常仕林，蔡輝

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川；2.甘肅省人民醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州）

0 引言

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）是主要造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子之一，為分子量為14-22 KD的廣譜效應(yīng)多肽生長(zhǎng)因子。目前人們認(rèn)為GM-CSF可能通過(guò)結(jié)合特定的受體而起作用，在調(diào)節(jié)造血和白細(xì)胞功能等方面具有重要作用[1]。但是，GM-CSF對(duì)腫瘤進(jìn)展有何影響目前還不是很清楚，部分研究人員認(rèn)為GMCSF對(duì)腫瘤進(jìn)展有抑制作用[2-5]，另外一部分研究者認(rèn)為GMCSF對(duì)腫瘤進(jìn)展有促進(jìn)作用[6-9]。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，通過(guò)檢測(cè)GM-CSF對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖和遷移的影響來(lái)探究其對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)展有何作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞株

人胃癌SGC7901細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院蘭州分院空間輻射生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于新西蘭Hyclone公司；胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Amresco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；GM-CSF購(gòu)于美國(guó)Peprotech公司。

1.1.3 主要儀器

細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、高速臺(tái)式離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司），DMIL-BFC295倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司），Infinite 200 Pro酶標(biāo)分析儀（瑞士Tecan公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌SGC7901細(xì)胞，含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，于恒溫37.5℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人重組GM-CSF溶解濃度為4 mg/L，于-80℃保存，工作液濃度為20μg/L。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分為兩組

GM-CSF刺激組，加入20μg/L GM-CSF刺激；空白對(duì)照組，加等量培養(yǎng)基，未做其他處理。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性

將胃癌SGC7901細(xì)胞總數(shù)8×103接種在96孔板至貼壁。按以上分組繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，在570nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度（A），比較各組細(xì)胞活性，細(xì)胞活性率=（各實(shí)驗(yàn)組平均A值/空白對(duì)照組平均A值）×100.0%。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種在60mm培養(yǎng)皿，進(jìn)行不同分組處理。持續(xù)培養(yǎng)14 d后去掉培養(yǎng)液，PBS清洗，75%乙醇固定，結(jié)晶紫染色?？寺⌒纬陕?（形成克隆數(shù)/種植細(xì)胞數(shù)）×100.0%。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種在35mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后取無(wú)菌牙簽沿培養(yǎng)皿底部進(jìn)行劃痕，使用無(wú)菌PBS洗細(xì)胞3次，洗去不貼壁的細(xì)胞后重新加入培養(yǎng)基。在劃痕第0h、24h倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并攝影。比較各組細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率=（0h劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GM-CSF對(duì)胃癌細(xì)胞活性和增殖的促進(jìn)作用

與空白對(duì)照組相比較，GM-CSF刺激組胃癌細(xì)胞活性、克隆形成率均有明顯升高（P＜0.05）（圖1）。提示GM-CSF處理具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的作用。

圖1 胃癌SGC7901細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的影響

2.2 GM-CSF對(duì)胃癌細(xì)胞遷移效果的促進(jìn)作用

與空白對(duì)照組相比較，GM-CSF刺激組胃癌細(xì)胞遷移進(jìn)程有明顯加快（P＜0.05）（圖2）。提示GM-CSF處理具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移進(jìn)展的作用。

圖2胃癌SGC7901細(xì)胞遷移的影響

3 討論

GM-CSF是人體主要造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子之一。早期臨床數(shù)據(jù)表明，GM-CSF具有提升腫瘤患者化療藥物最大耐受劑量、減少感染和促進(jìn)造血恢復(fù)等作用[10,11]，是臨床上常用的化療輔助藥物[12]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的GM-CSF可刺激腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展[6,13]。本文中的克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GM-CSF能夠刺激胃癌細(xì)胞增殖并增強(qiáng)細(xì)胞活性，與之前的報(bào)道一致。同時(shí)，我們的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了GMCSF 能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)臨床上研究胃癌的轉(zhuǎn)移和侵襲有重要的參考價(jià)值。

綜上所述，GM-CSF促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的同時(shí)促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移。表明GM-CSF對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程具有重要作用。但是，GM-CSF促進(jìn)胃癌進(jìn)展的相關(guān)通路和途徑目前還不清楚，有待進(jìn)一步研究。