李盧國 駱云慧 徐善良, 2

循環(huán)水養(yǎng)殖黑鯛()水體中循環(huán)率對水質(zhì)因子和細菌群落多樣性的影響*

李盧國1駱云慧1徐善良1, 2①

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 2. 寧波大學(xué)海洋生物工程浙江省重點實驗室 寧波 315211)

為探討循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中循環(huán)率對水質(zhì)因子和細菌群落多樣性的影響, 以黑鯛()為研究對象, 研究了4次/天(低循環(huán)率)、8次/天(中循環(huán)率)、12次/天(高循環(huán)率)三個流量下, 養(yǎng)殖桶和生物過濾桶兩部分細菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性以及細菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性。高通量測序結(jié)果表明: 黑鯛循環(huán)水養(yǎng)殖中優(yōu)勢細菌類群為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和厚壁菌門(Firmicutes)。流量的升高可增加系統(tǒng)的細菌多樣性, 且高循環(huán)率過濾桶中具有凈化水質(zhì)降低營養(yǎng)鹽功能的有益菌屬更為多樣化及豐度更高, 同時, 其系統(tǒng)去氨氮和總氮效果更好, 去除率分別是49.5%和22.3%, 氨氮去除率是低循環(huán)率組的2.9倍和中循環(huán)率的3.6倍, 總氮去除率是低循環(huán)率組的8.2倍和中循環(huán)率組的20.5倍。PCoA分析和聚類分析結(jié)果表明, 各實驗組養(yǎng)殖桶與生物過濾桶中細菌群落組成有著明顯的差異, 中、高循環(huán)率組過濾桶菌落結(jié)構(gòu)與低循環(huán)率的有明顯的差異。環(huán)境因子與細菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析結(jié)果表明, 總磷、活性磷酸鹽、亞硝酸鹽和總氮等指標對細菌群落結(jié)構(gòu)影響相對較大, 但未發(fā)現(xiàn)兩者間有很顯著的相關(guān)性。

黑鯛(); 循環(huán)水養(yǎng)殖; 細菌群落; 高通量測序; 循環(huán)率

黑鯛(), 屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、鯛科(Sparidae), 系暖溫性近海底層魚類, 分布于北太平洋西部、中國沿海, 以黃、渤海產(chǎn)量較多(朱德芬, 1993), 現(xiàn)有黑鯛養(yǎng)殖以網(wǎng)箱和池塘為主(蔣萬釗, 2011)。循環(huán)水養(yǎng)殖提供了一種高效利用水資源的養(yǎng)殖方式, 可大大降低養(yǎng)殖業(yè)對環(huán)境的污染程度, 且又具有養(yǎng)殖系統(tǒng)自身水質(zhì)穩(wěn)定、防病能力強等優(yōu)勢(王威等, 2012; 王峰等, 2013; Wold, 2014)。循環(huán)率作為循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中一個重要的技術(shù)參數(shù), 其可有效地影響循環(huán)水系統(tǒng)細菌多樣性和去氨氮和亞硝態(tài)氮等營養(yǎng)鹽的能力, 為很多研究者所重視, 如李雪晴(2018)、Fivelstad等(1994)、姚延丹等(2011)等。而對黑鯛循環(huán)水養(yǎng)殖模式的研究尚未見報道, 探究黑鯛循環(huán)水養(yǎng)殖中適合的循環(huán)率不僅可以提高黑鯛循環(huán)水飼養(yǎng)的效率, 同時還可避免能源浪費。

水產(chǎn)動物生活的水環(huán)境中有著豐富的微生物群落, 其對去除有害營養(yǎng)鹽, 維持水環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用。當養(yǎng)殖環(huán)境水體理化性質(zhì)改變時, 微生物群落結(jié)構(gòu)會相應(yīng)產(chǎn)生變化(Moriarty, 1997; Sugita, 2005; Balcázar, 2006)?；?6S rRNA的高通量測序技術(shù), 主要基于細菌16S rRNA基因在功能上的高度保守性以及對應(yīng)序列不同位點的高變性, 能夠真實全面地反映樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的基本特征, 檢測到純培養(yǎng)和其他非培養(yǎng)技術(shù)未能發(fā)現(xiàn)的低豐度微生物種類(湯學(xué)敏等, 2012; Chen, 2018; Xu, 2019)。這方面的相關(guān)研究已有報道, 并發(fā)現(xiàn)不同循環(huán)率與養(yǎng)殖系統(tǒng)中的細菌群落及多樣性具有相關(guān)性(Leonard, 2000; 姚延丹等, 2011; 張翔等, 2016)。

本文比較了不同循環(huán)率下黑鯛循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中水質(zhì)和菌群結(jié)構(gòu)及其多樣性, 旨在為黑鯛的循環(huán)水養(yǎng)殖模式推廣及健康養(yǎng)殖系統(tǒng)的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 循環(huán)水系統(tǒng)構(gòu)建與試驗設(shè)計

本實驗在象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司進行, 黑鯛()幼魚平均體重35±10g, 購自該公司。每個黑鯛循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)由500L養(yǎng)殖圓桶和一個生物過濾桶通過出入水管組裝而成。實驗共設(shè)計3個循環(huán)率實驗組, 每組3個重復(fù)共9個系統(tǒng)。每個養(yǎng)殖系統(tǒng)水體300L, 黑鯛幼魚放養(yǎng)密度為6.5kg/m3。低循環(huán)率組(A), 4次/天; 中循環(huán)率組(B), 8次/天; 高循環(huán)率組, 12次/天(C)。

實驗魚在各自調(diào)節(jié)好流速的實驗桶中暫養(yǎng)5d后開始實驗, 實驗周期為6周。實驗期間, 水溫18°C±0.5°C, 連續(xù)充氣, DO≥5.9mg/L, 鹽度25±1, pH 7.3±0.2, 自然光照。投喂海龍牌海水魚飼料(粗蛋白≥44%, 粗脂肪≥5%)。每天上午9:00和下午16:00各投喂1次, 日投喂量為魚體重的1 %。每天上午投喂前進行吸污, 并補水10%左右。

1.2 樣品采集

1.2.1 水樣采集 分別在實驗開始第2、7、14、21、28、35、42天采集水樣。在上午投喂后4h, 分別用500mL水樣瓶從每個系統(tǒng)的養(yǎng)殖桶和過濾桶出水口采集水樣, 及時帶回實驗室用于分析氮磷營養(yǎng)鹽指標。

1.2.2 微生物樣品采集 在實驗中期的第3周(第21天), 分別采集三個實驗組養(yǎng)殖桶水樣中微生物(A1、B1、C1)和生物過濾桶中的微生物(A2、B2、C2)樣品。分別在每個養(yǎng)殖桶采集1L水樣, 同時在每個過濾桶中取濾料上的微生物樣品, 每個濾桶樣品約20g, 將濾料剪碎放入50mL離心管, 注入PBS緩沖液震蕩, 使微生物脫離濾料表面, 收集水樣。然后將養(yǎng)殖桶水樣和過濾桶樣品, 用0.22μm的無菌纖維素濾膜真空抽濾, 將抽濾后的濾膜取出放置于10mL的無菌離心管中, –80°C冰箱保存待送測。

1.3 氮磷營養(yǎng)鹽檢測

水質(zhì)指標氨氮(NH3)、亞硝酸鹽(NO2)、硝酸鹽(NO3)、磷酸鹽(PO4)、總氮(TN)、總磷(TP)。按照GB/T 12763.4-2007 海洋調(diào)查規(guī)范測定各水樣營養(yǎng)鹽含量(中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局等, 2008)。經(jīng)0.45μm纖維濾膜抽濾取25mL水樣濾清液進行分析, 每個水樣三個重復(fù)。

1.4 DNA提取及擴增測序

利用水體環(huán)境基因組提取試劑盒Water DNA kit (Omega)對樣本的基因組DNA進行提取1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測。以獲取的DNA為模板, 用16S rRNA V3—V4區(qū)保守區(qū)通用引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并剪切純化回收產(chǎn)物后建庫并測序。測序由諾和致源生物信息公司完成。

1.5 生物信息學(xué)分析

對測序數(shù)據(jù)的預(yù)處理: (1) 通過Cutadapt低質(zhì)量部分剪切reads, 比對Barcode區(qū)分出樣品分類數(shù)據(jù), 經(jīng)簡化得到原始數(shù)據(jù)(raw reads); (2) 為了得到有效數(shù)據(jù)(clean reads), 還需根據(jù)物種注釋數(shù)據(jù)庫比對Reads序列去除其中的嵌合體序列; (3) 各樣品OTUs (Operational Taxonomic Units)是通過Uparse軟件以97%的一致性將clean reads聚類, 其后而成。

統(tǒng)計分析: (1) 對OTUs序列進行物種注釋分析得到各樣本在各分類水平上的群落組成。(2) 最后以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標準對各樣品的數(shù)據(jù)均一化處理, 所得的數(shù)據(jù)通過Qiime軟件(Version 1.9.1)計算各樣品數(shù)據(jù)的多樣性指數(shù)和Unifrac距離、構(gòu)建UPGMA樣本聚類樹。使用R軟件(Version 2.15.3)繪制PCoA圖。(3) 對于環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析, 使用vegan包對環(huán)境因子進行CCA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同循環(huán)率對水質(zhì)指標的影響

三個循環(huán)率組的水質(zhì)因子變化如圖1所示, 活性磷酸鹽濃度的變化范圍在0.7—4.61mg/L, 其濃度隨著循環(huán)率的增大有上升趨勢, 隨著養(yǎng)殖時間的延長, 三個流量組的變化規(guī)律一致, 呈逐漸上升的趨勢。亞硝酸鹽濃度的變化范圍在0.08—0.95mg/L, 在實驗期間三個流量組之間亞硝酸濃度并沒有顯著性差異(>0.05), 3組的變化規(guī)律也相似, 都先上升后下降的趨勢, 在21d時達峰值; 硝酸鹽濃度的變化范圍在0.31—35.05mg/L, 在實驗早期濃度波動較大, 在實驗?zāi)└吡髁拷M顯著低于低中流量組(<0.05); 氨氮濃度的變化范圍在1.22—7.65mg/L, 在實驗第14天和第21天時, 高流量組氨氮濃度大于其他兩組, 而在第28天后, 高流速組氨氮濃度均在中低流速組之下, 其中第35天時, 差異顯著(<0.05)。總氮的變化范圍在30.69—56.32mg/L, 高流速組總氮含量在第21天后開始下降, 低、中流速組則呈逐漸上升趨勢; 總磷的變化范圍在5.34—14.92mg/L, 3組變化趨勢相同, 呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 在第7天達到最大值。

圖1 各實驗組營養(yǎng)鹽濃度

注： 數(shù)據(jù)上標不同表示組間存在顯著差異(<0.05)

2.2 細菌群落α多樣性分析

通過對測序結(jié)果整理分析, 經(jīng)過均一化的處理后, 如表1所示, 6個樣品最后得到有效序列在52418—80137條之間, 序列平均長度在402—408bp之間, 各組獲得的有效OTU數(shù)量平均值為357.16, 其中各流量組養(yǎng)殖桶中的水環(huán)境OTU少于平均值, 生物桶中濾料上的OTU則多于平均值, 說明生物過濾桶中細菌豐富度更高。物種豐富度指數(shù)chao1、ACE、shannon指數(shù)顯示, 生物過濾桶中的細菌群落豐富度和多樣性均高于養(yǎng)殖桶, 其中, 高流量組和中流量組的生物過濾桶中細菌群落的豐富度和多樣性要低于低流量組的。而在高流量組和中流量組的養(yǎng)殖桶中細菌群落的豐富度和多樣性卻高于低流量組的。三個實驗組樣品的測序覆蓋率都超過了0.99, 說明測序數(shù)據(jù)覆蓋了大部分OTU, 能很好地反映物種多樣性。

2.3 細菌群落結(jié)構(gòu)分析

選取每個樣本門水平(Phylum)上最大豐度排名前10的物種, 生成物種相對豐度柱形累加圖, 6個樣品中的物種注釋結(jié)果如圖2所示, 可以看出各樣品細菌群落結(jié)構(gòu)組成比較相似, 但同一類群的相對豐度存在較大區(qū)別。各樣品中細菌種群主要分布在變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes), 在6個樣品中所占的比例分別為58%—86%和8%—19%, 其他幾個優(yōu)勢菌門分別是放線菌門(Actinobacteria, 0.8%—14%)、疣微菌門(Verrucomicrobia, 0.5%—3%)、厚壁菌門(Firmicutes, 0.2%—2%)等。

在屬水平上, 選取最大相對豐度排名前30的物種, 生成如圖2所示柱型累加圖。在6個樣品中(0.3%—19%)、(0.09%—17%)、(0.1%—15%)、(1%—12%)、(0.09%—11%)5個屬的相對豐度最高, 其中來自紅細菌科(Rhodobacteraceae)的ter和a在養(yǎng)殖桶中占比(8%—19%, 3%—17%)明顯高于過濾桶中的(0.3%—1%, 0.09%—0.7%)。

表1 細菌群落多樣性指數(shù)

Tab.1 The diversity index of bacterial communities

圖2 門水平(a)和屬水平(b)上各樣品細菌群落結(jié)構(gòu)組成

根據(jù)所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息, 選取豐度排名前35的屬, 根據(jù)其在每個樣本中的豐度信息進行聚類。聚類熱圖如圖3所示, 可以看出3組系統(tǒng)環(huán)境微生物中, 隨著流量的上升, 斯氏弓形菌屬(, 0.51%)、小紡錘狀菌屬(, 2.2%)、(2.1%)、弧菌屬(, 1.3%)、硫酸鹽桿菌屬(, 14%)、(15.3%)相對豐度明顯下降。而中、高流速組系統(tǒng)分別在系統(tǒng)內(nèi)部環(huán)境微生物中少數(shù)幾種屬豐度明顯升高, 中流量中包括陸丹氏菌屬(, 1.2%)、(1.7%)、(1.1%)、乙醇速生桿菌屬(, 2%)、(2.1%); 高流量組中包括(6.7%)、(2.5%)、(17.7%)。另外, 篩選出若干豐度不高, 但對水環(huán)境凈化以及對水生物病害防控起到重要作用的功能性細菌以及對魚體存在潛在致病性的細菌, 如圖4所示?？梢钥闯? 樣品中可檢測到的條件致病菌為鏈球菌屬()。參與氮循環(huán)及與硝化功能相關(guān)的屬包括亞硝化單胞菌屬()、黃桿菌屬和藍細菌()。具有還原硫酸鹽功能的屬假單胞菌屬()。具有調(diào)控水體微生物及病害防控功能的屬乳桿菌屬()。其中, 鏈球菌屬的相對豐度隨流量的升高而上升, 由0.075%上升至0.41%。亞硝化單胞菌屬的相對豐度隨流量的升高先下降后上升, 變化范圍在0.003%—0.023%。黃桿菌屬和藍細菌的相對豐度都隨流量的升高而上升, 分別由0.09%上升至0.3%和由0.07%上升至0.16%。假單胞菌屬的相對豐度隨流量的上升先上升后下降, 變化范圍在0.08%—0.2%。乳桿菌屬的相對豐度則隨流量的上升先下降后上升, 變化范圍在0.19%—0.5%。

圖3 各樣品優(yōu)勢細菌物種豐度熱圖

圖4 各組細菌特定屬相對豐度變化

2.4 細菌群落相似性分析

主坐標分析(PCoA, Principal Co-ordinates Analysis),是通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu), 是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法。本研究中, PC1貢獻率為70.25%, PC2貢獻率為18.06%, 累計貢獻率達到了88.31%。由圖5a顯示, 三個流量組的養(yǎng)殖水環(huán)境和生物過濾桶中的細菌群落存在明顯差異。隨著流速的升高, 其養(yǎng)殖桶中細菌群落結(jié)構(gòu)不發(fā)生明顯的改變, 而生物過濾桶中的細菌群落隨著流速的上升, 中、高流速組相較于低流速組細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較明顯的變化。

對6個樣本細菌群落結(jié)構(gòu)進行聚類分析, 構(gòu)建如圖5b所示的聚類樹。結(jié)果顯示, 三個流速組的養(yǎng)殖桶菌群結(jié)構(gòu)聚為一類, 與3個流速組的生物過濾桶菌群有較大差異。在三組養(yǎng)殖桶菌群結(jié)構(gòu)中, 中流量組又與低、高流量組有所不同; 而在各組生物過濾桶中, 低流速組則與中和高流速組有所差異。

圖5 細菌群落主坐標分析圖(a)和聚類分析圖(b)

2.5 細菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性結(jié)果可由多元直接梯度分析(CCA分析)所得, 該分析方法可反映整體菌群數(shù)據(jù)與實驗環(huán)境因子的關(guān)系, 并進一步得到影響樣本分布的重要環(huán)境驅(qū)動因子。從表2可以看到細菌與環(huán)境之間的關(guān)系累積變化值達到了65.31%(第一排序軸CCA1和第二排序軸CCA2貢獻率之和), 表中2代表了環(huán)境因子對物種分布的決定系數(shù), 其值與環(huán)境因子對物種分布影程度呈正相關(guān)。Pr表示相關(guān)性的顯著性檢驗。6個環(huán)境因子中, 總磷、活性磷酸鹽、亞硝酸鹽和總氮含量與細菌群落豐富度和多樣性密切相關(guān)。其中TN、TP與第一排序軸呈正相關(guān), 其他營養(yǎng)鹽與其呈負相關(guān)。但是總體而言, 這6個營養(yǎng)鹽因子與菌群的分布無顯著性影響(>0.05)。

表2 環(huán)境因子與細菌群落相關(guān)性

Tab.2 Correlation between environmental factors and bacterial communities

3 討論

循環(huán)率是循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中一個重要的技術(shù)參數(shù), 適合的流量不僅有助于生物濾桶內(nèi)基質(zhì)的擴散和接觸, 還可促進氨氧化菌的生長。Franco-Nava等(2004)和曹涵(2008)認為一定的流速會提高生物濾器的去除能力從而改善水質(zhì)。本研究中, 三個實驗組水質(zhì)營養(yǎng)鹽濃度檢測結(jié)果顯示, 在實驗后期高流量組對氨氮和總氮的去除能力明顯比其他兩組強, 氨氮屬于有害營養(yǎng)鹽, 而總氮與水體有機物含量密切相關(guān)(Klausmeier, 2004; 文世勇等, 2009)。這表明, 在系統(tǒng)運行穩(wěn)定后, 高流量組對氨氮的去除能力及對水質(zhì)的凈化效果較其他兩組更佳。在第21天的生物膜菌群也顯示出中、高流量組中優(yōu)勢菌種氨氧化菌屬相對豐度(21%, 12%)要明顯高于低流速組(1.09%),是α-Proteobacteria綱中Rhodobacteraceae紅桿菌科中的一種紫色非硫菌, 可通過氨化作用降低水中化學(xué)需氧量(COD)(欽穎英等, 2007; 黃志濤等, 2016)。但在實驗中期(21d), 高流速組的氨氮含量卻顯著高于其他兩組, 這可能跟高流速組黑鯛攝食能力更強, 日投餌量和代謝能力要高于其他兩組, 加之功能菌群的滯后行使凈化功能有關(guān)。另外, 在分析實驗中期的3組系統(tǒng)環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)高流速組中具有固氮作用功能菌屬藍細菌()的豐度升高以及具有硝化作用功能的亞硝化單胞菌屬()豐度下降, 也造成了該時期高流量養(yǎng)殖系統(tǒng)中的氨氮更嚴重得積累。有研究表明循環(huán)水系統(tǒng)中溶解氧濃度會隨流量的升高而升高(李雪晴, 2018), 在低流量下, 更易形成區(qū)域缺氧環(huán)境, 可能發(fā)生活躍的脫氮作用, 使環(huán)境硝酸鹽含量降低, 并有利于具有脫氮作用的兼性厭氧菌的生長。本研究中低流速組的硝酸鹽含量在第21天時顯著低于其他兩組, 可能原因就在于此, 并發(fā)現(xiàn)了低流量組優(yōu)勢菌種中具有反硝化功能的兼性厭氧菌的相對豐度要明顯高于其他兩組, 包括了斯氏弓形菌屬()、和。結(jié)合三組氨氮及亞硝酸鹽濃度都在第21天開始下降, 推斷三個流量組的生物過濾桶循在此時間點開始建立穩(wěn)態(tài)的細菌生物膜并能有效地凈化水質(zhì)。隨后, 對各實驗組進行環(huán)境菌群取樣, 分析三組之間細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異以及其與環(huán)境因子相互關(guān)聯(lián)分析。

鑒于微生物在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要性, 微生物生態(tài)學(xué)的關(guān)鍵問題之一是微生物群落如何響應(yīng)環(huán)境的變化。周洪玉等(2017)研究指出, 養(yǎng)殖環(huán)境中細菌群落的高多樣性更有利于水體穩(wěn)態(tài), 減少病害的暴發(fā)。姚延丹等(2011)對比人工濕地-池塘養(yǎng)殖系統(tǒng)和傳統(tǒng)養(yǎng)殖池塘的水體生物特征, 發(fā)現(xiàn)隨著循環(huán)水的流量增大, 水環(huán)境中的細菌多樣性也隨之提高(姚延丹等, 2011)。本研究中, Alpha多樣性分析結(jié)果顯示, 隨著流量的增加, 養(yǎng)殖桶中的OTU數(shù)量隨之增加, 這與細菌多樣性指數(shù)ACE、Chao1和Shannon指數(shù)的變化相同。而生物過濾桶中的OTU隨著流量的升高呈下降趨勢, 且高流量組的細菌多樣性指數(shù)也比其他兩組的要低。以上結(jié)果表明, 高流量雖然提高了養(yǎng)殖水環(huán)境細菌的多樣性和豐度, 但卻降低了生物過濾桶中細菌多樣性和豐度。分析原因可能是: 已有相關(guān)報道表明生物池過濾后的水樣中細菌OTU總數(shù)較過濾前會有所提高(Leonard, 2000; 張翔等, 2016), 這說明附著在濾料上的細菌會脫落進入水環(huán)境中, 而流量的提高會時細菌更容易脫落(姚延丹等, 2011)。但總體而言, 高流量組養(yǎng)殖水環(huán)境和生物濾桶中OTU數(shù)量之和(496)大于低流量組的OTU總數(shù)(486)和中流量組的OTU總數(shù)(460)。說明高流量更有利于水體穩(wěn)態(tài), 使水環(huán)境中的高濃度有害營養(yǎng)鹽更快通過硝化作用回歸正常值, 這與在第21天后的水質(zhì)結(jié)果基本相似。另外, 本實驗中, 對比了3組系統(tǒng)養(yǎng)殖桶和循環(huán)桶中優(yōu)勢菌群的相對豐度發(fā)現(xiàn), 屬上相對豐度最高且無運動能力的4個屬、、、在養(yǎng)殖桶中占比(最高分別是19%, 17%, 15%, 12%)要明顯高于循環(huán)桶(最高分別是1%, 0.7%, 0.4%, 1%), 這是否與無運動能力的細菌遇到水流的作用更易脫落進入養(yǎng)殖桶中有關(guān)還需要進一步研究。

對海洋微生物群落的研究表明, Proteobacteria和Bacteroidetes是世界各地不同季節(jié)海水中的主要微生物群體(Gilbert, 2009; Tinta, 2015)。在淡水生境中, 許多關(guān)于河流, 湖泊和水庫沉積物中細菌群落的報道已經(jīng)顯示出來類似的結(jié)果(Cheng, 2014)。在本研究中, 3個流量組中不管是養(yǎng)殖桶還是生物過濾桶中, Proteobacteria(58%—86%)豐度都是最高的。伴隨著流量的提高, 3個組總體γ-Proteobacteria豐度也隨之升高。據(jù)文獻報道, γ-Proteobacteria類群廣泛存在于是循環(huán)水健康養(yǎng)殖池及一些魚類的皮膚、腮、腸道中(Roeselers, 2011), 且養(yǎng)殖水體好壞的與其豐度存在正相關(guān), 豐度越高越有利于養(yǎng)殖動物的健康生長(Hu, 2007; Schreier, 2010; 吳越等, 2017)。

有研究表明, 環(huán)境微生物的分布存在顯著的區(qū)域差異, 具有類似功能的微生物往往聚集在一起(Xu, 2019)。本研究中, 三組流量組系統(tǒng)中豐度相似的優(yōu)勢屬有9個。包括、、等功能性有益菌。另外14個優(yōu)勢屬在三組系統(tǒng)中差異較大。其中, 低流量組優(yōu)勢屬有6個, 包括條件致病菌斯氏弓形菌()和弧菌屬(), 弧菌可引起大規(guī)模水產(chǎn)疾病發(fā)生并造成嚴重死亡(Higgins, 2007; Zhang, 2013); 中流量組優(yōu)勢屬有5個, 包括可降解多環(huán)芳烴的乙醇速生桿菌()、; 高流量組優(yōu)勢屬有3個, 包括可生產(chǎn)細菌葉綠素的。說明流量的變化會使環(huán)境微生物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一些差異。通過聚類分析也可看出這一現(xiàn)象, 三組生物過濾桶細菌群落相似性要高于過濾桶和養(yǎng)殖桶之間的相似性, 說明在過濾桶這樣更為復(fù)雜的環(huán)境中, 由于溶氧、光照、有無附著濾料等條件制約下, 會形成與養(yǎng)殖桶截然不同的細菌結(jié)構(gòu), 這與吳越等(2017)的研究發(fā)現(xiàn)相一致。在過濾桶中, 中、高流量組細菌群落聚為一類。暗示了流量的升高會使生物濾膜趨向于選擇和形成相似的細菌結(jié)構(gòu)。而在低豐度菌群中, 黃桿菌屬()、和有益菌在高流量組系統(tǒng)中占比相較于其他兩組更高, 假單胞菌屬()則在中流量組更高。有研究表明能在某些條件下將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為各種還原性產(chǎn)物, 可降低養(yǎng)殖水體含氮量(Ma, 2013; Mcbride, 2014; 張海耿等, 2017);屬于綠彎菌門, 其可通過自身生產(chǎn)的細菌葉綠素進行光合作用(黃志濤等, 2016);代謝可以產(chǎn)生有機酸、細菌素、過氧化氫、雙乙酞等多種天然抑菌物質(zhì), 具有調(diào)節(jié)水體菌群平衡, 并可提高魚體免疫力等多種功能(韓俊華, 2003)。假單胞菌屬()可通過還原的硫酸鹽來降低水體硫的含量。通過CCA分析, 發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子和微生物種群之間相關(guān)性并沒有顯著相關(guān)性, 分析其原因可能是實驗期間只探究了其實驗中期一個時間點水質(zhì)與環(huán)境微生物的相關(guān)性(>0.05), 會因為樣本量過少造成相應(yīng)的誤差。

4 結(jié)論

綜上所述, 在本實驗循環(huán)水條件運行過程中, 3個循環(huán)率組養(yǎng)殖桶中氨氮和亞硝態(tài)氮濃度均在實驗開始后第21天開始下降, 說明3個組生物膜在第21天都已經(jīng)掛膜穩(wěn)定。3個循環(huán)率組養(yǎng)殖桶中菌群結(jié)構(gòu)差異不明顯, 而與3組過濾桶生物膜中菌群結(jié)構(gòu)有較大差異, 且隨著循環(huán)率增大, 生物膜中細菌結(jié)構(gòu)也發(fā)生較明顯的改變。其中有益菌屬、黃桿菌屬()、和等在高循環(huán)率組中占比變高, 而潛在致病菌斯氏弓形菌()和弧菌屬()在中、高循環(huán)率組中占比變低。通過分析水樣中營養(yǎng)鹽與群落分布的相關(guān)性發(fā)現(xiàn), 總磷、總氮、活性磷酸鹽和亞硝酸鹽含量雖然與細菌群落豐富度和多樣性密切相關(guān), 但沒有顯著性差異。本研究全面了解了不同循環(huán)率下養(yǎng)殖桶和循環(huán)桶中細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。但由于微生物掛膜應(yīng)該是一個動態(tài)的過程, 而此次試驗僅在實驗中期一個時間點采樣, 今后應(yīng)該研究增大采樣時間點(比如實驗系統(tǒng)運行后的前、中、后期)來改進, 全面了解水體各功能群體動態(tài)變化。

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EFFECTS OF FLOW RATE ON WATER QUALITY FACTORS AND MICROBIAL COMMUNITY IN RECIRCULATING AQUACULTURE SYSTEM FOR

LI Lu-Guo1, LUO Yun-Hui1, XU Shan-Liang1, 2

(1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Zhejiang Key Laboratory of Marine Bioengineering, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In order to investigate the effects of flow rate on water quality factors and bacterial community diversity in recirculating aquaculture systems, black cockroach () was taken as the research object, on which the bacterial community structure, diversity, and the correlation between bacterial communities and environmental factors of the culture barrel and biological filter barrel were studied in three flow rates of 4 (low), 8 (medium), and 12 times/d (high). High-throughput sequencing was used. Results showed that the dominant bacterial groups in the circulatory aquaculture were Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Verrucomicrobia and Firmicutes. The increase of flow rate enhanced the bacterial diversity of the system. The beneficial bacteria capable of purifying water and reducing nutrient salt in high-flow filter bucket were more diverse and richer, with which the system had better effects on removing ammonia nitrogen and total nitrogen and the removal rates were 49.5% and 22.3%, respectively. The ammonia nitrogen removal rate was 2.9 times of the low rate group and 3.6 times of the medium rate group, and the total nitrogen removal rate was 8.2 times of low rate group. Double and 20.5 times of the medium rate group. Results of PCoA analysis and cluster analysis revealed significant differences in bacterial community composition between the culture barrels and the biological filter barrels. In addition, a significant difference was observed in colony structure of the biological filter barrel between the medium-high rate groups and the low rate group. Correlation analysis showed that total phosphorus, active phosphate, nitrite, and total nitrogen had relatively significant effects on bacterial community structure, but no significant correlation was found between the environmental factors and the bacterial community structure.

; recirculating aquaculture; bacterial community; high-throughput sequencing; flow rate

* 國家自然科學(xué)基金項目, 31872586號; 浙江省自然科學(xué)基金項目, LY18C190008號; 寧波市科技攻關(guān)項目, 2017C110003號。李盧國, 碩士研究生, E-mail: 1059154834@qq.com

徐善良, 教授, 博士生導(dǎo)師, E-mail: xushanliang@nbu.edg.cn

2019-11-08,

2019-12-11

S965

10.11693/hyhz20191100209