玉蘇甫卡迪爾·麥麥提尼加提， 艾麥提·牙森， 李文定， 冉 博，吐爾干艾力·阿吉， 邵英梅， 溫 浩

1 新疆醫(yī)科大學 “省部共建中亞高發(fā)病成因與防治”國家重點實驗室， 烏魯木齊 830011;2 新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 消化血管外科中心肝膽包蟲外科， 烏魯木齊 830054

胚胎肝前體細胞(hepatic progenitor cell，HPC)是胚胎早期從肝臟或性腺中分離出的具有增殖、自我更新和高度多向分化潛能的“萬能”細胞，它除了具備良好的增殖能力和可塑性以外，還能夠向肝細胞和膽管細胞分化[1-3]。在胚胎發(fā)育過程中，位于肝實質的HPC能夠分化成為肝細胞，而位于肝內血管周圍的HPC最終分化為膽管細胞。“巧合”的是從門靜脈周圍區(qū)域到肝實質區(qū)域TGFβ1的表達呈現(xiàn)出明顯梯度下降的變化，即門靜脈周圍區(qū)域TGFβ1表達顯著升高，而肝實質區(qū)域TGFβ1的表達明顯降低[4]，可知，TGFβ1信號通路在調控HPC的分化發(fā)育中起關鍵作用[5-6]。研究[7]顯示，TGFβ1可能通過Notch/Jaggedl信號通路激活肝星狀細胞，后者通過分泌細胞因子和生長因子來促進肝前體細胞的增殖分化。還有研究[8-9]表明，門靜脈周圍間質細胞中的Notch/Jaggedl信號通路通過與其相鄰的肝祖細胞的Notch2受體結合后，激活肝祖細胞內的Notch通路，最終導致肝祖細胞向膽管細胞分化起重要作用。目前為止，HPC分化發(fā)育的具體機制尚未清楚，而且HPC分化趨勢是否與TGFβ1信號通路的調節(jié)作用相關還沒被證實。因此，本實驗中加入外源性的TGFβ1及TGFβ1受體抑制劑SB431542來研究TGFβ1信號對HPC分化的影響，試圖證實TGFβ1信號通路在HPC分化趨勢中的誘導作用及其可能機制，為HPC在臨床實踐中的應用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系 小鼠胚胎肝前體細胞株(HPC-E14.5)購自北京北納公司BNCC細胞庫。

1.2 主要試劑 胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自于Gibco生物技術公司，TGFβ1抑制劑SB431542購自于Tcr公司。小鼠的基因重組TGFβ1蛋白、單克隆AFP、Alb、細胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體均購自于美國santacruz公司。山羊抗小鼠和抗兔IgG二抗由Abcam公司提供。qRT-PCR引物由鑫澤寶信公司合成。預染蛋白Marker、PMSF、蛋白裂解液以及PAS試劑盒均購自于北京中山金橋公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及分組 細胞分為空白對照組(HPC)、HPC+TGFβ1組和HPC+SB431542組。HPC在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 d后進行傳代。首先，在無血清的培養(yǎng)基里將HPC饑餓培養(yǎng),24 h后置換為含1%青霉素-鏈霉素和15% KSR的DMEM培養(yǎng)基。隨后，分別滴加TGFβ1(8 ng/ml)或TGFβ1受體抑制劑SB431542(1 μmol/L)處理72 h。

1.3.2 細胞免疫熒光染色法鑒定HPC細胞系 將各組HPC以4×105的密度接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，加4%多聚甲醛固定0.5 h，然后滴加0.1% Trition試劑進行穿透，隨后，外加山羊血清，封閉1.5 h后滴加一抗(稀釋比例分別是Alb 1∶200，AFP和CK19均為1∶100)，放入濕盒4 ℃孵育過夜。次日，復溫1 h后滴注適量二抗并25 ℃恒溫進行孵育1 h。最后，DAPI染核5 min后在顯微鏡下觀察。

1.3.3 HPC的分化情況檢測

HPC中CK19為膽管細胞標志物，Alb和AFP為成熟肝細胞標志物。用qRT-PCR和蛋白質印跡法檢測加入外源性TGFβ1和TGFβ1受體抑制劑SB431542處理72 h后CK19、Alb、AFP的mRNA和蛋白水平，進而判斷HPC的分化情況。

1.3.3.1 qRT-PCR檢測 使用新鮮Trizole溶液提取總mRNA并將其反轉錄為cDNA(表1)，隨后進行擴增，最后，使用2-△△CT法來計算各組目的基因中的mRNA的含量(實驗重復3次并取其平均值)。

1.3.3.2 蛋白質印跡檢測 首先，提取總蛋白并測定其濃度且將其濃度設定為40 mg/ml。然后，將樣品與上樣緩沖液均勻混合，加熱升溫到100 ℃促使細胞內蛋白變性后進行電泳分離并進行轉膜，恒速搖床上勻搖2～3 h。隨后，滴加一抗(稀釋的濃度分別是AFP 1∶1000、Alb 1∶500、CK19 1∶1000、GAPDH 1∶1000)，4 ℃恒溫冰箱里孵育過夜。次日，滴注二抗并恒溫孵育1 h，經ECL發(fā)光顯影，通過機器計算目的蛋白條帶的灰度值(實驗重復3次并取其平均值)。

1.3.4 PAS法檢測HPC分化后的功能 Dadaci等[10]證實肝臟細胞具有糖原合成和儲存功能，因此本實驗中通過PAS染色檢測HPC分化后的膽管細胞或肝細胞的糖原合成功能。按照糖原染色試劑盒說明書操作步驟，將各組標本接種于6個孔板培養(yǎng)24 h后吸取培養(yǎng)基，用雙蒸水沖洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，加入5%過碘酸席夫試劑室溫染色5 min。加入適量的席夫溶液孵育15 min后，滴加蘇木精2 min對細胞質和細胞外基質進行染色，洗去多余的蘇木精，倒置顯微鏡下觀察并采集圖像，計算糖原染色表達陽性面積比例。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1 細胞免疫熒光染色法結果 顯微鏡下可見肝細胞標志物AFP在細胞質中的表達量很高，Alb和CK19只是少量表達(圖1)，提示該HPC細胞株在體外尚未發(fā)生分化。

2.2 HPC分化情況檢測結果 3組間AFP、Alb、CK19 mRNA和蛋白的表達水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)(表2，圖2)。提示，在外源性TGFβ1的誘導下HPC有著向膽管細胞分化的趨勢，當阻斷TGFβ1信號通路時，HPC能夠向肝細胞分化。

2.3 HPC分化后的糖原合成及儲存功能 HPC組的糖原染色表達陽性面積比例比其余2組低(P<0.05) (表2，圖3)，提示TGFβ1信號通路誘導HPC分化后的膽管細胞和肝細胞具有正常的糖原儲存和合成功能，這些細胞可能能夠參與代謝活動。

圖2WesternBlot法檢測HPC分化后目的蛋白的表達情況

注：a,HPC組；b,HPC+TGFβ1組；c,HPC+SB431542組。

圖3HPC分化后糖原染色表

達情況(×200)

圖1 HPC免疫熒光鑒定結果(×200)

表2 qRT-PCR、Western Blot和 PAS染色定量分析結果

注：與HPC組比較，1)P<0.05。

3 討論

在胚胎肝的發(fā)育中，細胞周圍微環(huán)境中的各種因子在HPC的分化過程中起關鍵作用，并且能夠誘導其定向分化成肝細胞或膽管細胞。相關研究[11]表明，TGFβ1信號通路能夠促進腫瘤細胞的繁殖、分化及轉移，富含有TGFβ1的腫瘤上清液或肝星狀細胞在體外可誘導肝星狀細胞向膽管細胞分化[12-14]。因此，TGFβ1有望成為體外誘導HPC產生大量有功能的肝細胞或膽管細胞，并用于“細胞治療”的一個理想手段。本實驗選用小鼠HPCs-E14.5細胞株，并通過細胞免疫熒光法證實其體外尚未分化，可用于研究其增殖分化特性。TGFβ1重組蛋白和TGFβ1信號通路特異性抑制劑SB431542的作用呈現(xiàn)劑量及時間依賴性，并濃度分別在8 ng/ml、 1 μmol/L和作用時間48～72 h時發(fā)揮其最大的作用[15-16]。因此，筆者使用無血清饑餓培養(yǎng)方式來排除血清中的微量TGFβ1對實驗結果的影響，并以TGFβ1及其抑制劑的最佳濃度刺激HPC，研究TGFβ1信號通路對HPC分化的影響。

結果顯示，加入外源性的TGFβ1培養(yǎng)72 h后，HPC中作為膽管細胞標志物的CK19高表達，而成熟肝細胞標志物Alb和AFP表達量明顯低于其他2組，說明TGFβ1信號可能誘導HPC向膽管細胞分化，而且分化后的細胞具有糖原合成及儲存等功能。此外，通過TGFβ1受體特異性抑制劑SB431542阻斷TGFβ1信號通路后，HPC中Alb表達量顯著增加，而CK19和AFP的表達量明顯降低。在HPC組中AFP的表達量最高，而且僅有少量細胞可合成及儲存糖原，提示該組中HPC仍保持干細胞特性。

因此，以上結果表明TGFβ1信號通路的激活能夠誘導HPC分化為有功能的膽管細胞，而抑制該通路可使HPC向肝細胞方向分化。目前，TGFβ1信號通路在HPC增殖分化中直接作用方面的相關研究尚少，該信號通路具體通過什么途徑影響HPC的分化以及是否與其他信號通路之間存在協(xié)同作用等問題仍需要進一步探索。本實驗中，HPC分化成為具有類似肝臟組織結構和功能的膽管細胞或肝細胞受TGFβ1信號通路的調控，可為后續(xù)的肝膽疾病的細胞治療和基因治療提供可靠、簡便的細胞來源或理論基礎。