盛媛

摘? 要：本研究旨在研究不同免疫抗體水平下H9亞型AIV的排毒規(guī)律。選取SPF雞進行H9N2滅活疫苗免疫，根據(jù)HI效價將雞群分成高、中、低三組，攻毒后分析其排毒差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抗體水平為9.44 log2時，個別雞只仍會感染排毒，且抗體水平越低，感染排毒雞只數(shù)量越多;當抗體水平達到11 log2時，雞群不再排毒。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒;H9亞型;不同免疫抗體水平;排毒規(guī)律

疫苗免疫是控制H9亞型AIV的有效措施[1]。但由于疫苗質(zhì)量、免疫程序、營養(yǎng)、機體本身等各種因素易造成免疫失敗，使AIV的發(fā)生呈現(xiàn)越來越多的非典型性，給診斷、預防帶來極大困難[2，3]。同時，隨著免疫壓力的增加，H9亞型流感病毒出現(xiàn)了新的特征，高抗體水平條件下仍然出現(xiàn)H9亞型禽流感病毒感染，雞胚接種試驗發(fā)現(xiàn)H9亞型野外分離毒株的致病力明顯增強[4，5]。因此，在對AIV流行株進行監(jiān)測的同時，有必要對不同抗體水平狀態(tài)下的雞群感染H9后的排毒規(guī)律進行研究，從而對H9亞型AIV的科學防控具有重要指導意義。

1? 材料與方法

1.1? 毒株? H9亞型AIV：本實驗室分離保存，命名為CJ1302。

1.2? 試驗動物及主要試劑? SPF雞、10日齡SPF雞胚，由山東昊泰實驗動物繁育中心提供;10%的甘油PBS（含雙抗10000 U/mL）;反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV），Promega公司產(chǎn)品;Trizol試劑，Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.3? 不同免疫抗體水平下H9亞型AIV的排毒規(guī)律研究? SPF雞7 d時免疫H9N2滅活疫苗，肌肉注射，0.6 mL/只，帶翅號;14 d時選取一部分雞只進行二次免疫，定期進行H9抗體效價測定，根據(jù)HI效價將雞群分成3組：HI效價為6～7 log2的確定為1組，即低抗體組（6.44 log2）;HI效價為8～10log2的確定為2組，即中抗體組（9.44 log2）;HI效價為11 log2的確定為3組，即高抗體組（11 log2），隔離器分開飼養(yǎng)。另設(shè)非免疫組作為對照組，每組9只。將H9亞型AIV毒株（CJ1302）作1：10稀釋，每只1.0 mL點眼滴鼻。攻毒后每隔24 h采集一次泄殖腔棉拭子，連續(xù)采集10 d，將采集的棉拭子放入裝有10%的甘油PBS（含雙抗10000 U/ml）的離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4? 病毒分離及RT-PCR方法檢測? 將采集的棉拭子高速離心，取上清，接種10日齡SPF雞胚，每管接種2枚，0.2 mL/枚，另設(shè)生理鹽水對照。37 ℃溫箱培養(yǎng)，觀察4 d，記錄結(jié)果，收取活胚尿囊液進行血凝試驗， 同時進行常規(guī)RT-PCR方法復核檢測。

1.5? 分離毒HA基因測序分析? 選取幾個代表組不同時間點的分離毒及攻毒用毒株，進行HA基因的擴增、克隆及測序，進一步分析攻毒后不同時間的排毒在序列上的差異。

2? 結(jié)果

2.1? 不同HI抗體水平狀態(tài)下H9亞型AIV的排毒情況分析? 將病毒分離和RT-PCR檢測均為陽性者判定為排毒，1組雞群從第2天開始排毒，持續(xù)至第5天，6～7 d時不再排毒，但第8天又出現(xiàn)排毒。2組雞群第2天時只有1只排毒，之后不再排毒，直到第9天時又出現(xiàn)雞只排毒。3組沒有排毒現(xiàn)象。詳細結(jié)果見表1。

2.2? 部分分離毒HA基因測序分析? 為進一步分析上述排毒現(xiàn)象，選取2組感染H9亞型AIV 2 d（2組-2 d）和9 d（2組-9 d）以及對照組8 d（對照-8 d）泄殖腔棉拭子分離毒、攻毒用毒株，進行HA基因的擴增、克隆及測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組免疫雞群感染H9亞型AIV 2d和9d的分離毒兩者HA基因的氨基酸序列相似性為98.5%，兩者與攻毒株HA基因的氨基酸序列相似性分別為96.8%和97%（表2）。

3? 討論與分析

3.1? 在普遍使用H9N2亞型禽流感滅活疫苗的強大免疫壓力下，H9N2病毒變異加快，出現(xiàn)了多個基因亞型的H9N2亞型禽流感流行毒株，雖然H9N2 亞型AIV發(fā)生了一定變異，現(xiàn)有疫苗已不能提供完全保護，除考慮流行毒株外，應(yīng)制定合理的免疫程序，這就需要定期進行抗體監(jiān)測和評估，本試驗就是為探討不同抗體水平下H9的排毒情況，進而確定抗體水平與免疫保護之間的關(guān)系。

3.2? 從表1和表2可以看出，抗體水平為6.44 log2的試驗雞排毒數(shù)量多、持續(xù)時間長，表明該抗體水平不能有效抵抗H9亞型AIV的攻擊。抗體水平達到11 log2時，雞群泄殖腔中未分離到病毒，表明雞群不再排毒?？贵w水平為9.44 log2時，雞群攻毒后2 d時只有一只雞泄殖腔能分離到病毒，而9 d時又出現(xiàn)一只雞泄殖腔分離到病毒。為進一步確定攻毒后9 d時分離毒的來源，我們對這兩個時間點的病毒進行了HA基因測序分析，兩者氨基酸序列相似性高達98.5%，表明9 d排毒雞只可能又被同一雞群中排毒雞只感染所致。因此，實際生產(chǎn)過程中應(yīng)定期進行流行毒株的抗體監(jiān)測，盡量保證雞群處于高抗體水平，才能有效抵御疾病風險。

參考文獻：

[1]? 陳銀.耐熱新城疫病毒載體的構(gòu)建及其在H9N2亞型禽流感疫苗研制中的應(yīng)用[D].揚州：揚州大學，2019.

[2]? 余文蘭，梁柏，劉郁夫，等.H9N2亞型AIV不同攻毒方式排毒規(guī)律的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（22）：126-128.

[3]? 李家凱，郭康康，劉麗娜，等.肉雞與蛋雞H5、H7、H9亞型禽流感病毒抗體水平調(diào)查[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2020，59（11）：104-106.

[4]? 張偉.1999年～2013年山東雞源H9N2亞型禽流感病毒遺傳演化和血凝素抗原性研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2015.

[5]? 李悅.山東規(guī)模化雞場H9N2亞型禽流感流行病學調(diào)查及流行毒株分子生物學特征分析[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2020.