閆臣，陳玉童，劉芯邑，張德恩，李志博

（石河子大學農(nóng)學院/ 新疆生產(chǎn)建設兵團綠洲生態(tài)實驗室，新疆石河子832003）

棉花是我國主要的經(jīng)濟作物，起源于熱帶亞熱帶地區(qū)，對低溫比較敏感。 低溫脅迫是限制其生長發(fā)育、成熟和地域分布的最重要逆境因子之一[1]。低溫脅迫可以引起棉花光合氣體交換參數(shù)、葉綠素熒光、可溶性糖等一系列指標變化[2]；造成棉花細胞中葉綠體膜破損， 類囊體膜的膜質(zhì)組分和膜蛋白改變，破壞類囊體內(nèi)膜的超微結(jié)構[3]；使植物的光合過程因光抑制而受到影響，導致光合能力下降[4]；使棉花生育期延遲、花蕾脫落，品質(zhì)和產(chǎn)量嚴重下降[5]。此外低溫使棉株更容易感染真菌、誘發(fā)多種病癥[6]。新疆是我國最大的棉區(qū)，2018 年播種面積占全國的74%以上，是國家主要商品棉基地。 受其地理位置影響，新疆有著“前期升溫慢、后期降溫快”的氣候特點，且春季氣候多變，常出現(xiàn)“倒春寒”[2]。 因此對棉花品種耐寒性進行分析鑒定對引種、抵御低溫具有一定指導作用。

半致死溫度（LT50）常用于植物抗逆性，尤其在耐寒性鑒定。有人認為，用生長恢復試驗、組織褐變來估計低溫下的致死溫度分析耐寒性并不準確[7]，用Logistic 方程求出LT50并進行耐寒性鑒定評價更為可靠，此方法已經(jīng)在桃樹[8]、菊花[9]等多種作物上得到應用。 關于棉花耐寒性分析，前人多對發(fā)芽率、葉片光合氣體交換參數(shù)、葉綠素熒光、抗氧化酶、葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等指標進行測定[2，6，10]，而并未見到LT50相關報道。 為此，本文以北疆植棉區(qū)的不同時期選育的代表性棉花品種為試驗材料，用LT50對這些品種不同生育期的耐寒性進行鑒定評價，以期為棉花耐寒性品種選育及建立耐寒鑒定方法提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用28 個棉花品種， 包括24 個北疆棉區(qū)不同時期選育的代表性棉花品種和4 個引進品種。其中引入材料中棉所36、中J9645、中JX4 的幼苗具有較強耐寒性，文中用A1－A3 表示，引入材料新陸中26 號為南疆1 個主栽棉花品種，用A28 表示。 新陸早 7 號、8 號、10 號、13 號、19 號、21 號、23 號、24 號、25 號、26 號、33 號、35 號、36 號、41號、42 號、45 號、46 號、48 號、50 號、54 號、60 號、61 號、66 號、74 號為不同時期選育審定的適宜北疆棉區(qū)的代表性棉花材料， 在文中依次用A4－A27 表示。

1.2 低溫處理

各參試材料隨機取完整、 無病蟲害的功能葉片，經(jīng)自來水洗凈后，再用去離子水漂洗數(shù)次，用濾紙吸干葉片表面的水分，用葉片打孔器避開葉脈打孔，得到30 片小圓片，分裝入具塞試管，再分別放入可控式冰箱內(nèi)，溫度分別設為－2℃、－4℃、－6℃、－8℃、－16℃。

1.3 指標測定

1.3.1細胞傷害率的測定。處理12 h 后分批取出，4 ℃解凍 1.5 h，室溫平衡 30 min 后，加入 20 mL 去離子水，浸泡10 h 后用DDSJ-308A 型數(shù)字電導儀測定浸出液電導率Rc（測時搖勻）。 再將三角瓶用保鮮膜封好放入水浴鍋100℃蒸煮30 min，放置至室溫，再次測定其電導率Rb，用公式①、②求出相對電導率和傷害率。

式中：R 表示相對電導率，Rc 表示低溫處理后電導率，Rb 表示煮后電導率，I 為傷害率，Re 為蒸餾水電導率（因本實驗用的去離子水，可將Re 計為零）。 故公式②可轉(zhuǎn)化為③式如下：

1.3.2Logistic 方程的建立。Logistic 方程是 1 個典型的“S”曲線方程，方程為：y＝k/（1＋ae－bt），k、a、b為常數(shù)。 方程中y代表細胞傷害率，t代表處理溫度，k 為細胞傷害率的飽和容量為100[8]，b 表示溫度與細胞傷害率之間的函數(shù)關系，a 反映方程曲線與原點之間的相對位置關系[11]。朱根海等[7]、李華偉等[12]、王永紅[13]認為應用電導法配合Logistic 方程求出S 形曲線的拐點溫度能較準確地估計出植物組織的LT50，可作為反映植物耐寒性的1 個重要指標。

1.3.3LT50 的計算。將 Logistic 方程y＝k/ （1＋ae－bt）進行線性化轉(zhuǎn)化處理，ln[（k－y）/y]＝lna－bt，令y1＝ln[（k－y）/y]，則轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)化細胞傷害率y1與處理溫度t的直線方程[11-12]。 求出拐點d2y/d2t時的t值，即 lna/b 為LT50值[7-8，11-12]。采用胡文冉[14]的方法計算LT50，并稍加改變，通過公式y(tǒng)1＝ln[（k－y）/y]， 利用y值與 k 值分別求出y1， 再利用 Excel 2016 圖表工具擬合轉(zhuǎn)化細胞傷害率y1 與處理溫度t的直線方程，分別求出lna 和b 值，進而計算出LT50。

1.4 數(shù)據(jù)與分析

利用SigmaPlot 12.5 進行作圖及方差分析，利用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)分析及其Logistic 回歸模型的建立，利用SPSS 19.0 對LT50進行K 類均值法聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花品種細胞傷害率與脅迫溫度Logistic回歸模型的建立

本實驗對各參試材料不同生育期的Logistic曲線進行線性化處理，擬合出了轉(zhuǎn)化細胞傷害率與溫度之間的線性關系，最終得出Logistic 方程（表1）。結(jié)果表明，擬合度大于0.8 的方程占91.07%，相關性較高，故用此法計算LT50，數(shù)據(jù)較可靠。

不同生育期，28 個棉花品種的Logistic 曲線見圖 1。 由圖 1 可知，4 個生育期下，28 個棉花品種葉片的細胞傷害率均隨著處理溫度的降低明顯波動式增大， 細胞傷害率與處理溫度呈現(xiàn)明顯的負相關關系。

盛蕾期Logistic 曲線呈典型的“S”型，大多數(shù)品種25～－2 ℃范圍內(nèi)， 細胞傷害率緩慢增加，表明在這溫度范圍內(nèi)， 棉花細胞質(zhì)膜損傷能自動修復，處于動態(tài)平衡狀態(tài)；大多數(shù)品種在－2～－6 ℃范圍內(nèi)，細胞傷害率迅速增加，表明此溫度范圍內(nèi)細胞質(zhì)膜損傷大于修復，損傷程度愈加嚴重。因此，可以認定－2 ℃為盛蕾期棉花耐寒性的臨界溫度。細胞質(zhì)膜損傷程度逐漸加重，大多數(shù)品種細胞傷害率在－6 ℃后趨于平穩(wěn)， 少數(shù)品種在－8 ℃后趨于平穩(wěn)。

各品種苗期、吐絮期的Logistic 曲線最后未趨于平穩(wěn)，只呈現(xiàn)“S”型的前一部分，這2 個時期大多數(shù)品種細胞傷害率在－4℃后開始快速上升， 基本未趨于平穩(wěn)。大多數(shù)棉花品種在花鈴期對低溫比較敏感， 細胞傷害率－2～25 ℃隨溫度降低迅速增加， 低于－2 ℃后多數(shù)品種細胞傷害率緩慢增長，呈現(xiàn)“S”型曲線的后一段，可知棉花在此時期耐寒性較弱，容易受到冷害。 同時結(jié)合LT50（表 1），可認定苗期、花鈴期、吐絮期棉花耐寒性指標的臨界溫度分別為－4 ℃、2 ℃、－4 ℃， 對棉花耐寒性鑒定工作有一定的幫助。

2.2 不同生育期LT50的確定

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圖1 不同時期棉花各品種葉片細胞傷害率與處理溫度之間的Logistic 曲線

計算Logistic 曲線拐點溫度作為植物組織的LT50，通過比較各品種LT50，可以鑒定其耐寒性。 分析結(jié)果（圖2）看出，同一棉花品種在不同生育期的LT50并不相同，表明不同生育期棉花的耐寒機制或關鍵耐寒指標因子不同。 從苗期、盛蕾期、花鈴期、吐絮期所有參試材料的LT50范圍分別在－9.07～－0.12 ℃、－4.43～4.25 ℃、－4.02～9.69 ℃、－15.76～3.06 ℃來看，苗期、吐絮期的LT50幾乎均在0 ℃以下，說明參試材料在苗期和吐絮期均具有較好的耐寒性。根據(jù)確定的LT50，所有參試材料中，苗期、盛蕾期、花鈴期、吐絮期耐寒性最強的材料依次分別為新陸早36 號、 新陸早7 號、 新陸早 50號、新陸早35 號，而耐寒性最差的材料依次分別為新陸早60 號、新陸早25 號、新陸早13 號、新陸早54 號。

圖2 棉花品種在不同生育期的LT50

圖3 不同生育期各品種LT50 平均值差異分析

取所有參試材料的LT50平均值， 進一步對不同生育期棉花的LT50變化趨勢進行了分析 （圖3）。研究發(fā)現(xiàn)，隨著生育進程推進，不同生育期棉花的LT50有先升高后下降的趨勢，其幾乎均達到顯著差異。 其中花鈴期的棉花材料的LT50平均值為2.23 ℃，為4 個生育中最高，而苗期的參試材料的LT50平均值是4 個生育期中最低的， 為－4.79 ℃，進一步表明，花鈴期棉花適宜生長需要較高的生長溫度， 也說明不同生育期棉花的耐寒機制不一樣，不同生育期棉花的LT50耐寒分類標準不一樣，對棉花全生育期的耐寒性鑒定需要考慮棉花不同生育期。

2.3 不同生育期棉花耐寒性鑒定及耐寒等級標準建立

將棉花耐寒性分為高抗、抗、中抗、弱抗和寒敏感5 個級別進行鑒定評價。 K 類均值法聚類分析（表2）結(jié)果表明，28 個參試品種在不同生育期的耐寒鑒定級別所占比例和結(jié)果不同。 僅有1～2 個品種在4 個生育期中表現(xiàn)為寒敏感，表明北疆植棉區(qū)棉花品種都具有一定的耐寒性。 4 個生育期鑒定結(jié)果為高抗的棉花品種有明顯的差別， 其中苗期、吐絮期的比例較低，分別為7.14%、3.57%；而盛蕾期和花鈴期的高抗比例明顯升高， 分別達到了32.14%、17.86%，這說明盛蕾期和花鈴期比苗期和吐絮期相對要求較高的溫度，也表明不同生育時期棉花的耐寒機制和耐寒性不同。 綜合來看，A15（新陸早35 號）和 A2（中 J9645）在 4 個生育期的分級結(jié)果均為高抗或抗， 表明它們具有較好的耐寒性，可以作為棉花耐寒種質(zhì)資源加以使用；而A13（新陸早26 號）的綜合鑒定結(jié)果均為弱抗，表明其全生育期的耐寒性較差。

表2 不同生育期耐寒性分級的聚類分析

依據(jù)表2 的分析結(jié)果，根據(jù)入選的不同耐寒類別棉花的LT50，本實驗又初步建立了不同生育期棉花耐寒性級別劃分的LT50標準（表3），期望為應用LT50鑒定不同生育期棉花種質(zhì)資源的耐寒性提供科學指導。

表3 不同生育期棉花不同類別耐寒性LT50 的確立 ℃

3 討論與結(jié)論

膜系統(tǒng)是植物受低溫傷害和抵抗低溫傷害的關鍵結(jié)構[13]。 低溫脅迫下，棉花葉片質(zhì)膜透性與其耐寒性呈負相關， 可以作為耐寒性的鑒定指標[15]，質(zhì)膜透性增加，電解質(zhì)會出現(xiàn)不同程度的外滲[8，10，13]，電解質(zhì)外滲率與原生質(zhì)膜受害程度成正相關[16]，電解質(zhì)外滲率與細胞傷害率已經(jīng)成為低溫傷害的標志[8，12-13]。

本試驗中，隨著溫度的降低，大多數(shù)品種細胞傷害率呈現(xiàn)“慢- 快- 慢”的增長趨勢，這與前人試驗結(jié)果基本一致[8-9，12]。 本試驗結(jié)合朱根海等[7-8，14]方法，建立了28 個品種的Logistic 方程，結(jié)果顯示大部分品種細胞傷害率與溫度之間呈現(xiàn)典型的“S”型，方程擬合度較高，初步表明Logistic 方程結(jié)合LT50可用于棉花耐寒性鑒定。

分析發(fā)現(xiàn)，不同生育期下各個棉花品種的LT50并不一致，表明棉花材料之間耐寒性存在差異。 花鈴期的LT50平均為2.23℃， 明顯遠高于其他3 個生育期，主要原因可能是花鈴期是棉花生殖生長與營養(yǎng)生長兩旺期，也是水肥敏感時期，水肥均可對棉花產(chǎn)生脅迫，不僅僅體現(xiàn)在低溫脅迫上，同時與花鈴期棉花適宜生長需要相對較高的溫度相符。耐寒性鑒定結(jié)果表明， 中J9645 和新陸早35 號耐寒性最強，新陸早36 號次之，新陸早26 號對低溫最敏感。 其中，中J9645 是中棉所鑒定出的耐寒性強的棉花材料， 本試驗結(jié)果與其一致， 進一步表明Logistic 方程結(jié)合LT50可用于棉花耐寒性鑒定評價。 整體上，棉花對低溫比較敏感，耐寒性相對較差，28 個品種各時期LT50較一些木本植物或一些耐冷植物偏低。

不同時期的28 個品種LT50平均值存在顯著差異， 即不同生育期棉花耐寒性之間存在顯著差異，再次表明不同生育期棉花耐寒機制不同，故而不能僅通過1 個生育時期的鑒定結(jié)果對棉花耐寒性評價，需建立不同生育期相應的適宜評價指標體系。實驗劃分出每個生育期棉花耐寒性級別，確立不同生育期棉花耐寒性標準，認為苗期、盛蕾期、花鈴期、 吐絮期棉花耐寒性指標的臨界溫度分別為－4 ℃、－2℃、2 ℃、－4 ℃，為棉花材料耐寒性、品種選育和栽培管理提供一定的科學依據(jù)。但此實驗是基于新疆地區(qū)主栽早熟棉花品種，且第1 次用Logistic 方程結(jié)合LT50運用到棉花耐寒性鑒定，研究結(jié)果還有待深化。