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        不同免疫抗體水平下H9亞型AIV的排毒規(guī)律研究

        2020-03-24 11:48:38盛媛
        家禽科學 2020年12期

        盛媛

        摘? 要:本研究旨在研究不同免疫抗體水平下H9亞型AIV的排毒規(guī)律。選取SPF雞進行H9N2滅活疫苗免疫,根據(jù)HI效價將雞群分成高、中、低三組,攻毒后分析其排毒差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn):抗體水平為9.44 log2時,個別雞只仍會感染排毒,且抗體水平越低,感染排毒雞只數(shù)量越多;當抗體水平達到11 log2時,雞群不再排毒。

        關(guān)鍵詞:禽流感病毒;H9亞型;不同免疫抗體水平;排毒規(guī)律

        疫苗免疫是控制H9亞型AIV的有效措施[1]。但由于疫苗質(zhì)量、免疫程序、營養(yǎng)、機體本身等各種因素易造成免疫失敗,使AIV的發(fā)生呈現(xiàn)越來越多的非典型性,給診斷、預防帶來極大困難[2,3]。同時,隨著免疫壓力的增加,H9亞型流感病毒出現(xiàn)了新的特征,高抗體水平條件下仍然出現(xiàn)H9亞型禽流感病毒感染,雞胚接種試驗發(fā)現(xiàn)H9亞型野外分離毒株的致病力明顯增強[4,5]。因此,在對AIV流行株進行監(jiān)測的同時,有必要對不同抗體水平狀態(tài)下的雞群感染H9后的排毒規(guī)律進行研究,從而對H9亞型AIV的科學防控具有重要指導意義。

        1? 材料與方法

        1.1? 毒株? H9亞型AIV:本實驗室分離保存,命名為CJ1302。

        1.2? 試驗動物及主要試劑? SPF雞、10日齡SPF雞胚,由山東昊泰實驗動物繁育中心提供;10%的甘油PBS(含雙抗10000 U/mL);反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV),Promega公司產(chǎn)品;Trizol試劑,Invitrogen公司產(chǎn)品。

        1.3? 不同免疫抗體水平下H9亞型AIV的排毒規(guī)律研究? SPF雞7 d時免疫H9N2滅活疫苗,肌肉注射,0.6 mL/只,帶翅號;14 d時選取一部分雞只進行二次免疫,定期進行H9抗體效價測定,根據(jù)HI效價將雞群分成3組:HI效價為6~7 log2的確定為1組,即低抗體組(6.44 log2);HI效價為8~10log2的確定為2組,即中抗體組(9.44 log2);HI效價為11 log2的確定為3組,即高抗體組(11 log2),隔離器分開飼養(yǎng)。另設(shè)非免疫組作為對照組,每組9只。將H9亞型AIV毒株(CJ1302)作1:10稀釋,每只1.0 mL點眼滴鼻。攻毒后每隔24 h采集一次泄殖腔棉拭子,連續(xù)采集10 d,將采集的棉拭子放入裝有10%的甘油PBS(含雙抗10000 U/ml)的離心管中,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4? 病毒分離及RT-PCR方法檢測? 將采集的棉拭子高速離心,取上清,接種10日齡SPF雞胚,每管接種2枚,0.2 mL/枚,另設(shè)生理鹽水對照。37 ℃溫箱培養(yǎng),觀察4 d,記錄結(jié)果,收取活胚尿囊液進行血凝試驗, 同時進行常規(guī)RT-PCR方法復核檢測。

        1.5? 分離毒HA基因測序分析? 選取幾個代表組不同時間點的分離毒及攻毒用毒株,進行HA基因的擴增、克隆及測序,進一步分析攻毒后不同時間的排毒在序列上的差異。

        2? 結(jié)果

        2.1? 不同HI抗體水平狀態(tài)下H9亞型AIV的排毒情況分析? 將病毒分離和RT-PCR檢測均為陽性者判定為排毒,1組雞群從第2天開始排毒,持續(xù)至第5天,6~7 d時不再排毒,但第8天又出現(xiàn)排毒。2組雞群第2天時只有1只排毒,之后不再排毒,直到第9天時又出現(xiàn)雞只排毒。3組沒有排毒現(xiàn)象。詳細結(jié)果見表1。

        2.2? 部分分離毒HA基因測序分析? 為進一步分析上述排毒現(xiàn)象,選取2組感染H9亞型AIV 2 d(2組-2 d)和9 d(2組-9 d)以及對照組8 d(對照-8 d)泄殖腔棉拭子分離毒、攻毒用毒株,進行HA基因的擴增、克隆及測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),2組免疫雞群感染H9亞型AIV 2d和9d的分離毒兩者HA基因的氨基酸序列相似性為98.5%,兩者與攻毒株HA基因的氨基酸序列相似性分別為96.8%和97%(表2)。

        3? 討論與分析

        3.1? 在普遍使用H9N2亞型禽流感滅活疫苗的強大免疫壓力下,H9N2病毒變異加快,出現(xiàn)了多個基因亞型的H9N2亞型禽流感流行毒株,雖然H9N2 亞型AIV發(fā)生了一定變異,現(xiàn)有疫苗已不能提供完全保護,除考慮流行毒株外,應(yīng)制定合理的免疫程序,這就需要定期進行抗體監(jiān)測和評估,本試驗就是為探討不同抗體水平下H9的排毒情況,進而確定抗體水平與免疫保護之間的關(guān)系。

        3.2? 從表1和表2可以看出,抗體水平為6.44 log2的試驗雞排毒數(shù)量多、持續(xù)時間長,表明該抗體水平不能有效抵抗H9亞型AIV的攻擊。抗體水平達到11 log2時,雞群泄殖腔中未分離到病毒,表明雞群不再排毒??贵w水平為9.44 log2時,雞群攻毒后2 d時只有一只雞泄殖腔能分離到病毒,而9 d時又出現(xiàn)一只雞泄殖腔分離到病毒。為進一步確定攻毒后9 d時分離毒的來源,我們對這兩個時間點的病毒進行了HA基因測序分析,兩者氨基酸序列相似性高達98.5%,表明9 d排毒雞只可能又被同一雞群中排毒雞只感染所致。因此,實際生產(chǎn)過程中應(yīng)定期進行流行毒株的抗體監(jiān)測,盡量保證雞群處于高抗體水平,才能有效抵御疾病風險。

        參考文獻:

        [1]? 陳銀.耐熱新城疫病毒載體的構(gòu)建及其在H9N2亞型禽流感疫苗研制中的應(yīng)用[D].揚州:揚州大學,2019.

        [2]? 余文蘭,梁柏,劉郁夫,等.H9N2亞型AIV不同攻毒方式排毒規(guī)律的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2017(22):126-128.

        [3]? 李家凱,郭康康,劉麗娜,等.肉雞與蛋雞H5、H7、H9亞型禽流感病毒抗體水平調(diào)查[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2020,59(11):104-106.

        [4]? 張偉.1999年~2013年山東雞源H9N2亞型禽流感病毒遺傳演化和血凝素抗原性研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學,2015.

        [5]? 李悅.山東規(guī)模化雞場H9N2亞型禽流感流行病學調(diào)查及流行毒株分子生物學特征分析[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學,2020.

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