玉蘇甫卡迪爾·麥麥提尼加提， 艾麥提·牙森， 李文定， 冉 博，吐爾干艾力·阿吉， 邵英梅， 溫 浩

1 新疆醫(yī)科大學(xué) “省部共建中亞高發(fā)病成因與防治”國家重點實驗室， 烏魯木齊 830011;2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化血管外科中心肝膽包蟲外科， 烏魯木齊 830054

胚胎肝前體細(xì)胞(hepatic progenitor cell，HPC)是胚胎早期從肝臟或性腺中分離出的具有增殖、自我更新和高度多向分化潛能的“萬能”細(xì)胞，它除了具備良好的增殖能力和可塑性以外，還能夠向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化[1-3]。在胚胎發(fā)育過程中，位于肝實質(zhì)的HPC能夠分化成為肝細(xì)胞，而位于肝內(nèi)血管周圍的HPC最終分化為膽管細(xì)胞?！扒珊稀钡氖菑拈T靜脈周圍區(qū)域到肝實質(zhì)區(qū)域TGFβ1的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯梯度下降的變化，即門靜脈周圍區(qū)域TGFβ1表達(dá)顯著升高，而肝實質(zhì)區(qū)域TGFβ1的表達(dá)明顯降低[4]，可知，TGFβ1信號通路在調(diào)控HPC的分化發(fā)育中起關(guān)鍵作用[5-6]。研究[7]顯示，TGFβ1可能通過Notch/Jaggedl信號通路激活肝星狀細(xì)胞，后者通過分泌細(xì)胞因子和生長因子來促進(jìn)肝前體細(xì)胞的增殖分化。還有研究[8-9]表明，門靜脈周圍間質(zhì)細(xì)胞中的Notch/Jaggedl信號通路通過與其相鄰的肝祖細(xì)胞的Notch2受體結(jié)合后，激活肝祖細(xì)胞內(nèi)的Notch通路，最終導(dǎo)致肝祖細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化起重要作用。目前為止，HPC分化發(fā)育的具體機(jī)制尚未清楚，而且HPC分化趨勢是否與TGFβ1信號通路的調(diào)節(jié)作用相關(guān)還沒被證實。因此，本實驗中加入外源性的TGFβ1及TGFβ1受體抑制劑SB431542來研究TGFβ1信號對HPC分化的影響，試圖證實TGFβ1信號通路在HPC分化趨勢中的誘導(dǎo)作用及其可能機(jī)制，為HPC在臨床實踐中的應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 小鼠胚胎肝前體細(xì)胞株(HPC-E14.5)購自北京北納公司BNCC細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自于Gibco生物技術(shù)公司，TGFβ1抑制劑SB431542購自于Tcr公司。小鼠的基因重組TGFβ1蛋白、單克隆AFP、Alb、細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體均購自于美國santacruz公司。山羊抗小鼠和抗兔IgG二抗由Abcam公司提供。qRT-PCR引物由鑫澤寶信公司合成。預(yù)染蛋白Marker、PMSF、蛋白裂解液以及PAS試劑盒均購自于北京中山金橋公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞分為空白對照組(HPC)、HPC+TGFβ1組和HPC+SB431542組。HPC在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行傳代。首先，在無血清的培養(yǎng)基里將HPC饑餓培養(yǎng),24 h后置換為含1%青霉素-鏈霉素和15% KSR的DMEM培養(yǎng)基。隨后，分別滴加TGFβ1(8 ng/ml)或TGFβ1受體抑制劑SB431542(1 μmol/L)處理72 h。

1.3.2 細(xì)胞免疫熒光染色法鑒定HPC細(xì)胞系 將各組HPC以4×105的密度接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，加4%多聚甲醛固定0.5 h，然后滴加0.1% Trition試劑進(jìn)行穿透，隨后，外加山羊血清，封閉1.5 h后滴加一抗(稀釋比例分別是Alb 1∶200，AFP和CK19均為1∶100)，放入濕盒4 ℃孵育過夜。次日，復(fù)溫1 h后滴注適量二抗并25 ℃恒溫進(jìn)行孵育1 h。最后，DAPI染核5 min后在顯微鏡下觀察。

1.3.3 HPC的分化情況檢測

HPC中CK19為膽管細(xì)胞標(biāo)志物，Alb和AFP為成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物。用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測加入外源性TGFβ1和TGFβ1受體抑制劑SB431542處理72 h后CK19、Alb、AFP的mRNA和蛋白水平，進(jìn)而判斷HPC的分化情況。

1.3.3.1 qRT-PCR檢測 使用新鮮Trizole溶液提取總mRNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA(表1)，隨后進(jìn)行擴(kuò)增，最后，使用2-△△CT法來計算各組目的基因中的mRNA的含量(實驗重復(fù)3次并取其平均值)。

1.3.3.2 蛋白質(zhì)印跡檢測 首先，提取總蛋白并測定其濃度且將其濃度設(shè)定為40 mg/ml。然后，將樣品與上樣緩沖液均勻混合，加熱升溫到100 ℃促使細(xì)胞內(nèi)蛋白變性后進(jìn)行電泳分離并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒速搖床上勻搖2～3 h。隨后，滴加一抗(稀釋的濃度分別是AFP 1∶1000、Alb 1∶500、CK19 1∶1000、GAPDH 1∶1000)，4 ℃恒溫冰箱里孵育過夜。次日，滴注二抗并恒溫孵育1 h，經(jīng)ECL發(fā)光顯影，通過機(jī)器計算目的蛋白條帶的灰度值(實驗重復(fù)3次并取其平均值)。

1.3.4 PAS法檢測HPC分化后的功能 Dadaci等[10]證實肝臟細(xì)胞具有糖原合成和儲存功能，因此本實驗中通過PAS染色檢測HPC分化后的膽管細(xì)胞或肝細(xì)胞的糖原合成功能。按照糖原染色試劑盒說明書操作步驟，將各組標(biāo)本接種于6個孔板培養(yǎng)24 h后吸取培養(yǎng)基，用雙蒸水沖洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，加入5%過碘酸席夫試劑室溫染色5 min。加入適量的席夫溶液孵育15 min后，滴加蘇木精2 min對細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行染色，洗去多余的蘇木精，倒置顯微鏡下觀察并采集圖像，計算糖原染色表達(dá)陽性面積比例。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞免疫熒光染色法結(jié)果 顯微鏡下可見肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)量很高，Alb和CK19只是少量表達(dá)(圖1)，提示該HPC細(xì)胞株在體外尚未發(fā)生分化。

2.2 HPC分化情況檢測結(jié)果 3組間AFP、Alb、CK19 mRNA和蛋白的表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)(表2，圖2)。提示，在外源性TGFβ1的誘導(dǎo)下HPC有著向膽管細(xì)胞分化的趨勢，當(dāng)阻斷TGFβ1信號通路時，HPC能夠向肝細(xì)胞分化。

2.3 HPC分化后的糖原合成及儲存功能 HPC組的糖原染色表達(dá)陽性面積比例比其余2組低(P<0.05) (表2，圖3)，提示TGFβ1信號通路誘導(dǎo)HPC分化后的膽管細(xì)胞和肝細(xì)胞具有正常的糖原儲存和合成功能，這些細(xì)胞可能能夠參與代謝活動。

圖2WesternBlot法檢測HPC分化后目的蛋白的表達(dá)情況

注：a,HPC組；b,HPC+TGFβ1組；c,HPC+SB431542組。

圖3HPC分化后糖原染色表

達(dá)情況(×200)

圖1 HPC免疫熒光鑒定結(jié)果(×200)

表2 qRT-PCR、Western Blot和 PAS染色定量分析結(jié)果

注：與HPC組比較，1)P<0.05。

3 討論

在胚胎肝的發(fā)育中，細(xì)胞周圍微環(huán)境中的各種因子在HPC的分化過程中起關(guān)鍵作用，并且能夠誘導(dǎo)其定向分化成肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞。相關(guān)研究[11]表明，TGFβ1信號通路能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的繁殖、分化及轉(zhuǎn)移，富含有TGFβ1的腫瘤上清液或肝星狀細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化[12-14]。因此，TGFβ1有望成為體外誘導(dǎo)HPC產(chǎn)生大量有功能的肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞，并用于“細(xì)胞治療”的一個理想手段。本實驗選用小鼠HPCs-E14.5細(xì)胞株，并通過細(xì)胞免疫熒光法證實其體外尚未分化，可用于研究其增殖分化特性。TGFβ1重組蛋白和TGFβ1信號通路特異性抑制劑SB431542的作用呈現(xiàn)劑量及時間依賴性，并濃度分別在8 ng/ml、 1 μmol/L和作用時間48～72 h時發(fā)揮其最大的作用[15-16]。因此，筆者使用無血清饑餓培養(yǎng)方式來排除血清中的微量TGFβ1對實驗結(jié)果的影響，并以TGFβ1及其抑制劑的最佳濃度刺激HPC，研究TGFβ1信號通路對HPC分化的影響。

結(jié)果顯示，加入外源性的TGFβ1培養(yǎng)72 h后，HPC中作為膽管細(xì)胞標(biāo)志物的CK19高表達(dá)，而成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物Alb和AFP表達(dá)量明顯低于其他2組，說明TGFβ1信號可能誘導(dǎo)HPC向膽管細(xì)胞分化，而且分化后的細(xì)胞具有糖原合成及儲存等功能。此外，通過TGFβ1受體特異性抑制劑SB431542阻斷TGFβ1信號通路后，HPC中Alb表達(dá)量顯著增加，而CK19和AFP的表達(dá)量明顯降低。在HPC組中AFP的表達(dá)量最高，而且僅有少量細(xì)胞可合成及儲存糖原，提示該組中HPC仍保持干細(xì)胞特性。

因此，以上結(jié)果表明TGFβ1信號通路的激活能夠誘導(dǎo)HPC分化為有功能的膽管細(xì)胞，而抑制該通路可使HPC向肝細(xì)胞方向分化。目前，TGFβ1信號通路在HPC增殖分化中直接作用方面的相關(guān)研究尚少，該信號通路具體通過什么途徑影響HPC的分化以及是否與其他信號通路之間存在協(xié)同作用等問題仍需要進(jìn)一步探索。本實驗中，HPC分化成為具有類似肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能的膽管細(xì)胞或肝細(xì)胞受TGFβ1信號通路的調(diào)控，可為后續(xù)的肝膽疾病的細(xì)胞治療和基因治療提供可靠、簡便的細(xì)胞來源或理論基礎(chǔ)。