汪慧，張?zhí)斐?，凌薇，陳盛霞，姜旭?江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

人可溶性生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2(soluble growth stimulating expression gene 2，sST2)定位于2號(hào)染色體2q11.2，sST2蛋白含有 328個(gè)氨基酸，具有3個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及9個(gè)糖基化位點(diǎn)[1-2]，可在心臟、肺、腎和小腸等部位以及淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞及多種內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生[3-4]。一些學(xué)者研究人sST2蛋白的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及其臨床應(yīng)用價(jià)值，發(fā)現(xiàn)人sST2蛋白的檢測(cè)對(duì)于臨床診斷心力衰竭、風(fēng)濕免疫病以及過(guò)敏性疾病等具有重要價(jià)值[5-6]。2017年，美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)基金會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(American College of Cardiology Foundation/American Heart Association，ACCF/AHA)確定將sST2蛋白加入到慢性心力衰竭急性期和急性加重期危險(xiǎn)分層指南中[7]。目前國(guó)內(nèi)可用于臨床的人sST2蛋白檢測(cè)試劑盒均采用免疫學(xué)方法，且多為進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格昂貴，限制了其在臨床疾病診斷與治療中的應(yīng)用與發(fā)展。因此，需要獲得高純度的人sST2蛋白抗原，為建立更多免疫學(xué)檢測(cè)方法提供基礎(chǔ)。本研究旨在構(gòu)建人sST2重組真核表達(dá)載體，獲得高純度的人sST2重組蛋白，為研究人sST2蛋白檢測(cè)方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 PGH-T質(zhì)粒、大腸埃希菌DH5α均由本實(shí)驗(yàn)室保存；HUVEC細(xì)胞由ATCC細(xì)胞庫(kù)提供；pcDNA3.1-his(-)質(zhì)粒、COS7細(xì)胞由豐暉生物公司提供。

1.1.2主要試劑和儀器 ECM細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)ScienCell公司)；Trizol、Lipo2000(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；抗HIS標(biāo)簽抗體(南京諾唯贊公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Tag Mater Mix PCR預(yù)混液(日本TaKaRa公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)；人sST2檢測(cè)ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物公司)；PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；酶聯(lián)儀、FCQ凝膠成像儀及垂直電泳儀(美國(guó)BioRad公司)。

1.2方法

1.2.1人sST2cDNA的獲取 按照Aoki等[8]的方法用ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞。用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到人sST2基因cDNA。

1.2.2人sST2基因的獲取 根據(jù)NCBI的人sST2基因全長(zhǎng)序列(GenBank: D12763.1)[3]，用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)得到用于擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 002 bp的人sST2基因的上游引物(F)：GGCGGAT

CCTCTTGATTGATAAACAGAATG，下劃線為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，下游引物(R)：GGCAAGCTTGAAACACT

CCTTACTTGGATT，下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn)。引物由上海亦欣生物公司合成。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，29個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，再用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，得到人sST2基因。

1.2.3人sST2-pcDNA3.1-his(-)重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將人sST2與PGH-T質(zhì)粒連接構(gòu)成重組克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，經(jīng)過(guò)氨芐抗生素篩選，獲得陽(yáng)性克隆后，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒并送上海生工生物公司測(cè)序。用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切經(jīng)測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒以及pcDNA3.1-his(-)質(zhì)粒。采用T4連接酶使人sST2和pcDNA3.1-his(-)質(zhì)粒連接，得到重組真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，氨芐抗生素篩選后，獲得陽(yáng)性克隆，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取人sST2-pcDNA3.1-his(-)重組真核表達(dá)載體。用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切重組真核表達(dá)載體，酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4人sST2蛋白的表達(dá)與純化 采用Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，6 h后用DMEM高糖完全培養(yǎng)基換液，24 h后開始收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。采用鎳柱親和分析法將細(xì)胞培養(yǎng)上清液過(guò)柱純化，得到純化的人sST2蛋白。采用透析袋蔗糖濃縮法，得到濃縮的人sST2蛋白，分裝入1.5 mL EP管中，-20 ℃保存。

1.2.5人sST2蛋白的鑒定 用考馬斯亮藍(lán)染色法鑒定人sST2蛋白的位置大小與純度。用western blot法鑒定人sST2蛋白是否含有His標(biāo)簽。用人sST2檢測(cè)ELISA試劑盒檢測(cè)純化的人sST2蛋白是否具有與抗人sST2抗體特異性結(jié)合的抗原表位。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR法擴(kuò)增人sST2基因 逆轉(zhuǎn)錄法得到基因組cDNA后，利用特異性PCR引物，擴(kuò)增人sST2目的基因，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在約1 000 bp處出現(xiàn)目的條帶(見圖1)，與理論P(yáng)CR產(chǎn)物大小(1 002 bp)一致。

注：M,DL 2 000 DNA marker;1～3,人sST2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2人sST2-PGH-T重組載體鑒定 人sST2-PGH-T重組載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)后，經(jīng)菌落PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。同源比對(duì)分析結(jié)果顯示人sST2成功插入T載體(只出現(xiàn)1個(gè)堿基突變)(見圖2)。

注：Query為人sST2目的基因序列，Sbjct為測(cè)序所得基因序列(1個(gè)基因突變)

圖2人sST2-PGH-T載體同源性比對(duì)分析

2.3人sST2-pcDNA3.1-his(-)重組真核表達(dá)載體鑒定 用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切人sST2-PGH-T重組載體和pcDNA3.1-his(-)質(zhì)粒后瓊脂糖凝膠電泳顯示產(chǎn)物電泳位置與預(yù)期一致(見圖3)，目的片段膠回收后T4酶連接獲得人sST2-pcDNA3.1-his(-)重組真核表達(dá)載體并再次BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示產(chǎn)物電泳位置與預(yù)期一致(見圖4)。

注：DL 2 000 DNA marker; 1、2，pcDNA3.1-his(-)質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；3、4，人sST2-PGH-T載體雙酶切產(chǎn)物。

圖3pcDNA3.1-his(-)質(zhì)粒及人sST2-PGH-T載體雙酶切產(chǎn)物鑒定

注：M,DL 2 000 DNA marker;1、2，重組表達(dá)載體雙酶切產(chǎn)物。

2.4人sST2蛋白表達(dá)與純化 將人sST2-pcDNA3.1-his(-)重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)染試劑的用量及轉(zhuǎn)染時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，用RT-PCR法分析轉(zhuǎn)染效率(見圖5)?？捡R斯亮藍(lán)染色法鑒定純化人sST2蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約在65 000(見圖6)。

注：M,DL 2 000 DNA marker;1，陰性對(duì)照(加入重組表達(dá)載體但未添加轉(zhuǎn)染試劑)；2～5(轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后的RT-PCR)，轉(zhuǎn)染試劑依次為1、1.5、2、2.5 μL Lipo2000/孔；6～9(轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后的RT-PCR)，轉(zhuǎn)染試劑依次為1、1.5、2、2.5 μL Lipo2000/孔。

圖5人sST2-pcDNA3.1-his(-)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后RT-PCR凝膠電泳分析

注：M,蛋白質(zhì)marker;1,未純化的細(xì)胞培養(yǎng)上清液；2～6，純化后的人sST2重組蛋白。

圖6SDS-PAGE電泳鑒定人sST2重組蛋白純度

2.5人sST2蛋白鑒定 western blot法顯示人sST2蛋白有可與抗His標(biāo)簽抗體發(fā)生特異性結(jié)合的His標(biāo)簽(見圖7)。ELISA試劑盒顯示人sST2蛋白有可與抗人sST2蛋白抗體發(fā)生特異性結(jié)合的抗原表位(見圖8)。

注：1，未純化的人sST2重組蛋白；2、3；鎳柱親和層析純化的人sST2重組蛋白。

圖7western blot法鑒定人sST2重組蛋白

注：1,陽(yáng)性對(duì)照；2，空白對(duì)照；3～5，人sST2重組蛋白。

圖8ELISA試劑盒鑒定人sST2重組蛋白

3 討論

人sST2蛋白與IL-33結(jié)合，抑制Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，使心肌纖維化及心肌肥厚加重，最終發(fā)生心力衰竭[9]。Yucel等[10]研究顯示心力衰竭患者血清sST2蛋白水平明顯升高。2014年中國(guó)心力衰竭指南推薦認(rèn)為sST2蛋白等指標(biāo)在急性或慢性心力衰竭的危險(xiǎn)分層中可能提供額外信息[11]。對(duì)于SLE[12]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[13]以及過(guò)敏性哮喘[14]等免疫調(diào)節(jié)異常所致疾病患者，血清sST2蛋白水平也較健康人對(duì)照組明顯升高。這些研究結(jié)果說(shuō)明了在臨床開展血清人sST2蛋白檢測(cè)的重要性和必要性。

本研究通過(guò)富含生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞專用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基ECM培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，成功通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增得到人sST2目的基因片段。Yoshida等[15]研究發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)的sST2蛋白，其免疫產(chǎn)生的抗sST2抗體可能因?yàn)槿狈D(zhuǎn)錄及翻譯后的加工機(jī)制而不適用于臨床檢測(cè)。本研究所用的pcDNA3.1-his(-)質(zhì)粒優(yōu)勢(shì)考慮以下兩點(diǎn)：(1)作為真核表達(dá)載體，其基因高效表達(dá)的同時(shí)，真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系，其表達(dá)的外源蛋白更接近天然蛋白。(2)在其氨基末端設(shè)計(jì)加有6個(gè)His標(biāo)簽，通過(guò)該標(biāo)簽與鎳柱顆粒的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)親和層析法純化目的蛋白，同時(shí)，由于His標(biāo)簽相對(duì)分子量小，免疫原性相對(duì)較低，一般不影響目的蛋白的功能，實(shí)驗(yàn)后期無(wú)需切除標(biāo)簽，也利于直接免疫動(dòng)物制備抗體。故本實(shí)驗(yàn)采用真核表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了人sST2-pcDNA3.1-his(-)重組真核表達(dá)載體，又利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在COS7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)產(chǎn)生大量人sST2蛋白。

目前臨床上血清人sST2蛋白的定量檢測(cè)ELISA試劑盒來(lái)源渠道較少，國(guó)內(nèi)外少見關(guān)于研究制備可靠的人sST2蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及其檢測(cè)抗體甚至檢測(cè)試劑盒方法的報(bào)道。本研究成功獲得具有免疫學(xué)活性的人sST2重組蛋白，為后續(xù)動(dòng)物免疫制備人sST2蛋白單克隆抗體及開發(fā)可靠的人sST2蛋白檢測(cè)試劑盒提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。