常江，張玲，代正云，夏效東，楊華，唐標*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江 杭州 310021； 2.西北農(nóng)林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；3.湖南科技學院 化學與生物工程學院，湖南 永州 425100)

空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)是一種重要的人畜共患病原菌，能夠引起綿羊流產(chǎn)、小牛發(fā)熱和腹瀉、牛乳房炎、禽類肝炎等癥狀[1]，同時也可引起人的急性腸炎和格林-巴利綜合征等疾病[2]?？漳c彎曲桿菌的傳播流行不僅嚴重影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，也對人類健康造成極大危害?？漳c彎曲桿菌在自然界中分布廣泛，家禽(尤其是雞)是其主要的貯存庫和傳染源，在空腸彎曲桿菌的傳播擴散中發(fā)揮重要作用[3]。根據(jù)歐洲食品安全局(EFSA)的相關(guān)報道，50%～80%的彎曲桿菌感染源于雞和雞肉產(chǎn)品，與此同時，空腸彎曲桿菌是造成人類彎曲桿菌感染的主要原因，占所有感染病例的80%～90%[4-5]。近年來，畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中抗生素的大量使用，引發(fā)了嚴重的空腸彎曲桿菌耐藥性，極大地增加了空腸彎曲桿菌疾病預防和控制的難度，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴峻挑戰(zhàn)[6]。因此，補充完善雞場空腸彎曲桿菌的流行病學資料和耐藥數(shù)據(jù)庫，有助于空腸彎曲桿菌疾病的防治和養(yǎng)殖場抗生素的科學使用，對提高養(yǎng)殖效益和維護公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

隨著寧德地區(qū)雞養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，空腸彎曲桿菌傳播感染趨于增多，對養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展造成嚴重影響，也構(gòu)成了一定的公共衛(wèi)生安全隱患。本研究對寧德地區(qū)雞場空腸彎曲桿菌的流行狀況進行調(diào)查，利用MLST技術(shù)分析空腸彎曲桿菌的種群特征，同時對分離得到的空腸彎曲桿菌進行耐藥性檢測，為預防和控制雞場空腸彎曲桿菌，特別是多重耐藥空腸彎曲桿菌的傳播流行提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2018年9月，在福建省寧德地區(qū)的部分雞場隨機采集100份新鮮糞便樣品。樣品采集用試劑、器具、耗材等均經(jīng)過高溫高壓滅菌，或為一次性無菌材料。使用無菌棉簽挑取適量雞糞便樣品于彎曲桿菌采集液中，放置于裝有微需氧袋的密封盒，保存于低溫采樣箱中，隨后運送至實驗室進行空腸彎曲桿菌分離鑒定。

1.2 主要試劑

Bolton肉湯及添加劑、布氏肉湯、改良CCD瓊脂基礎(chǔ)(mCCDA)購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；彎曲桿菌增菌液、哥倫比亞血平板、微需氧產(chǎn)氣袋購自山東青島中創(chuàng)生物有限公司；無菌脫纖維綿馬血購自南京便診生物科技有限公司；甘油購自上海生工生物工程股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；2×TaqMaster Mix、GenGreen核酸染料、DL5000 Marker購自上海賽默飛世爾科技有限公司；彎曲桿菌藥敏檢測板購自天津金章科技發(fā)展有限公司；空腸彎曲桿菌ATCC33560作為藥敏實驗質(zhì)控菌株，購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)。

1.3 方法

1.3.1 空腸彎曲桿菌分離培養(yǎng)

吸取1 mL空腸彎曲桿菌采集液加入Bolton肉湯中，微需氧條件(5% O2、15% CO2、85% N2)下42 ℃培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)后的Bolton肉湯輕微搖勻后，吸取20～30 μL于mCCDA平板上，使用10 μL接種環(huán)分四區(qū)劃線，隨后在微需氧條件下42 ℃培養(yǎng)24～48 h。使用1 μL接種環(huán)挑取3～5個mCCDA平板上的淺灰色、扁平、濕潤的可疑菌落劃線于哥倫比亞血平板上，微需氧條件下42 ℃培養(yǎng)24 h后，使用1 μL接種環(huán)挑取扁平、濕潤、白色的疑似單菌落劃線于哥倫比亞血平板上進行進一步純化，微需氧條件下培養(yǎng)24 h后，使用10 μL接種環(huán)或無菌棉簽刮取菌落，隨后轉(zhuǎn)移至含20%甘油的布氏肉湯(含5%反復凍融的無菌脫纖維馬血)的凍存管中，-80 ℃條件下保藏。

1.3.2 空腸彎曲桿菌多重PCR鑒定

將疑似空腸彎曲桿菌劃線接種于哥倫比亞血平板上，42 ℃微需氧條件下培養(yǎng)24 h，從哥倫比亞血平板上刮取少許菌落于150 μL的TE緩沖液(pH 8.0)中，渦旋混勻，參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取，將提取完成的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考相關(guān)文獻[7-8]，由杭州擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成針對彎曲桿菌屬16S rRNA及空腸彎曲桿菌mapA基因的特異性鑒定引物(表1)。PCR反應體系為50 μL：2×EasyTaqPCR Mix 25 μL、上下游引物各為1.5 μL、DNA模板為0.5 μL、無菌水為21.5 μL。PCR反應條件為：96 ℃ 5 min；96 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。電泳條件：吸取PCR產(chǎn)物3 μL上樣，使用1.2%瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓下電泳35～40 min。電泳結(jié)束后使用凝膠成像儀進行凝膠成像，根據(jù)條帶有無及大小判斷鑒定結(jié)果。

表1 PCR引物的序列和長度

1.3.3 空腸彎曲桿菌MLST分型

參考Dingle等[9]的報道，使用空腸彎曲桿菌基因組上的7個管家基因(aspA、glnA、gltA、glyA、tkt、pgm、uncA)作為目的基因，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物寄至上海生工生物工程有限公司進行DNA測序。隨后將測序得到的DNA序列在線提交至MLST 2.0(https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/)[10]進行序列比對分析，獲得空腸彎曲桿菌的等位基因型及序列型。

1.3.4 空腸彎曲桿菌藥敏試驗

參照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法，使用天津金章科技發(fā)展有限公司的彎曲桿菌藥敏檢測板測定空腸彎曲桿菌分離株對慶大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、環(huán)丙沙星(CIP)、紅霉素(ERY)、阿奇霉素(AZI)、四環(huán)素(TET)、氟苯尼考(FLO)、克林霉素(CLI)、泰利霉素(TEL)等9種常見抗生素的藥敏特性，質(zhì)控菌株為空腸彎曲桿菌ATCC33560，藥敏結(jié)果判讀參考CLSI制定的相關(guān)藥敏標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 空腸彎曲桿菌的分離鑒定

從采集的100份樣品中，分離得到疑似空腸彎曲桿菌23株，分離率為23%?？漳c彎曲桿菌多重PCR鑒定結(jié)果顯示，所有疑似空腸彎曲桿菌均可擴增出2個條帶，條帶明亮，大小相符，呈現(xiàn)陽性(圖1)。

M—5 000 bp DN A marker；1—空腸彎曲桿菌ATCC33560；2～13—分離菌株；14—陰性對照。圖1 空腸彎曲桿菌多重PCR電泳圖

2.2 空腸彎曲桿菌MLST分型結(jié)果

23株空腸彎曲桿菌共分為了14個序列型。如表2所示，優(yōu)勢序列型為ST354(17.4%)，其次為ST464(13.0%)，空腸彎曲桿菌在寧德地區(qū)雞場中具有豐富的遺傳多樣性。

表2 23株空腸彎曲桿菌的序列型分布及等位基因譜

2.3 空腸彎曲桿菌藥敏特性

對23株空腸彎曲桿菌進行9種常見抗生素的耐藥性檢測，藥敏檢測結(jié)果見圖2。23株空腸彎曲桿菌對萘啶酸(91.3%)、四環(huán)素(91.3%)和環(huán)丙沙星(87.0%)的耐藥率最高，其次為慶大霉素(8.7%)、氟苯尼考(8.7%)、紅霉素(4.4%)，對泰利霉素、阿奇霉素和克林霉素表現(xiàn)為敏感。

圖2 23株空腸彎曲桿菌對不同抗生素的耐藥率

如表3所示，在23株空腸彎曲桿菌分離株中，所有菌株均表現(xiàn)出至少1種耐藥表型，耐藥菌株占比為100%；5株分離株對1～2種抗生素耐藥；其他18株則表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象(至少耐3種及3種以上抗生素)，多重耐藥率為78.3%。菌株耐藥模式多樣，主要的耐藥表型為NAL+CIP+TET，占比為60.9%。

表3 23株空腸彎曲桿菌的耐藥譜

注：GEN—慶大霉素；NAL—萘啶酸；CIP—環(huán)丙沙星；ERY—紅霉素；AZI—阿奇霉素；TET—四環(huán)素；FLO—氟苯尼考；CLI—克林霉素；TEL—泰利霉素。

3 討論

MLST分型是一種重要的流行病學調(diào)查研究手段，相較于傳統(tǒng)的生化手段，能夠更快速地分析種群的結(jié)構(gòu)及生物進化關(guān)系[11]。姚學萍等[12]對四川部分地區(qū)分離的48株禽源空腸彎曲桿菌進行MLST分型，結(jié)果顯示，48株空腸彎曲桿菌共獲得24種不同的序列型；董俊等[13]對47株禽源空腸彎曲桿菌湖北分離株進行分子分型研究，結(jié)果顯示，分離株共包含38個ST型存在；本研究分離自養(yǎng)雞場糞便樣品的23株空腸彎曲桿菌中，共檢測到14種序列型存在，以上結(jié)果表明禽源空腸彎曲桿菌具有較高的遺傳多樣性。沙門菌等其他菌常具有明顯的優(yōu)勢ST型[14]。本研究及其他相關(guān)報道中，各ST型的空腸彎曲桿菌數(shù)量相對接近，沒有明顯的優(yōu)勢ST型，反映出禽源空腸彎曲桿菌流行傳播的復雜性，也進一步顯示空腸彎曲桿菌預防和控制的難度。

本研究檢測到的14種序列型中，包含7種新序列型，新序列型菌株占比為43.5%。新序列型菌株的數(shù)量較大可能是由于MLST數(shù)據(jù)庫中空腸彎曲桿菌的數(shù)據(jù)量仍較少。此前MLST數(shù)據(jù)庫中的空腸彎曲桿菌樣本來源主要是歐美及大洋洲國家，亞洲地區(qū)國家的數(shù)據(jù)量相對較少[13]。本研究的相關(guān)結(jié)果進一步豐富了MLST數(shù)據(jù)庫，也為研究不同區(qū)域的空腸彎曲桿菌流行病學提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

近年來，抗生素的大量使用導致彎曲桿菌耐藥性顯著增強，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成重大威脅[15-16]。2017年，世界衛(wèi)生組織將氟喹諾酮耐藥空腸彎曲桿菌列為優(yōu)先2級(高度耐藥)[17]，顯示出該型耐藥細菌流行傳播的高風險性。本研究中，23株空腸彎曲桿菌對萘啶酸、四環(huán)素和環(huán)丙沙星的耐藥率分別高達91.3%、91.3%及87.0%，表現(xiàn)出對四環(huán)素和喹諾酮類(萘啶酸、環(huán)丙沙星)抗生素的高度耐藥。高風險耐藥空腸彎曲桿菌在雞場的流行傳播不僅會影響雞養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，也在一定程度上對人類健康構(gòu)成潛在威脅。

本研究中，所有受試空腸彎曲桿菌菌株均表現(xiàn)出至少1種耐藥表型，同時78.3%的菌株表現(xiàn)多重耐藥，且耐藥譜呈現(xiàn)多樣化，反映了雞場空腸彎曲桿菌嚴重的耐藥狀況。細菌染色體基因組及質(zhì)粒攜帶的獲得性耐藥基因是引起細菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因[18]。寧德地區(qū)雞場空腸彎曲桿菌嚴重且復雜的耐藥特征表明，雞場來源空腸彎曲桿菌可能攜帶多個耐藥基因，空腸彎曲桿菌攜帶的耐藥基因通過水平傳播及垂直傳播等方式發(fā)生廣泛的傳播擴散，將使得細菌耐藥性問題得到持續(xù)的發(fā)展，危害公共衛(wèi)生健康[19]。為更加有效地了解和控制養(yǎng)雞場來源空腸彎曲桿菌耐藥性的產(chǎn)生及傳播，未來將使用PCR技術(shù)及全基因組測序技術(shù)對空腸彎曲桿菌攜帶耐藥基因的傳播轉(zhuǎn)移機制進行進一步的探究。

本研究以福建省寧德地區(qū)雞場來源空腸彎曲桿菌為研究對象，對其ST型分布和藥敏特性進行了探究，揭示了寧德地區(qū)養(yǎng)雞場中空腸彎曲桿菌的流行狀況和耐藥特征，為防控空腸彎曲桿菌特別是多重耐藥空腸彎曲桿菌的傳播流行提供依據(jù)。研究結(jié)果顯示，寧德地區(qū)雞場來源空腸彎曲桿菌的遺傳多樣性較高，且對四環(huán)素及喹諾酮類抗生素具有較高的耐藥水平，對雞養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和人類健康造成潛在威脅。寧德地區(qū)乃至更廣泛的地區(qū)應繼續(xù)加強動物源細菌耐藥性監(jiān)測，并在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)規(guī)范、減量化使用抗生素，防范公共安全風險。