；后加100 mL蒸餾水，沸騰后煎煮30 min，合并2次提取液，置離心管中離心去除部分沉淀，上清液旋蒸濃縮至50 mL。各取25 mL于圓底燒瓶中，加100 mL甲醇，稱(chēng)重，加熱回流1 h時(shí)，取下冷卻，稱(chēng)重，甲醇補(bǔ)足失重，過(guò)濾，濾液過(guò)0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的各對(duì)照品溶液，制成大黃素濃度為1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0, 25.0 μg·mL-1，大黃酚濃度為8.0, 16.0, 25.5, 30.6, 35.7, 45.9 μg·mL-1，大黃素甲醚濃度為1.72, 4.3, 8.6, 10.32, 12.9, 17.2 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣20 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析，分別以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（）、峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸分析（=6），大黃素：=300 99-136 07（=0.999 5）, 大黃酚：=405 17+105 607（=0.999 6），大黃素甲醚：=268 04+663.49（=0.999 6）。結(jié)果表明大黃素在1.000~25.000μg，大黃酚在8.000~45.900μg，大黃素甲醚在1.720~17.200μg線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取大黃-蟄蟲(chóng)（1∶1）配伍比例的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積并計(jì)算RSD分別為0.98%, 1.22%, 0.76%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取大黃-蟄蟲(chóng)（1∶1）配伍比例的供試品溶液，于制備后的0, 2, 4, 8, 12, 24 h分別進(jìn)樣測(cè)定大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積并計(jì)算RSD分別為1.45%, 1.67%, 1.55%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取大黃-蟄蟲(chóng)（1∶1）配伍比例的樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積并計(jì)算RSD分別為1.21%, 1.56%, 0.96%。表明此實(shí)驗(yàn)藥材有效成分提取方法及檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取大黃-蟄蟲(chóng)（1∶1）配伍比例的樣品約5 g，共6份，分別加入質(zhì)量濃度為0.201 mg·mL-1的大黃素對(duì)照品溶液、質(zhì)量濃度為0.318 mg·mL-1的大黃酚對(duì)照品溶液和質(zhì)量濃度為0.110 mg·mL-1的大黃素甲醚對(duì)照品溶液各5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，計(jì)算各平均加樣回收率分別為98.77%, 98.23%, 97.59%， RSD分別為2.30%, 2.11%, 1.96%。

2.2 蜇蟲(chóng)中游離氨基酸的含量測(cè)定

使用高速氨基酸分析儀進(jìn)樣分析氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和不同配伍比例的供試品溶液中游離氨基酸的含量，進(jìn)樣量為20 μL，分析結(jié)果可直接得到20 μL中各游離氨基酸的含量及總含量，進(jìn)而可求得1 g藥材中總氨基酸的含量。

2.2.1 色譜條件

交換柱:（4.6 mm×60 mm, 3μm）磺酸型陽(yáng)離子樹(shù)脂分離柱；泵1（洗脫溶液）流速: 0.40 mL·min-1（壓力2.0~14.7 MPa）； 泵2（茚三酮溶液）流速: 0.35 mL·min-1（壓力0.2~2.0 MPa）；分析柱溫度: 57 ℃；反應(yīng)器溫度: 135 ℃；進(jìn)樣體積: 20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng): 570 nm，其中脯氨酸檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm。色譜圖見(jiàn)圖 2。

a. 混合對(duì)照品溶液；b. 樣品溶液

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別移取氨基酸混合溶液-A型、氨基酸混合溶液-B型各40μL于EP管中，再精密移取0.2% 的鹽酸溶液920 μL至EP管中補(bǔ)足1 mL，將EP管斡旋30 s，用1 mL注射器吸出EP管內(nèi)溶液過(guò)0.22 μm濾膜置進(jìn)樣瓶中，對(duì)照品溶液配置完成。

2.2.3 供試品溶液的制備

取“2.1.3”項(xiàng)下旋蒸濃縮后的溶液各300 μL于離心管中，后稱(chēng)取約4.5 g 5-磺基水楊酸分別加入，精密移取600 μL 0.2%鹽酸溶液分別置于離心管中，混勻，放置1 h，后于離心機(jī)中離心20 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，作為供試品溶液。

2.2.4 樣品的測(cè)定

取“2.1.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為20 μL，計(jì)算大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)不同配伍比例大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量測(cè)定結(jié)果

取“2.2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為20 μL，計(jì)算游離氨基酸的含量，平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表2、表3，表中列出了17種常見(jiàn)氨基酸和測(cè)定的38種游離氨基酸的總和。

采用極差歸一化的方法，對(duì)不同比例配伍的大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、總氨基酸的含量進(jìn)行綜合分析，優(yōu)選出最佳配伍比例，結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)不同配伍比例游離氨基酸的含量測(cè)定結(jié)果

表3 大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)不同配伍比例游離氨基酸的含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 論

由表1可知，大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)中大黃素的含量在配伍前后及不同配伍比例中的差異較小，僅配伍比例為1∶2，1∶3，2∶1時(shí)的含量較配伍前增多；大黃酚的含量在不同配伍比例中均有所增加，其中以配伍比例為1∶2，1∶3，1∶5時(shí)含量增加最為顯著；大黃素甲醚的含量在不同配伍比例中亦均有所增加，增加趨勢(shì)并不明顯。

表4 大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)不用配伍比例指標(biāo)成分含量歸一化結(jié)果

由表2、表3可知，總游離氨基酸的含量在大黃-蟄蟲(chóng)配伍比例為5∶1，4∶1時(shí)的含量最高，配伍比例為1∶2時(shí)的含量最低，其中絲氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸的含量隨大黃所占比例的增加而有顯著的增加，含量變化明顯。由表4極差歸一化后的結(jié)果可知，當(dāng)大黃-蟄蟲(chóng)配伍比例為1∶3時(shí)結(jié)果最好，說(shuō)明大黃-蟄蟲(chóng)配伍后有促進(jìn)有效成分溶出的作用，且配伍比例不同促進(jìn)溶出的作用也不同，其中以大黃：蟄蟲(chóng)為1∶3時(shí)效果最佳。

藥對(duì)為中醫(yī)臨床常用的用藥形式，是在千百年的臨床用藥中總結(jié)歸納出的藥物配伍[13-14]。藥物的配合使用，不但可以提高藥物有效成分的溶出以提高藥物療效，而且可以降低毒性或副作用。大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)的使用歷史久遠(yuǎn)，從古至今，很多復(fù)方中都含有此藥對(duì)，在現(xiàn)代，其應(yīng)用更加廣泛?，F(xiàn)代研究表明，大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)在在治療西醫(yī)疾病方面也有良好的療效：抗肝纖維化，在治療慢性肝炎、肝硬化方面有一定的療效；對(duì)婦科疾病的治療，對(duì)月經(jīng)不調(diào)、卵巢囊腫、不孕不育等治療效果確切；對(duì)心血管疾病有治療作用，降低血液粘度，改善微循環(huán)，有抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂的功效；配合西藥，對(duì)腫瘤，慢性腎衰竭等也有一定的治療效果，可以提高患者的生存質(zhì)量，改善患者機(jī)體功能；同時(shí)，大黃-蟄蟲(chóng)對(duì)黃褐斑等皮膚疾病也有很好的療效[15-23]。大黃-蟄蟲(chóng)具有排除積滯、破淤通經(jīng)的功效，且副作用較小，可以廣泛用于符合其發(fā)病機(jī)理的各系統(tǒng)疾病中。大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)的應(yīng)用日趨廣泛，配伍比例的不同影響其藥效的高低，確定其最佳配伍比例有很明確的研究意義。本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于從成分檢測(cè)方面通過(guò)氨基酸測(cè)定儀測(cè)定哲蟲(chóng)中的有效部位總氨基酸，結(jié)合大黃中的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量測(cè)定，采用極差歸一化法綜合分析大黃-哲蟲(chóng)最佳配伍比例，希望本實(shí)驗(yàn)所用的研究方法、數(shù)據(jù)處理方法可以為更多的研究提供方法，本實(shí)驗(yàn)探究的大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)的最佳配伍比例可以為臨床用藥提供一定的借鑒。通過(guò)對(duì)此方面的研究，讓大黃-蟄蟲(chóng)藥對(duì)更好的應(yīng)用于臨床，造福于人類(lèi)。

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Study on the Optimum Compatibility Ratio of Dahuang-Zhechong Based on Component Detection

,,,,SHI Hang, ZHANG Ling

（Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Shandong Jinan250355, China）

To study the effect of different compatibility ratios of Dahuang-Zhechong on the content of active ingredients in water extract, and to explore the best compatibility ratio, HPLC was used to investigate the content changes of emodin,chrysophanol and physcion in the extracts with different compatibility ratios of Dahuang-Zhechong;the content and composition of amino acids in different compatibility ratios of Dahuang-Zhechong were analyzed by high-speed amino acid analyzer; the range normalization method was used to comprehensively analyze the contents of emodin,chrysophanol and physcion and total amino acid in different compatibility ratios of Dahuang-Zhechong,and the optimal compatibility ratio was selected. The results showed that, after comprehensive analysis of the nine compatibility ratios（1∶1, 1∶2, 1∶3, 1∶4, 1∶5, 2∶1, 3∶1, 4∶1, 5∶1）of Dahuang-Zhechong, it was determined that the effective component content was the highest under the ratio of 1:3,so the best compatibility ratio of Dahuang-Zhechong was 1∶3.

Dahuang；Zhechong ;active component;compatibility ratio

山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃，項(xiàng)目號(hào)：2018054；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃，項(xiàng)目號(hào)：201810441004。

2019-10-28

孟雨婷（1997-），女，安徽省宿州市人，研究方向：中藥學(xué)

張玲（1980-），女，山東省膠州市人，講師，博士，研究方向：從事中藥及天然藥物有效成分的研究。

TQR284.2

A

1004-0935（2020）01-0028-05