李智偉， 沙 桐， 藺志強， 周 延， 丁劍冰， 張峰波

(1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗中心， 烏魯木齊 830001; 2新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室， 烏魯木齊 830011;3新疆維吾爾自治區(qū)第六人民醫(yī)院檢驗科， 烏魯木齊 830013; 4新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科， 烏魯木齊 830054)

布魯氏菌病是由布魯氏菌感染引起的一種人畜共患病。布魯氏菌病在世界范圍流行，全球每年新發(fā)布魯氏菌病約50萬例[1]，我國新疆為流行區(qū)域，以羊種布魯氏菌病為主[2]。布魯氏菌造成多關(guān)節(jié)臟器損害，且病程長易反復(fù)[3]，引起這一現(xiàn)象的原因尚不明確。白細胞介素-33(Interleukin-33，IL-33)是新近發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性的細胞損傷的報警因子，ST2 (suppression of tumorigenicity 2 receptor)是IL-33的配體，IL-33/ST2通路可以對多種免疫細胞進行調(diào)控[4]，參與了感染、腫瘤、自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[5]。本研究通過分析IL-33和ST2在布魯氏菌病患者中表達變化，以明確IL-33/ST2在布魯氏菌病中的變化特點，為布魯氏菌病的慢性化的免疫機制提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集2018年6月-2019年4月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院就診的布魯氏菌病急性患者45例為急性病例組，年齡18～57歲，平均年齡(45.77±15.54)歲。慢性患者41例為慢性病例組，年齡18～61歲，平均年齡(48.32±17.13)歲。病例組納入標準：診斷符合2012 年中國頒布的《布魯氏菌病診療指南(試行)》標準，臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、骨關(guān)節(jié)痛、全身乏力等，虎紅平板凝集試驗(RBPT)進行初篩陽性，試管凝集試驗(SAT)檢測血清中抗布魯氏菌特異性抗體，滴度≥1∶100以上或病程持續(xù)1年以上仍有癥狀者，滴度為1∶50及以上者，血液、骨髓培養(yǎng)鑒定出布魯氏菌的患者。病程在6個月以內(nèi)的為急性期，6個月以上為慢性期。選擇同期體檢的健康人群48例為健康對照組，年齡18～60歲，平均年齡(46.12±13.25)歲。兩組人群排除腫瘤、傷寒、風濕熱、結(jié)核、自身免疫病和其他各種感染等疾病的人員。本研究經(jīng)過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(批準號：KY2018011864)并獲得所有患者知情同意書。

1.2 儀器和試劑美國BD公司FACS CantoII Plus流式細胞儀，IL-33，ST2，γ干擾素(interferonγ,IFN-γ)，IL-4的檢測試劑盒均使用北京AimPlex流式高通量多因子檢測試劑盒(T1C329432)。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理 采集急性病例組、慢性病例組患者和健康對照組人群的外周血2管。其中1管用抗凝劑的采血管采集5 mL，3 500 r/min離心20 min，取血清凍入-80℃保存。

1.3.2 AimPlex法檢測細胞因子 取出-80℃下儲存的樣本進行解凍后，將樣本在4℃下以12 000 rpm/min離心5 min后吸取上清液，依照說明書步驟進行操作。通過基于AimPlex bead-based的免疫測定法測定IL-33、ST2、IFN-γ、IL-4。使用FACS Canto II流式細胞儀分析所有樣本，用BD DIVA軟件收集數(shù)據(jù)，再用FCAP Array v3.0軟件分析檢測后的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 3組人群血清IL-33和ST2細胞因子水平與健康對照組相比，IL-33水平在急性病例組和慢性病例組中均明顯升高(P<0.01)(圖1A)；與健康對照組相比，ST2水平在急性病例組中顯著升高(P<0.01)，在慢性病例組中則下降(P=0.02)(圖1B)；與急性病例組相比，慢性病例組血清中IL-33水平升高更明顯(P<0.01)(圖1A)，ST2水平則明顯回落(P<0.01)(圖1B)。

2.2 3組人群血清IFN-γ和IL-4細胞因子水平IFN-γ水平在急性病例組中顯著升高(P<0.01)，在慢性病例組中輕度升高(P=0.03)(圖2A)；IL-4水平在急性病例組中輕度升高(P=0.02)，在慢性病例組中則顯著升高(P<0.01)(圖2B)。與急性病例組相比，慢性病例組血清中IL-4水平均顯著升高(P<0.01)(圖2A)。IFN-γ水平則明顯回落(P<0.01)(圖2B)(表1)。

表1 3組人群血清中細胞因子的濃度

注：與健康對照組比較，*P<0.05，**P<0.01； 與急性病例組比較，△P<0.01。

注： A， IL-33血清水平； B， ST2血清水平。

注： A， IFN-γ血清水平； B， IL-4血清水平。

3 討論

布魯氏菌感染宿主后，固有免疫無法完全清除這些感染，T細胞在根除布魯氏菌中發(fā)揮了重要的免疫作用[6]。Th1細胞通過釋放促炎性細胞因子介導吞噬細胞等免疫細胞殺滅致病菌。 IFN-γ是Th1細胞的主要分泌細胞因子，能夠促進Th1的分化發(fā)育，并對Th2細胞的分化發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。IL-4是Th2細胞主要分泌的細胞因子，可以促進Th2分化并抑制Th1分化；因此IFN-γ和IL-4的水平可以反映Th1/Th2細胞的分化情況[7]。IFN-γ在對抗布魯氏菌的Th1免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其減少會導致細菌無法清除[8]，本研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ在急性病例組顯著增高，在慢性病例組中明顯回落，而IL-4在慢性病例組中較急性病例組顯著上升，說明急性布魯氏菌病時主要以Th1細胞為主，發(fā)揮促炎反應(yīng)。在慢性布魯氏菌病時以Th2細胞為主，轉(zhuǎn)為抑炎反應(yīng)。

已有研究表明，IL-33在感染性疾病中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[9-10]。IL-33屬于IL-1家族，在大多數(shù)器官中IL-33由上皮細胞和內(nèi)皮細胞表達，在組織和細胞損傷過程時，IL-33被釋放并與受體ST2結(jié)合發(fā)揮免疫功能，因此被稱為炎癥預(yù)警因子[11]。本研究發(fā)現(xiàn)在布魯氏菌感染者體內(nèi)IL-33表達增高，與健康對照人群有顯著差異，說明IL-33在布魯氏菌感染時發(fā)揮了免疫功能，參與布魯氏菌的免疫應(yīng)答。本研究同時也發(fā)現(xiàn)IL-33水平在慢性感染時比急性感染時明顯增加，說明IL-33參與了布魯氏菌病的慢性化進程。ST2是作為IL-33的配體，以跨膜受體ST2(ST2L)和可溶性ST2(sST2)2種形式存在。主要表達在Th2、樹突狀細胞、巨噬細胞等細胞上[12]。本研究發(fā)現(xiàn)sST2在布魯氏菌病中顯著上升，特別是在急性布魯氏菌病中，上升非常明顯，而慢性布魯氏菌病時則顯著回落。已有研究表明，sST2水平升高與Th2型免疫為主疾病的活動度及嚴重程度密切相關(guān)[13]。本研究顯示ST2下降與布魯氏菌病中Th1減少有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，慢性期布魯菌病患者體內(nèi)IL-33與IL-4血清水比急性布魯氏菌病患者和健康人群顯著升高，并且持續(xù)增長。說明IL-33和IL-4在慢性布魯氏菌病時發(fā)揮了重要的免疫功能，可能是由于IL-33導致了布魯氏菌病從Th1向Th2轉(zhuǎn)變的主要原因。在其他性疾病中也有類似報道，如IL-33在寄生蟲[14]和結(jié)核感染[15]中均能增強Th2型免疫應(yīng)答，導致了平衡從Th1向Th2轉(zhuǎn)化。ST2作為IL-33的配體，sST2 可以抑制IL-33誘導的Th2型免疫應(yīng)答[16]；因此本研究認為，IL-33/ST2打破了Th1/Th2細胞之間的失衡，通過抑制Th1細胞，下調(diào)IFN-γ的表達水平，同時促進Th2細胞，增加了IL-4 的表達水平，使布魯氏菌發(fā)生了免疫逃逸。

綜上所述，布魯氏菌病從急性期到慢性期的演變過程中存在Th1向Th2傾斜的過程。IL-33/ST2可能參與了Th1/Th2的失衡的改變，這最終導致布魯氏菌病轉(zhuǎn)為慢性化病程，疾病遷延不愈。抑制IL-33/ST2信號通路介導的Th2型免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，可能會成為抑制布魯氏菌病慢性化的關(guān)鍵，但具體如何相互作用尚需進一步研究。