溫珊，蘇衍萍

（山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，山東 泰安）

0 引言

根據(jù)2017年美國一份關(guān)于癌癥的報告顯示，肺癌仍然是死亡率（男性和女性分別為27%和25%）最高的惡性腫瘤，在我國也有同樣的問題，甚至更加嚴(yán)峻。

1 PTEN的分子特質(zhì)及在腫瘤中發(fā)揮的作用

根據(jù)研究顯示，人第10號染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10,PTEN）,是一種抑癌基因，處于人染色體10q23.3，在細(xì)胞增殖方面起著重要的負(fù)調(diào)控作用，但在肺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)比正常組織低。

2 PPARγ的分子特質(zhì)及在腫瘤中發(fā)揮的作用

過氧化物酶體增殖激活受體（PPARγ），人體PPARγ基因位于3p25，全長大于100kb長度。mRNA包括9個外顯子，PPARγ最初被發(fā)現(xiàn)是脂肪細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、胰島素敏感性和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄的重要物質(zhì)。越來越多的發(fā)現(xiàn)PPARγ可以通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化、抑制血管形成和降低腫瘤侵襲能力等不同機(jī)制發(fā)揮著作用，有望成為腫瘤治療的一個新途徑。因此，本研究通過觀察PPARγ對人肺腺癌細(xì)胞A549相關(guān)蛋白的影響，上調(diào)抑癌基因PTEN表達(dá)的角度探討PPARγ與肺腺癌的關(guān)系。

3 材料和方法

3.1 細(xì)胞株與主要試劑

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（A549）購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。F-12K Basic 培養(yǎng)基，胎牛血清，含0.25%胰酶-EDTA（Gibco 公司，批號分別為 C11995500CP，1600044，25200072）；磷酸鹽緩沖液（PBS，HyClone公司，批號 SH30256.01）；PTEN antibody；PPARγ antibody；mouse antibody；β-肌動蛋白（β-actin）antibody（CST公 司，貨 號 分 別 為9188，4257，4366，9268，2118，4790）；鼠抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；發(fā)光液（Millipore公司，批號WBKLSO500）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實時熒光定量PCR（Real-time PCR）試劑盒（羅氏公司，批號分別為04379012001，4913850001）。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計、合成，PTEN上游和下游；PPARγ上游和下游；β-actin 上游和下游 ；E.Z.N.A. Total RNA Kit Ⅱ（OMEGA公司R6934-01）。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素和100IU/mL鏈霉素的F12K細(xì)胞培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)4代后，細(xì)胞狀態(tài)良好，用于實驗。

3.3 將目的基因PPARγ和PTEN轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞

收集處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并進(jìn)行計數(shù)，細(xì)胞鋪板。使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%，細(xì)胞鋪板中放入含10%血清，不含抗生素的培養(yǎng)液中。對于轉(zhuǎn)染當(dāng)天，用不含血清的培養(yǎng)基漂洗兩次，配好脂質(zhì)體和質(zhì)粒輕緩混合，室溫放置5分鐘，混合稀釋的DNA和稀釋的3000室溫保溫20分鐘，直接將復(fù)合物（100ul）加入到每孔中，在37℃ 5%CO2放置18-48個小時。在細(xì)胞中加入復(fù)合物18-72小時后，分析細(xì)胞的提取物。

3.4 實時熒光定量PCR檢測PPARγ和PTEN的表達(dá)

取對數(shù)生長期的A549，首先用胰蛋白酶消化，再使用預(yù)冷的PBS清洗一遍，配RNA與β-巰基乙醇的混合物?；靹虼荡颍覝胤跤?，再加入氯仿，之后離心，用試劑盒里面的RNA Wash buffer反復(fù)清洗。使用核酸定量儀器測定RNA的濃度和純度，一般認(rèn)為，單峰且A260/A280在1.8-2.0，RNA的純度符合實驗要求。根據(jù)東洋紡 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover說明書，取總RNA1ug逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以相應(yīng)的cDNA為模板，加入相應(yīng)引物，擴(kuò)增目的基因片段，按照Vazyme的ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒說明書，總反應(yīng)體系為20ul。按擴(kuò)增試劑盒參照設(shè)置PCR啟動程序，95℃激活酶活性10min；95℃變性5s；60℃退火，延伸30s，40個循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參，采用2-▲▲Ct計算mRNA相對表達(dá)量。

3.5 免疫印跡法檢測PPARγ和PTEN的表達(dá)

取對數(shù)生長期A549細(xì)胞以1×105個/孔接種于12孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔。分為四組，空白組：人非小細(xì)胞肺癌A549內(nèi)源性表達(dá)；實驗組1：將PPARγ轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞并添加其激動劑9-HODE進(jìn)行檢測；實驗組2：將PTEN轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行檢測；實驗組3：將PPARγ和PTEN轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞并添加其激動劑進(jìn)行檢測；提取蛋白，置于-20℃冰箱保存。配制12%SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠；用聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入一抗（抗PPARγ：1：1000；抗PTEN：1：1000；）4℃孵育過夜，滴加二抗37℃孵育1h，洗膜后，按照1：1配制化學(xué)發(fā)光液，使用化學(xué)發(fā)光儀器進(jìn)行曝光成像。

3.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0進(jìn)行正態(tài)性及方差性檢驗，所有實驗均至少重復(fù)3次，計量數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)滿足正態(tài)性及方差性時，采用單因素方差分析；若不滿足正態(tài)性或方差齊性時，采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。P＜0.01為差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功轉(zhuǎn)染基因PPARγ和PTEN

以下是空白組（圖A），單獨(dú)轉(zhuǎn)染PPARγ組并添加其激動劑（圖B），單獨(dú)轉(zhuǎn)染PTEN組（圖C），同時將兩個基因轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞（圖D）。由圖一可見，與空白組相比，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞沒有明顯細(xì)胞形態(tài)的改變或者大量死亡。

圖1

2.2 實時熒光定量PCR檢測PPARγ和PTEN的表達(dá)

結(jié)果顯示（圖2A），qPCR的三組引物（圖2B），與對照組相比，選取特異性高的β-actin、PPARγ、PTEN的上下游引物，按照東洋紡qPCR RT說明書操作流程檢測PPARγ和PTEN在mRNA水平上的表達(dá)。

圖2(A)

圖2（B）

2.3 免疫印跡法檢測PPARγ和PTEN的表達(dá)

結(jié)果顯示（圖3），與對照組相比，轉(zhuǎn)染PTEN和PPARγ并激活，顯著提高PTEN的表達(dá)，其他各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明在蛋白水平上，PPARγ正向調(diào)控PTEN的表達(dá)。

圖3

3 討論

在當(dāng)今世界，肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤，也是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，是發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一。其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%-85%[4,5]，分為鱗癌和腺癌兩種亞型。雖然NSCLC在放療、化療、手術(shù)治療方面取得了一定臨床進(jìn)展[6,7]，但整體預(yù)后較差，5年生存率不足15%[8]。NSCLC發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過程是多個癌基因和抑癌基因共同參與的多步驟、多階段、多基因改變并且有序的過程。有癌基因的激活、抑癌基因的失活、DNA修復(fù)基因的突變、生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的異常對于肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[9]。

大量前期的研究表明，過氧化物酶體增殖激活受體γ（PPARγ）作為核激素受體PPAR亞家族的成員，包括PPAR-α和PPAR-β。PPAR-γ基因位于3號染色體短臂上，含有9個外顯子。PPAR-γ以γ1、γ2和γ3三種亞型存在。在n端有30個額外的氨基酸。在脂肪細(xì)胞中單獨(dú)存在。PPAR-γ最初被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、胰島素敏感性和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄的重要物質(zhì)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1-3]。

目前人類已發(fā)現(xiàn)了多種原癌基因和抑癌基因，磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）是繼p53后新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑癌基因，PTEN基因定位于染色體10q23.3區(qū)，全長200kb,由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成，mRNA全長5.5kb,其cDNA含有1209個核苷酸組成的開放閱讀框架，編碼由403個氨基酸組成、分子量為47000的蛋白質(zhì)。PTEN蛋白中與抑癌功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)由氨基端（N端）磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域、脂質(zhì)結(jié)合的C2結(jié)構(gòu)域和有50個氨基酸殘基組成的羧基端（C端）結(jié)構(gòu)域這3個區(qū)域共同組成[11]。PTEN被稱為繼p53時代后突變率最高的“腫瘤抑制基因”，作為到目前為止被發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生長及細(xì)胞的黏附等多種途徑發(fā)揮其抑制肺癌發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，成為肺癌研究的新焦點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，雖然，單純轉(zhuǎn)染PTEN組，可以上調(diào)PTEN在蛋白和mRNA的表達(dá)，轉(zhuǎn)染了PPARγ并激活組，與單純轉(zhuǎn)染PTEN組相比較，PTEN在蛋白和mRNA的表達(dá)顯著升高。說明激活后的PPARγ可以后期實驗需要找到基因具體結(jié)合的位點(diǎn)，及PPARγ與PTEN之間的相互作用力。下一步可圍繞這兩點(diǎn)展開深入研究。