韓志偉， 王宗玉， 鞠佳霓， 李科志， 鄔國(guó)斌， 林棟毅， 陳 闖

1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院， 南寧 530021； 2 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院， 廣州 510030

原發(fā)性肝癌中，肝細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的類型，在世界范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌是第六大最常見(jiàn)的惡性腫瘤和第三大最常見(jiàn)的癌癥死亡原因[1]，肝癌復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅人類健康?，F(xiàn)階段肝癌治療方法以手術(shù)切除腫瘤、介入治療、全身治療和化療為主[2]。對(duì)于晚期多處轉(zhuǎn)移的患者多采用放射治療和化學(xué)藥物治療。然而耐藥性和不良反應(yīng)限制了化學(xué)藥物的應(yīng)用。中藥具有整體性、多靶點(diǎn)和相互協(xié)同的干預(yù)作用, 對(duì)慢性復(fù)雜性疾病具有改善預(yù)后、不良反應(yīng)輕等優(yōu)勢(shì)，成為治療肝癌的理想候選藥物[3]。

健脾消積方由太子參、黃芪、白花蛇舌草、太子參等中藥組成[4]。臨床上主要用于“肝郁脾虛”證肝癌患者的防治，具有穩(wěn)定瘤體、延長(zhǎng)生存時(shí)間、改善患者生存質(zhì)量等作用，是體現(xiàn)“健脾理氣”法防治肝癌的方劑之一[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該方對(duì)肝癌細(xì)胞有較明顯的增殖抑制作用[6]，其機(jī)制尚不明確。

細(xì)胞自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，起著促進(jìn)和抑制的雙重作用[7]。中藥通過(guò)整體和局部作用調(diào)控機(jī)體內(nèi)環(huán)境，這與自噬維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過(guò)程相似[8]。本文將觀察健脾消積方水提物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721的增殖、凋亡及自噬的影響，檢測(cè)自噬流和自噬相關(guān)蛋白的變化，為探討該方對(duì)自噬的調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究方案經(jīng)過(guò)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：LW2019059)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 胎牛血清FBS(?？寺?；DMEM(康寧)；CellTiter-Glo(普洛麥格)；LC3A/B抗體、Beclin1抗體和P62抗體(CST公司)；Agilent RNA 6000 Nano Kit、Trizol試劑盒(吉?jiǎng)P基因)；TB Green Premix Ex TapⅡ (TAKARA公司)；PrimeScriptTM RT reagent Kit(TAKARA公司)；抗兔、抗鼠抗體(賽默飛)；過(guò)表達(dá)SensGFP-StubRFP-LC3的自噬檢測(cè)慢病毒(吉?jiǎng)P基因)。

1.1.2 主要儀器 熒光顯微鏡(奧林巴斯)；倒置顯微鏡(上海蔡康)；共聚焦顯微鏡(日本橫河)；Thremo Nanodrop 2000 (賽默飛) ；Agilent 2100 (安捷倫) ；Nanodrop 2000(賽默飛)。

1.1.3 復(fù)方凍干粉制作 健脾消積方的中藥藥材均購(gòu)自廣西仙茱中藥科技有限公司。采用“正交法”提取該方的水提物，再作成凍干藥粉，對(duì)該方的提取物有較好的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，以便能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行重復(fù)。每克健脾消積方凍干粉含生藥 8.37 g。取制備好的凍干粉用DMEM培養(yǎng)基配置含藥培養(yǎng)液，37 ℃水浴鍋溶解，離心后用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，分裝,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株SMMC7721由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。將人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，1～2 d換液1次，2～3 d用0.25%胰酶消化后傳代。

1.2 CCK-8法測(cè)定SMMC7721細(xì)胞增殖情況 將SMMC7721細(xì)胞接種于96孔板，每孔約3000個(gè)細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。取適量含藥培養(yǎng)液稀釋，按測(cè)得IC50的濃度配制備用。取1500 μg/ml的含藥培養(yǎng)液按照每孔100 μl作用于肝癌SMMC7721細(xì)胞，另設(shè)空白對(duì)照組。加藥后24～96 h(每24 h換藥1次)后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。培養(yǎng)終止前每孔加10 μl CCK-8溶液，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度值，計(jì)算增殖倍數(shù)。

1.3 流式細(xì)胞學(xué)測(cè)定SMMC-7721細(xì)胞的凋亡 取SMMC-7721 細(xì)胞，給予終濃度為1500 μg/ml的含藥培養(yǎng)液，對(duì)照組加相同體積的培養(yǎng)基；于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測(cè)第5天的凋亡率。細(xì)胞消化洗滌后，加入 1×binding buffer 洗滌細(xì)胞沉淀1次，再加入200 μl 1×binding buffer 重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到2 ml EP管中。充分混勻后，分別加入10 μlAnnexin V-APC 染色和5 μl Propidium Iodide并混勻，最后以濾網(wǎng)過(guò)濾各組樣品，并轉(zhuǎn)至新的流式管內(nèi)，避光反應(yīng)半小時(shí)后，15 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。使用流式細(xì)胞儀分析軟件Guava InCyte進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4 Western Blot檢測(cè)Beclin1、 LC3和p62蛋白的表達(dá) 取適量含藥培養(yǎng)液按1500 μg/ml、2100 μg/ml的濃度稀釋，設(shè)對(duì)照組。細(xì)胞加藥處理48 h，收集細(xì)胞懸液，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。各孔加入20 μg 蛋白樣品，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜，50 g/L脫脂奶粉封閉 2 h。4 ℃孵育Beclin1、LC3、p62抗體過(guò)夜。次日室溫孵育二抗 1 h后用TBST 洗滌3次，用化學(xué)發(fā)光法顯影曝光，圖片經(jīng) Image lab 軟件分析灰度值。

1.5 SensGFP-StubRFP-LC3慢病毒轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞檢測(cè)自噬流 將構(gòu)建好的SensGFP-StubRFP-LC3慢病毒轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后,連續(xù)3 d使用嘌呤霉素(2 μg/ml)篩選未感染細(xì)胞并清除。之后將細(xì)胞接種至96孔板中(4000個(gè)/孔，每組3復(fù)孔)。次日待細(xì)胞貼壁后，加入適量1500 μg/ml的含藥培養(yǎng)液，另設(shè)空白對(duì)照組。待藥物干預(yù)細(xì)胞48 h后，加入Hochest對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，并立即置于CQ1中使用SensGFP、StubRFP和Hochest三通道進(jìn)行掃板，采用CQ1的“two colour dots in cellbody”模式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 健脾消積方水提物抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖

健脾消積方水提物干預(yù)SMMC7721細(xì)胞達(dá)到半數(shù)抑制的濃度約為1500 μg/ml，分別干預(yù)肝癌SMMC7721細(xì)胞24 h、48 h、72 h、96 h后，結(jié)果顯示，健脾消積方水提物抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖，加藥干預(yù)后不同時(shí)間細(xì)胞增殖倍數(shù)與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)(表1)。

2.2 健脾消積方顯著促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞的凋亡 與對(duì)照組(1.74%±0.07%)相比，加藥組細(xì)胞的凋亡(14.83%±0.53%)明顯升高，活細(xì)胞比率明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-42.629，P<0.001)。

2.3 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 健脾消積方水提物對(duì)SMMC7721細(xì)胞增殖的影響

圖1各組肝癌SMMC7721細(xì)胞Beclin1、LC3和p62蛋白表達(dá)的電泳圖

加藥組Beclin1的表達(dá)明顯下調(diào)，Beclin1作用于自噬的上游，對(duì)調(diào)控自噬具有重要作用，Beclin1的下調(diào)表明細(xì)胞的自噬過(guò)程可能受到了抑制。LC3I變化趨勢(shì)不明顯，LC3Ⅱ的表達(dá)隨劑量增加而升高，并且LC3Ⅱ的表達(dá)明顯高于同一樣品LC3I水平，提示加藥組細(xì)胞可能促進(jìn)LC3I向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化。LC3Ⅱ由LC3I酯化后形成并聚集在自噬體膜上，其含量與自噬體的數(shù)量成正比，是自噬體生成的標(biāo)志性蛋白[9]。因此，LC3Ⅱ表達(dá)量的提高提示自噬小體增多[10]，提示健脾消積方水提物促進(jìn)了SMMC7721細(xì)胞自噬體的生成。不同濃度健脾消積方水提物培養(yǎng)液組p62基因的蛋白表達(dá)量與溶劑對(duì)照組相比有所上升。p62是自噬體降解的底物之一，p62經(jīng)過(guò)泛素化蛋白修飾后與自噬體結(jié)合形成自噬流[11-12]，并在自噬體和溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體后被降解清除[13-14]。本研究中p62蛋白表達(dá)水平增高提示健脾消積方可能阻滯了SMMC7721細(xì)胞的自噬流。

2.4 健脾消積方水提物SMMC7721細(xì)胞自噬流的檢測(cè)

隨著自噬的發(fā)生，LC3帶動(dòng)SensGFP和StubRFP熒光蛋白聚集在自噬相關(guān)的雙層膜結(jié)構(gòu)中，并在共聚焦顯微鏡下形成熒光點(diǎn)。在自噬體對(duì)應(yīng)的熒光點(diǎn)中，SensGFP和StubRFP各自發(fā)出綠色和紅色的熒光。在自噬溶酶體對(duì)應(yīng)的熒光點(diǎn)中，雖然SensGFP、StubRFP和LC3均存在，但由于SensGFP在酸性環(huán)境中熒光易淬滅，因此僅存在StubRFP發(fā)出的紅色熒光[15-17]。細(xì)胞中紅色熒光點(diǎn)的數(shù)目代表自噬體和自噬溶酶體的總數(shù)量，綠色熒光點(diǎn)的數(shù)目代表自噬體的數(shù)量，兩者的相對(duì)數(shù)量代表自噬流從自噬體到自噬溶酶體的流動(dòng)速度。與對(duì)照組相比，加藥組(1500 μg/ml和2100 μg/ml組)的紅色熒光點(diǎn)和綠色熒光點(diǎn)明顯增多(P值均<0.05)。合并圖像中，黃斑點(diǎn)均顯著增加，呈現(xiàn)紅色的自由紅色斑點(diǎn)減少 (圖2)。相比對(duì)照組組，兩個(gè)加藥干預(yù)組紅色熒光/綠色熒光相對(duì)值顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)(表2)。提示健脾消積方藥物可能抑制了自噬體向自噬溶酶體的流動(dòng)。

圖2 健脾消積方水提物干預(yù)SMMC7721細(xì)胞自噬流檢測(cè)的熒光圖像

表2 不同處理組紅色熒光/綠色熒光相對(duì)表達(dá)量

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.001。

3 討論

眾多研究表明，中草藥及其有效成分具有調(diào)控細(xì)胞自噬水平的抗腫瘤作用，包括通過(guò)自噬誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥[18]、調(diào)節(jié)腫瘤免疫發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[19-20]。為了探究健脾消積方水提物對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞自噬的影響,本研究檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3和p62的表達(dá)。

健脾消積方水提物干預(yù)細(xì)胞后，Beclin1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，表明細(xì)胞自噬過(guò)程受到了抑制。Beclin1是Bcl-2的同源蛋白，是上游的自噬啟動(dòng)蛋白，和Bcl-2具有相同的BH3結(jié)構(gòu)域，Beclin1不僅可以調(diào)控自噬，還可能通過(guò)Bcl-2發(fā)揮調(diào)控凋亡的效應(yīng)[21]。LC3是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白，在自噬過(guò)程中，胞漿型LC3Ⅰ會(huì)被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系所修飾和加工，產(chǎn)生膜型 LC3Ⅱ[22]。LC3Ⅱ是檢測(cè)自噬泡形成的特異性標(biāo)志性蛋白，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值變化可以評(píng)價(jià)自噬體的形成[23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，健脾消積方水提物處理肝癌SMMC7721細(xì)胞，加藥組自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ表達(dá)明顯增加，提示健脾消積方水提物可誘導(dǎo)LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ，即自噬體生成增多。p62是檢測(cè)自噬流活性的標(biāo)志性蛋白之一，用來(lái)評(píng)價(jià)自噬和自噬流的強(qiáng)弱。細(xì)胞自噬過(guò)程依賴于溶酶體的功能，p62結(jié)合泛素化蛋白進(jìn)入到自噬體后最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而得到清除[5]。本研究中給藥組p62表達(dá)上調(diào)，提示健脾消積方水提物可能抑制了自噬體與溶酶體的結(jié)合，阻礙肝癌SMMC7721細(xì)胞自噬體的降解和清除。為了分別評(píng)估自噬體和自噬溶酶體積累的程度，研究中給細(xì)胞轉(zhuǎn)染了包含串聯(lián)熒光SensGFP-StubRFP-LC3的腺病毒來(lái)檢測(cè)自噬流。檢測(cè)結(jié)果顯示48 h后，相比對(duì)照組，加藥組紅色熒光和綠色熒光相對(duì)數(shù)量下降，即自噬溶酶體減少。證實(shí)了健脾消積方水提物阻滯了自噬體向自噬溶酶體的流動(dòng)。自噬體無(wú)法降解導(dǎo)致了自噬體的堆積，而細(xì)胞內(nèi)自噬體的大量堆積最終導(dǎo)致了肝癌SMMC7721細(xì)胞的死亡。關(guān)于健脾消積方在自噬上游通路如何誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬，調(diào)控細(xì)胞自噬性死亡，發(fā)揮抗癌效應(yīng)還需進(jìn)一步探索。

綜上，健脾消積方水提物能夠使肝癌SMMC7721細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào)，LC3Ⅱ和p62表達(dá)下調(diào)，同時(shí)阻滯自噬流。其抗肝癌機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)自噬體生成，抑制自噬體溶解，從而使細(xì)胞內(nèi)自噬體大量堆積而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。