郭林芝,王曉暉,岳 丹,杜圣家,李靈敏*

(1山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院形態(tài)學實驗室,太原 030001;2山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學教研室;*通訊作者,E-mail:13835125305@163.com)

脂肪組織是機體重要的能量倉庫,其廣泛存在于全身的皮下及內臟各處。在哺乳動物體內,脂肪組織包括白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)。近年來,人們越來越重視對脂肪組織的研究,如研究白色脂肪棕色化的機制、探究降糖藥物使體重減輕的原理等[1,2],許多研究都需要以良好的脂肪組織石蠟切片為基礎。無論是白色脂肪還是棕色脂肪細胞內都含有脂滴,而脂滴的主要成分為三酰甘油酯,由于其成分的特殊性,采用常規(guī)組織的脫水流程恐難達到良好的制片效果。為了制出滿意的脂肪組織石蠟切片,本實驗用兩種脫水流程比較白色脂肪組織和棕色脂肪組織石蠟切片制作效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性BALB/c小鼠8只,清潔級,體質量22-25 g,購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(晉)2015-0001]。

1.2 主要試劑及儀器

蘇木素染液、伊紅染液購自珠海貝索公司;飽和油紅O染色液購自索萊寶生物科技有限公司;Rabbit Anti-GLP-1R antibody購自北京博奧森生物技術有限公司;山羊抗兔IgG/HRP聚合物,購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Leica TP1020自動脫水機;Leica RM2245型半自動旋轉式切片機;Leica CM1950冰凍切片機。

1.3 脂肪組織采集及處理流程

頸椎脫臼法處死小鼠6只,每只鼠分別取雙側睪丸脂肪墊的白色脂肪組織標本2塊和雙側肩胛間區(qū)的棕色脂肪組織標本2塊,大小為(0.5-1.5)cm×(0.5-1.5)cm×(0.2-0.3)cm,將每只鼠的兩種脂肪組織均隨機等分為對照組和實驗組。所有標本均用10%的中性甲醛浸泡固定24 h。其中,對照組標本采用常規(guī)組織脫水程序進行,實驗組標本采用延長脫水程序進行(見表1)。后續(xù)透明及浸蠟過程兩組均按常規(guī)時間進行。處理后的脂肪組織標本用Leica石蠟包埋機包埋。

表1 組織脫水程序比較

Table 1 Comparison of tissue dehydration procedures

組別70%乙醇80%乙醇90%乙醇95%乙醇95%乙醇Ⅱ100%乙醇100%乙醇Ⅱ對照組2h2h1h1h1h30min30min實驗組4h3h2h2h2h1h1h

1.4 切片、展片及烤片

制作好的石蠟塊用Leica RM2245型半自動旋轉式切片機進行切片，切片厚度4 μm。在水溫42 ℃進行展片，60 ℃烤片30 min-1 h。

1.5 HE染色及免疫組化染色

脂肪組織HE染色按常規(guī)組織HE染色流程進行。免疫組化:切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2室溫孵育10 min,枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)高壓修復2 min,晾至室溫,10%BSA室溫封閉20 min,滴加GLP-1R抗體(1 ∶200),4 ℃冰箱過夜。滴加二抗37 ℃ 40 min,DAB顯色,蘇木精復染,常規(guī)脫水、透明、封片,陽性表達部位在細胞膜。

1.6 兩種脂肪組織油紅O染色

頸椎脫臼法處死2只實驗小鼠,取兩種脂肪組織按照文獻置于10%中性甲醛內固定24 h,擦干水分后凍于-80 ℃冰箱30 min,OCT包埋后置冰凍切片機切片,厚度為10 μm[3]。油紅O染色:冰凍切片蒸餾水洗滌;60%異丙醇浸洗;油紅O染色10 min;60%異丙醇分化至間質清楚;蘇木素復染;甘油明膠封片。

2 結果

2.1 白色脂肪組織的兩種脫水流程HE染色結果

延長程序組脂肪組織經HE染色,鏡下觀,脂肪組織無裂縫,細胞排列緊密,形態(tài)飽滿,呈多邊形空泡狀,胞核呈扁平,清晰可見,胞膜無明顯斷裂、松散(見圖1A、B)。

常規(guī)程序組脂肪組織HE染色,鏡下可見脂肪組織形態(tài)基本完整,局部可見裂縫,細胞排列緊密,但形態(tài)欠飽滿,胞核扁圓形,清晰可見,部分細胞膜有斷裂,松散(見圖1C、D)。

A.延長程序(×100);B.延長程序(×400);C.常規(guī)程序(×100);D.常規(guī)程序(×400)圖1 白色脂肪組織HE染色Figure 1 HE staining of white adipose tissue

2.2 棕色脂肪組織的兩種脫水流程HE染色結果

兩種程序處理的棕色脂肪組織經HE染色,鏡下可見脂肪組織形態(tài)完整、無裂縫,細胞排列緊密,脂肪細胞內可見許多小空泡,細胞周圍血管清晰可辨,兩種程序HE染色無明顯差異(見圖2)。

A.延長程序(×100);B.延長程序(×400);C.常規(guī)程序(×100);D.常規(guī)程序(×400)圖2 棕色脂肪組織HE染色Figure 2 HE staining of brown adipose tissue

2.3 兩種脂肪組織石蠟切片免疫組化染色

在石蠟切片HE染色的基礎上,我們分別選取白色脂肪組織延長程序和棕色脂肪組織常規(guī)程序進行免疫組化染色。結果顯示,兩種脂肪組織在免疫組化染色過程中均未見明顯脫片,鏡下可見白色脂肪組織(見圖3A)和棕色脂肪組織(見圖3B)結構完整,細胞形態(tài)飽滿,胞膜完整,陽性表達明顯,背景清晰。

A.白色脂肪(×400) B.棕色脂肪(×400)圖3 脂肪組織GLP-1免疫組化染色Figure 3 GLP-1 immunohistochemical staining of adipose tissue

2.4 兩種脂肪組織冰凍切片油紅O染色

兩種脂肪組織油紅O染色結果顯示,白色脂肪組織細胞內可見較大的單個紅染的脂滴(見圖4A),而棕色脂肪組織細胞內可見多個大小不等的紅染脂滴(見圖4B)。

3 討論

脂肪組織主要由不同性質的脂肪細胞組成,按照脂肪細胞的種類及功能的不同,將其分為白色脂肪組織(WAT)和棕色脂肪組織(BAT)[4]。WAT的功能主要是將機體中過剩的能量以中性脂肪的形式貯存,以供機體需求時利用[5]。此外,WAT還可作為熱絕緣體,有助于維持體溫平衡[6]。BAT由于血管豐富呈棕色,主要維持機體體溫和調控能量平衡[7]。兩種脂肪細胞功能的不同主要源于其細胞組成不同。白色脂肪細胞內含有一個較大的脂滴,幾乎占據了整個細胞(見圖4A),線粒體含量卻很少;而棕色脂肪細胞內雖然也含有脂滴,但是脂滴較小(見圖4B),且多嵴線粒體和胞質含量豐富[8]。雖然都是脂肪組織,但由于兩種脂肪細胞結構的差異,導致組織處理的脫水流程也會有差異。

A.白色脂肪(×400) B.棕色脂肪(×400)圖4 脂肪組織油紅O染色Figure 4 Oil red O staining of adipose tissue

白色脂肪的脂滴大且含量多,若按照常規(guī)脫水流程進行,會出現(xiàn)脫水、脫脂不徹底,石蠟不能完全進入到組織細胞內起到支撐作用,組織便會塌陷,難以切出完整切片。乙醇是實驗室常用的脫水、脫脂試劑,乙醇分子中的極性基團羥基(-OH)可以與組織細胞內的水形成氫鍵將水置換出來從而起到脫水作用;而乙醇又可以與脂滴中的三酰甘油酯發(fā)生醇解反應從而起到脫脂作用。所以,必須延長白色脂肪在乙醇脫水、脫脂的時間。本實驗結果證實,延長程序處理的白色脂肪,HE染色脂肪組織結構完整無裂縫,脂肪細胞形態(tài)飽滿,細胞膜無明顯斷裂,免疫組化陽性結果明顯,背景清晰,結果明顯優(yōu)于常規(guī)程序。相對于白色脂肪,棕色脂肪細胞內脂滴小而少,且細胞表面遍布神經及血管[9],對細胞起到了良好的支撐作用。所以,按照常規(guī)組織的脫水流程就可以完成脫水、脫脂。實驗結果顯示,無論是常規(guī)組織流程還是延長流程制作的石蠟切片,HE染色均可見棕色脂肪結構完整,細胞飽滿,周圍血管清晰,免疫組化陽性結果明顯,背景清晰。本實驗不足之處在于做油紅O染色的小鼠與HE染色及免疫組化的小鼠不是采自同一小鼠的標本,主要由于小鼠棕色脂肪組織標本較小,再切取一部分做冰凍會導致冰凍組織太小,影響制片及染色效果。

綜上所述,制作白色脂肪石蠟切片,應采用延長脫水程序,保證脫水、脫脂徹底;棕色脂肪,則按照常規(guī)組織制片程序制作石蠟切片,從而提高制片速度,提高科研效率。